La sclérose en plaques est une maladie inflammatoire du système nerveux central qui touche beaucoup de jeunes adultes dans le monde entier. Malgré les efforts de recherche, la cause demeure inconnue. Afin de développer de meilleurs traitements et de trouver un remède, les modèles animaux sont utilisés pour identifier des biomarqueurs cellulaires. La caractérisation de ces modèles est essentielle afin de bien transposer les résultats à la maladie humaine et de tester de nouveaux médicaments. Cette thèse est le résultat d'un projet de maîtrise au Centre de recherche de l'Institut universitaire en santé mentale de Québec (CRIUSMQ) qui visait à étudier la barrière hématoencéphalique en tant que biomarqueur possible chez un modèle animal de la sclérose en plaques. Le chapitre 1 présente les différents thèmes abordés dans ce projet. Les chapitres 2, 3 et 4 se concentrent sur les méthodes choisies, tandis que le chapitre 5 présente les résultats obtenus. / Multiple sclerosis is an inflammatory disease of the central nervous system that affects many young adults worldwide. Despite research efforts, the cause of the disease remains unknown. In order to develop better therapies and ultimately find a cure, animal models are used to identify cellular biomarkers. Characterizing these models is essential in order to properly relate findings to the human disease and test possible medications. This thesis is the result of a three-year Master's project at Centre de recherche de l'Institut universitaire en santé mentale de Québec (CRIUSMQ) that aimed to study the blood-brain barrier as a possible biomarker of disease pathology in a multiple sclerosis animal model. Chapter 1 introduces the different themes addressed in this project. Chapters 2, 3 and 4 focus on the materials and methods chosen, while chapter 5 presents the results obtained. These findings are discussed in chapter 6.

La sclérose en plaques (SEP) est largement acceptée comme étant une maladie auto-immune du système nerveux central (SNC) dirigée par les cellules T auto-réactives. Cette maladie est très répandue au Canada. L'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est le modèle animal le plus utilisé pour l’étude de la SEP. Malgré l’importance des cellules T dans cette pathologie, il est important de souligner que ce sont les cellules présentatrices d'antigènes (CPA) myéloïdes, et surtout les cellules dendritiques (CD), qui amorcent l’activation des cellules T auto-réactives dans les organes lymphoïdes secondaires ainsi que leur éventuelle réactivation dans le compartiment du SNC plus tard au cours de la maladie. Cependant, il existe une disparité dans l'identification des différentes sous-populations de CPA myéloïdes en raison de l'absence de marqueurs fiables et spécifiques, ce qui constitue une entrave dans le domaine de l'immunothérapie cellulaire. Par ailleurs, les mécanismes moléculaires responsables de la régulation du recrutement des CPA myéloïdes au niveau de la vasculature cérébrale suite à l'activation de l'endothélium du SNC sont encore mal connus. L'interleukine-6 (IL-6) est une cytokine pro-inflammatoire essentielle à la différenciation des lymphocytes TH17 auto-réactifs. Ces derniers sont des régulateurs clés de l'EAE et jouent un rôle important dans la SEP. Ainsi, le premier objectif de ma thèse était de démontrer que l'IL-6 joue un second rôle dans l'EAE en stimulant l'endothélium du SNC à exprimer les molécules nécessaires au recrutement des CPA myéloïdes. Nous démontrons que : (1) les cellules endothéliales du SNC expriment le récepteur de l’IL-6 (IL-6R) ; (2) l’ablation génétique de l’IL-6R spécifiquement dans l'endothélium atténue le recrutement des neutrophiles, des macrophages et des CDs, et prévient le développement de l'EAE ; et (3) l'IL-6 stimule les cellules endothéliales à produire CXCL1 et PTGS2, des protéines impliquées dans le recrutement et l'activation des cellules myéloïdes. Le deuxième objectif général de mon étude était d'obtenir une vue d'ensemble phénotypique et fonctionnelle des sous-populations de CD présentes pendant la phase initiale d'induction de l'EAE. À cette fin, nous avons utilisé la technologie de séquençage de l'ARN unicellulaire (scRNAseq) pour comparer la signature transcriptionnelle des cellules CD11c+ issues des nœuds lymphatiques au cours de la phase préclinique de l'EAE. Nous montrons que : (1) quatre grandes sous-populations de CD sont présentes, soit les CD115+ monocytaires (mDC), les SiglecH+ plasmacytoïdes (pDC), les XCR1+ conventionnelles de type 1 (cDC1) et les CCR7+ conventionnelles de type 2 (cDC2) ; (2) les cDC2, une sous-population spécifique de CPA, présentent des niveaux transcriptonnels élevés de cytokines pro-inflammatoires (IL-6, IL-12) et de marqueurs de maturation et de co-stimulation pour la présentation des antigènes (CD80, CD83, CD86, OX40L) ; (3) miR155, un microARN connu pour son rôle dans l'EAE, est principalement exprimé dans les cDC2 ; et (4) que l'enzyme D-aminoacide oxydase (Dao), qui produit du peroxyde d'hydrogène (H2O2) à partir d’acides aminés D, est régulée à la hausse dans les cDC2 des souris miR155-/- . En résumé, mon travail de thèse met l'accent sur le rôle critique des CPA myéloïdes lors des premiers événements précliniques de l'EAE et il suggère un nouveau rôle important de la signalisation classique de l'IL-6 dans le développement de l'EAE et le recrutement des leucocytes. Finalement, il identifie en outre des cibles et des biomarqueurs potentiels à des fins diagnostiques et thérapeutiques. / Multiple sclerosis (MS) is widely accepted as an autoreactive T cells driven autoimmune disorder of the central nervous system (CNS), highly prevalent in Canada. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the established animal model for studying MS. Antigen-presenting cells (APCs) of myeloid origin, most importantly, dendritic cells initiate the priming of autoreactive T cells in the secondary lymphoid organs, and their eventual reactivation in the CNS compartment later in the disease course. However, a disparity exists in identifying myeloid APCs subsets with accuracy due to absence of reliable and specific markers, causing a hindrance in the field of cellbased immunotherapy. In addition, more needs to be deciphered on the molecular mechanisms that regulate activation of CNS endothelium for recruitment of myeloid APCs. Interleukin-6 (IL-6) is a pro-inflammatory cytokine, essential for differentiation of self-reactive TH17 lymphocytes, which are key regulators of EAE and play an important role in MS. The first objective of my thesis was to demonstrate that IL-6 plays another role in EAE by stimulating the CNS endothelium to express molecules required for the recruitment of myeloid antigen-presenting cells. We show that: (1) endothelial cells in the CNS express IL-6 receptor (IL-6R); (2) genetic deletion of IL-6R specifically in the endothelium blocks neutrophils, macrophages and dendritic cells recruitment as well as EAE development; (3) ICAM1-expressing extravascular myeloid APCs are reduced in number during the pre-onset stage of EAE; and (4) IL-6 stimulates endothelial cells to produce CXCL1 and PTGS2, which are involved in recruitment and activation of myeloid cells. The second general objective of my study was to get a phenotypic and functional overview of DC subsets present during the initial induction phase of EAE. For that purpose, we used the single-cell RNA sequencing (scRNAseq) technology to compare the transcriptional signature of CD11c+ cells from lymph nodes during the pre-clinical phase of EAE. We show that: (1) four major subsets of DCs are present: CD115+ monocytic DC (mDC), SiglecH+ plasmacytoid DC (pDC), XCR1+ conventional DCs type-1 (cDC1) and CCR7+ conventional DCs type-2 (cDC2); (2) cDC2 exhibit elevated expression of pro-inflammatory cytokines (IL-6, IL-12), maturation marker (CD83) and costimulatory molecules for antigen presentation (CD80, CD86, OX40L); (3) miR155, a microRNA known to have a role in EAE, is predominantly expressed in cDC2; (4) the enzyme D-amino acid oxidase (Dao), that produces hydrogen peroxide (H2O2) from D-amino acids, is upregulated in cDC2 of miR155-/- mice. In summary, my thesis work emphasizes on the critical role of myeloid APCs during initial pre-clinical events of EAE. Moreover, it suggests additional important role of classical IL-6 signaling in EAE development and leukocyte recruitment. It further identifies potential targets and biomarkers for diagnostics and therapeutic purposes.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2013-2014. / La rupture de la barrière hémoencéphalique (BHE) ainsi que l’infiltration cellulaire sont des évènements pathophysiologiques caractéristiques de la sclérose en plaques et de son modèle animal, l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale (EAE). Cependant, leur relation avec l’évolution de l’EAE est obscure, notamment car les préparations histologiques standards recquièrent le sacrifice des animaux et nous privent d’informations cruciales quant à l’initiation, au développement et à la progression de la maladie. Nous utilisons le modèle EAE chez la lignée de souris lys-GFP ki, chez laquelle les cellules myéloïdes (i.e. neutrophiles et monocytes) expriment eGFP. De l’imagerie intravitale est effectuée à des moments précis, ce qui permet l’étude de l’infiltration cellulaire en plus de l’évaluation de l’intégrité de la barrière hémo-encéphalique (BHE) au cours de la pathologie. Les séances d’imagerie non-terminales offrent un contexte temporel considérable, puisqu’il est possible de suivre le développement de la maladie chez un animal qui a été précédemment imagé. La première étape a donc consisté à établir que la chirurgie et la séance d’imagerie n’avaient aucune influence sur le développement de l’EAE chez les animaux expérimentaux. Les résultats obtenus à l’aide d’imagerie intravitale tendent à démontrer qu’un affaiblissement de la BHE envers les molécules de petite taille (760 Da) est corrélé à l’infiltration de cellules GFP-positive dans la moelle épinière. Il est d’autant plus intéressant de constater que cette invasion cellulaire arrive en même temps que l’apparition des symptômes cliniques chez les animaux atteints d’EAE. Nous avançons l’hypothèse que les neutrophiles sont les cellules myéloïdes responsables de brèches initiales dans la BHE, qui influençent son intégrité aux stades précoces de la maladie. Des expériences de déplétion envers les neutrophiles ont donc été effectuées chez des animaux EAE afin de confirmer notre hypothèse. Les résultats suggèrent que les neutrophiles influencent l’initiation de la maladie et sa sévérité totale, en plus d’être intimement liés à l’état de la BHE tôt dans la pathologie. / Blood-spinal cord barrier (BSCB) disruption and immune cell infiltration are early pathophysiological hallmarks of multiple sclerosis (MS) and its animal model, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Their relationship with the course of EAE remains unclear, however, notably because histological tissue preparations involve sacrifice and inherently result in the loss of crucial information regarding the initiation or development and progression of the disease. We use the EAE model in the lys-GFP ki mouse strain, in which blood-borne myeloid cells (i.e. neutrophils and monocytes) express eGFP. Intravital two-photon microscopy is performed at selected time points, enabling the investigation of cellular infiltration together with the assessment of the blood- barrier (BBB) integrity over the course of the pathology. Non-terminal imaging sessions offer extensive temporal context as it is possible to follow the development of the disease in an animal which has been previously imaged. One can appreciate the advantage of such a method as it is possible to relate, in the same animal, previous observations with clinical outcome. The first step thus consisted in establishing that the surgery and imaging session did not affect the development of EAE in experimental animals. Results obtained demonstrate that the permeability of the BBB to small molecular tracers (760 Da) correlates with the infiltration of GFP-positive myeloid cells into the spinal cord parenchyma. Interestingly, this cellular invasion is reminiscent of the appearance of clinical symptoms displayed by EAE animals. We put forward the hypothesis that neutrophils are the myeloid cells responsible for initial breaches in the BBB, influencing the latter’s integrity at early stages of the disease. Neutrophil depletion experiments have thus been performed in EAE mice in order to confirm this hypothesis. Results suggest that neutrophils influence the initiation and total severity of the disease, as well as being intimately linked to the status of the BBB early in the pathology.

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune du système nerveux central (SNC) qui a une incidence plus élevée chez les femmes mais des résultats de maladie plus sévères chez les hommes. De plus, les cellules Th17 ont été identifiées comme des acteurs clés de l'auto-immunité du SNC. Par conséquent, dans cette thèse, nous avons étudié la dichotomie sexuelle dans la SEP en formulant l'hypothèse que les traits biologiques du sexe influencent la pathogénicité des cellules Th17, conduisant à des résultats de maladie divergents dans la SEP. En nous appuyant sur nos découvertes précédentes, où nous avons démontré que les cellules Th17 des souris 1C6 (qui possèdent un transgène TCR contre l'antigène de la myéline MOG [35-55]) induisent une SEP secondairement progressive (SPMS) chez les souris NOD.Scid dans un modèle de maladie chronique, nous avons observé qu'une proportion plus élevée de cellules Th17 mâles induisent une maladie plus sévère chez les receveurs comparativement aux cellules Th17 femelles (Doss et al. 2021). Pour évaluer le rôle des hormones sexuelles et des chromosomes sexuels sur les résultats divergents de pathogénicité des cellules Th17 dans ce modèle murin, nous avons utilisé le modèle de souris à quatre génotypes de base et l'avons croisé avec des souches de souris 1C6. Nos résultats révèlent des influences opposées des hormones sexuelles et des chromosomes sexuels sur la pathogénicité des cellules Th17. Plus précisément, la signalisation de la voie Wnt médiée par les androgènes a été trouvée pour réduire la pathogénicité des cellules Th17 mâles, tandis que le gène lié à l'X Suv39H1 a réduit la pathogénicité des cellules Th17 XX. De manière intéressante, nous avons découvert des différences de pathogénicité frappantes dans les cellules Th17 dérivées de souris génétiquement identiques avec des pères ayant des arrière-plans génétiques différents. Cela a conduit à l'identification de RunX2 comme un gène critique pour réduire la pathogénicité des cellules Th17 et a mis en évidence les effets possibles d'empreinte différentielle des pères transgéniques. Ensemble, notre thèse identifie les rôles multiformes des traits biologiques du sexe dans l'affectation de la pathogénicité des cellules Th17 dans le SNC. Ces résultats soulignent l'importance d'évaluer séparément les rôles des hormones sexuelles et des chromosomes sexuels dans la médiation des effets du sexe biologique sur les maladies auto-immunes. De plus, RunX2 et Suv39H1 peuvent être considérés comme des cibles médicamenteuses potentielles pour la SPMS, nécessitant une investigation plus approfondie. / : Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) that has a higher incidence in females but more severe disease outcomes in males. Additionally, Th17 cells have been identified as key players in CNS autoimmunity. Therefore, in this thesis, we investigated the sex dichotomy in MS by hypothesizing that biological sex traits influence the pathogenicity of Th17 cells, leading to divergent disease outcomes in MS. Building on our previous findings, where we demonstrated that Th17 cells from 1C6 mice (which have a TCR transgene against the myelin antigen MOG [35-55]) induce secondary progressive MS (SPMS) in NOD.*Scid* mice in a chronic disease model, we observed that a greater proportion of male Th17 cells induce more severe disease in recipients compared to female Th17 cells (Doss et al. 2021). To evaluate the role of sex hormones and sex chromosomes on the divergent pathogenicity outcomes of Th17 cells in this mouse model, we used the four-core genotype mouse model and crossed it with 1C6 mice strains. Our findings reveal opposing influences of sex hormones and sex chromosomes on the pathogenicity of Th17 cells. Specifically, androgen-mediated Wnt pathway signaling was found to reduce the pathogenicity of male Th17 cells, while the X-linked gene Suv39H1 reduced the pathogenicity of XX Th17 cells. Interestingly, we discovered striking pathogenicity differences in Th17 cells derived from genetically identical mice with sires having different genetic backgrounds. This led to the identification of RunX2 as a critical gene in reducing the pathogenicity of Th17 cells and highlighted the possible differential imprinting effects of the transgenic sires. Together, our thesis identifies the multilayered roles of biological sex traits in affecting the pathogenicity of Th17 cells in the CNS. These findings underscore the importance of separately evaluating the roles of sex hormones and sex chromosomes in mediating the effects of biological sex on autoimmune diseases. Additionally, RunX2 and Suv39H1 may be considered putative druggable targets for SPMS, warranting further investigation.