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Le cœur des vertébrés se développe à partir du tube cardiaque et de la participation des cellules progénitrices mésodermiques du second champ cardiaque (SHF). Une perturbation de l’addition des cellules du SHF conduit à des malformations cardiaques congénitales (MCC). Chez l’embryon, l’outflow tract (OFT) dérivé du seul SHF est formé par deux domaines complémentaires qui formeront le myocarde sous-aortique et sous-pulmonaire. Ce travail analyse les cellules progénitrices du SHF qui contribuent aux deux domaines de l’OFT pour former la base de l’aorte et du tronc pulmonaire, l’identité transcriptionnelle des domaines et leur régulation. Nous avons mis en évidence une sous-population de cellules progénitrices Notch-dépendantes, situées en région antérieure du mésoderme pharyngé, qui contribue au myocarde sous-aortique. Nous avons démontré que des cascades de régulation croisées impliquant Notch/Hes1 et Tbx1/Pparg sont importantes pour former les deux domaines fonctionnels régionalisés de l’OFT. Des expériences de culture d’explants et d’embryons ont démontré que Pparg est nécessaire au déploiement des cellules du SHF et pour la régulation transcriptionnelle du futur myocarde sous-pulmonaire. Dans le domaine complémentaire, futur myocarde sous-aortique, nous avons observé l’expression de Dlk1, un régulateur négatif de Pparg. Dlk1 est en amont de la voie de régulation Notch et participe probablement à l’identité régionale de l’OFT. Dans son ensemble, ce travail identifie de nouvelles voies de signalisation et gènes qui régulent l'identité régionale du mésoderme cardio-pharyngé et de nouvelles cibles pour l’étude clinique des MCC. / The vertebrate heart develops from the heart tube and the contribution of mesodermal progenitors termed second heart field (SHF). Perturbation in SHF addition leads to congenital heart defects (CHD). The outflow tract (OFT) myocardium is entirely derived from the SHF. Distinct regions of the embryonic OFT have been shown to give rise to subaortic and subpulmonary myocardium of the heart. The work described here focuses on SHF progenitor subpopulations in mouse giving rise to distinct OFT domains and characterizes the regional transcriptional identity and regulation of future subaortic and subpulmonary myocardium. We identified Notch-dependent subaortic myocardial SHF progenitors in anterior pharyngeal mesoderm. We demonstrated that Notch/Hes1 and Tbx1/Pparg cross regulatory cascades are important to establish functionally important OFT regional domains. Explant and embryo culture experiments revealed that Pparg is required for both the deployment of SHF cells and transcriptional regulation of the future subpulmonary myocardial domain. We also found that Dlk1, a negative regulator of Pparg, is expressed in the complementary subaortic domain upstream of Notch receptor activation and potentially participates in the establishment of OFT regional identity. We also report an overlapping transcriptional profile between future subaortic myocardium and subpopulation of epicardial cells at fetal stages. Finally, we provide evidence for the existence of conserved bipotential myogenic progenitors in cardiopharyngeal mesoderm coexpressing Nkx2-5 and Tbx1. Overall this work identifies novel pathways and genes in cardiopharyngeal mesoderm that may contribute to clinically relevant CHD.

Les gènes Hox sont essentiels à la mise en place de l’identité des cellules le long de l’axe antéropostérieur des embryons et pourraient agir en aval de l’acide rétinoïque pendant la formation du cœur. Nous montrons que les gènes Hoxb1, Hoxa1 et Hoxa3 définissent des sous-domaines du second champ cardiaque. L’analyse de lignage génétique révèle que les progéniteurs cardiaques Hoxb1+ contribuent aux oreillettes et à la partie inférieure de la voie efférente, futur myocarde sous-pulmonaire. Les progéniteurs Hoxa1+ contribuent à la partie distale de la voie efférente, suggérant un rôle de ces gènes Hox antérieurs dans sa régionalisation proximo-distale. Alors qu’aucune anomalie cardiaque n’avait été décrite chez les mutants Hoxb1, notre étude détaillée des fœtus Hoxb1-/- révèle des défauts d’alignement des gros vaisseaux ainsi que des communications interventriculaires. L’utilisation d’un marqueur du myocarde sous-pulmonaire, montre une contribution anormale des cellules du second champ cardiaque à cette région chez les mutants. Nous montrons que ces défauts sont la conséquence de la dérégulation des voies de signalisation présentes dans le second champ cardiaque. En accord avec ces observations, les embryons ont une voie efférente plus courte. L’étude des mutants Hoxa1 révèle des malformations des arcs pharyngés puis des anomalies de la crosse aortique chez les fœtus. L’analyse des doubles mutants, montre une augmentation de la pénétrance et de la sévérité de ces défauts, suggérant une interaction synergique entre Hoxa1 et Hoxb1 lors de la formation des gros vaisseaux. Ces résultats révèlent un rôle crucial des gènes Hox antérieurs dans le développement du cœur. / Hox genes are known to be involved in the establishment of cell position and identity along the anterior-posterior axis in embryos and could act as key downstream effectors of retinoic acid during heart development. In situ hybridization experiments show that Hoxb1, Hoxa1 and Hoxa3 define sub-domains within the second heart field (SHF). Our genetic lineage analysis reveals the contribution of Hoxb1+ cardiac progenitors to the atria and to the inferior wall of the outflow tract (OFT), which then gives rise to the myocardium at the base of the pulmonary trunk. Interestingly, Hoxa1+ progenitors contribute to the distal part of the OFT suggesting that these anterior Hox genes could play a role in its proximo-distal patterning. No cardiac anomalies had been reported so far in Hoxb1 mutant mice. However, our detailed study shows that mutant fetuses exhibit OFT misalignment and ventricular septal defects associated or not with ventricular wall and epicardium anomalies. Using a marker of the sub-pulmonary myocardium, we observe an abnormal contribution of SHF cells in Hoxb1-/- hearts. This defect is the consequence of the dysregulation of the signaling pathways controlling SHF regulation. Accordingly, those embryos exhibit a shorter OFT. The study of Hoxa1 mutant embryos reveals pharyngeal arch arteries patterning defects causing anomalies of the aortic arch and right subclavian artery at fetal stages. Using compound mutants, we show an increase in the penetrance and severity of these defects, suggesting a synergistic interaction between Hoxa1 and Hoxb1 during aortic arch patterning. Together, these data support a crucial role for anterior Hox genes in cardiac development.

L’acide rétinoïque (AR), dérivé actif de la vitamine A, agit comme un morphogène dans de nombreux processus de développement. Des études antérieures chez l’embryon de poulet (Hochgreb et al., 2003) ont montré que l’ AR est impliqué dans la régionalisation antéro-postérieure du tube cardiaque. Au cours de ma thèse, j’ai cherché à définir le rôle de l’AR dans le développement du coeur et plus particulièrement dans la régionalisation antéropostérieuredu territoire cardiaque. Pour cela, j’ai utilisé les mutants souris déficients pourl’enzyme RALDH2 permettant la synthèse d’AR. L’utilisation de marqueurs spécifiques des progéniteurs cardiaques nous a permis de montrer que l’AR est requis pour établir la bordure postérieure du second champ cardiaque (mésoderme splanchnique).Dans le but de mieux comprendre comment la voie de l’AR agit sur la spécification cardiaque, nous avons voulu identifier ses cibles dans le mésoderme splanchnique. Pour la première fois, nous montrons l’implication des gènes Hox dans la cardiogenèse précoce.L’analyse du lignage des cellules exprimant Hoxa1, Hoxa3 et Hoxb1 nous a permis demontrer que les pôles artériels et veineux ont la même origine au niveau du territoire cardiaque.Nous avons aussi étudié le rôle de l’AR dans la morphogenèse des arcs aortiques et de sesdérivés, en particulier son influence sur le développement de la quatrième artère des arcspharyngés. Cette étude a mis en évidence l’interaction génétique de Raldh2 et du facteur àboîte T, Tbx1, lors de la morphogenèse du quatrième arc aortique. En effet, la diminution de l’AR accélère la récupération des défauts de la quatrième artère des arcs pharyngés chez le modèle murin pour le syndrome de Di George (Tbx1+/-). Nos résultats suggèrent que l’AR estun modificateur de la micro-délétion 22q11 (syndrome de DiGeorge) chez l’homme, ceci pouvant expliquer en partie la grande variabilité des malformations cardiaques des patients DiGeorge.J’ai aussi participé à l’étude du rôle de l’AR dans la différenciation des progéniteurs du myocarde ventriculaire. Ces résultats montrent que l’AR est nécessaire à la différenciation de la population de cellules progénitrices du myocarde. La portée de ces résultats est importante et pourra conduire à plus long terme à la thérapie et la réparation du muscle cardiaque. Enfin,la dernière partie de l’étude se concentre sur le rôle de l’AR dans le développement de la vasculature coronaire. Ce morphogène semble influencer le positionnement des ostia coronaires à l’aorte. / Retinoic acid (RA), the active derivative of vitamin A (retinol), acts as a morphogen inseveral developmental processes. Previous studies in the chick embryo (Hochgreb et al.,2003) have indicated that RA signaling is required to antero-posterior patterning of the cardiac tube. The aim of my thesis was to define the role of RA signaling in heart development and in particular in the establishment of antero-posterior identity of the cardiac field. Thus, we used Raldh2 (Retinaldehyde dehydrogenase 2) mutants that are deficient for RA synthesis. To understand the role of RA, we examined the contribution of the second heart field to pharyngeal mesoderm, atria and outflow tract in Raldh2-/- embryos. Our findingsshown that embryo lacking RA synthesis enzyme RALDH2 have expansion of the secondheart field (splanchnic mesoderm).To better understand the mechanism by which RA signaling regulates the cardiac progenitors,we have identified its targets in the splanchnic mesoderm. We have shown for the first timethat Hox genes contribute to cardiogenesis. Moreover, genetically labeled cells analysis reveals a common origin of the arterial and venous poles in the cardiac field.Then, we have analyzed the role of RA in aortic arch remodeling, in particular its influence onfourth aortic arch arteries. This work demonstrates a genetic interaction between Raldh2 and the T-box factor, Tbx1, during fourth aortic arch formation. Our results shows that decreasedon RA level accelerates recovery of fourth aortic arch artery defects seen in Tbx1-/-, which is amodel of DiGeorge syndrome. Moreover, this study suggests that RA is a modifier of 22q11microdeletion (DiGeorge syndrome) in patient.In a collaborative work, we have analyzed the role of RA in differentiation of ventricular myocardium progenitors. Our results showed that the differentiation of the myocardial progenitor cells required RA. The impact of these results is crucial and would lead to therapyand cardiac muscle repair.The last part of my thesis focuses on the role of RA on coronary vascular development. This morphogen seems to influence the position of coronary ostia to the aorta.

Disruptions in cardiac development cause congenital heart disease, the most prevalent and deadly congenital malformation. Genetic and environmental factors are thought to contribute to these defects, however molecular mechanisms remain largely undefined. Recent work highlighted potential roles of chromatin- modifying enzymes in congenital heart disease pathogenesis. Histone deacetylases, a class of chromatin-modifying enzymes, have developmental importance and recognized roles in the mature heart. This thesis aimed to characterize functions of Hdac3 in cardiac development. We found loss of Hdac3 in the primary heart field causes precocious progenitor cell differentiation, resulting in hypoplastic ventricular walls, ventricular septal defect, and mid- gestational lethality. In primary heart field progenitors, Hdac3 interacts with, deacetylates, and functionally suppresses transcription factor Tbx5. Furthermore, a disease-associated Tbx5 mutation disrupts this interaction, rendering Tbx5 hyperacetylated and hyperactive. By contrast, deletion of Hdac3 in second heart field progenitors bypasses these defects, instead causing malformations in the outflow tract and semilunar valves, with lethality prior to birth. Affected semilunar valves and outflow tract vessels exhibit extracellular matrix and EndMT defects and activation of the Tgfβ1 signaling pathway. In normal second heart field development, Hdac3 represses Tgfβ1 transcription, independent of its deacetylase activity, by recruiting the PRC2 methyltransferase complex to methylate the Tgfβ1 promoter. Importantly, knockouts of Hdac3 in differentiated cardiac cells do not fully recapitulate the progenitor-specific knockout phenotypes. These results illustrate spatiotemporal roles of Hdac3, both deacetylase-dependent and deacetylase-independent, in cardiac development, suggesting that dysregulation of Hdac3 in cardiac progenitor cells could be a contributing factor in congenital heart disease pathogenesis.