Submitted by Tatiana Silva (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2013-01-25T16:23:38Z No. of bitstreams: 1 monique_b_vieira_ioc_bcm_0035_2010.pdf: 3754001 bytes, checksum: e9addb2be437498db04bf586f51fc750 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-25T16:23:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 monique_b_vieira_ioc_bcm_0035_2010.pdf: 3754001 bytes, checksum: e9addb2be437498db04bf586f51fc750 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil / Os vírus da hepatite B (HBV) e da hepatite C (HCV) são os maiores agentes causadores de doenças hepáticas crônicas. As vacinas recombinantes contra a hepatite B correspondem ao antígeno de superfície do vírus da hepatite B (HBsAg), formado apenas pela proteína small (S), as quais têm a propriedade de organizar-se em partículas subvirais não infecciosas secretadas em grande quantidade pelas células hospedeiras sendo facilmente purificadas. As partículas subvirais do HBV podem funcionar como uma estrutura carreadora de epítopos de outros agentes infecciosos e devido a essas propriedades, foram construídos plasmídios recombinantes contendo o gene S do HBV, no qual foi inserido uma sequencia de 129bp da região E2 hipervariável 1 (HVRI) do envelope do HCV, através de um sítio de restrição único localizado no interior da região nucleotídica para o determinante a do HBsAg. O objetivo deste estudo é a caracterização desses vetores HBsAg subvirais carregando epitopos do HCV, com avaliação de antigenicidade e imunogenicidade das construções plasmidiais, bem como das partículas quiméricas purificadas em comparação a partículas HBsAg subvirais. Três vetores de expressão em células de mamíferos comerciais, pcDNA3.1D/V5-His-TOPO © , o pcDNA3 e o pCI foram utilizados e os ensaios de transfecção transitória realizados em células de ovário de hamster chinês (CHO) e/ou células hepáticas de linhagem contínua humana (HuH7). A avaliação da presença de uma cauda de poli-histidina fusionada ao HBsAg foi realizada em construções utilizando como vetor o plasmídio comercial pCI. Os sobrenadantes e extratos celulares obtidos das transfecções transitórias foram analisados quanto à detecção de HBsAg por ensaios imunoenzimáticos. As proteínas recombinantes obtidas foram pré-purificadas por colchão de sacarose 20%, caracterizadas por eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante (SDS-PAGE) e Western-Blot e os ensaios de imunogenicidade foram realizados em camundongos BALB/c de 4 semanas. Os níveis de expressão transitória de partículas HBsAg subvirais expressas nas células CHO e HuH7 foram duas vezes menores utilizando o vetor pCI contendo a sequencia para poli-histidinas em comparação com o vetor pCI comercial. O perfil em SDS-PAGE evidenciou duas bandas protéicas de 30 kDa e 24 kDa, presentes somente nos sobrenadantes das culturas transfectadas transitoriamente e não nos controles negativos. Tais bandas foram reconhecidas em Western-Blot, por um anticorpo monoclonal anti-HBs específico para a proteína S, corroborando a antigenicidade da proteína HBsAg quimérica (30kDa) e não quimérica (24kDa). Os ensaios de imunogenicidade em camundongos BALB/c demonstraram que a vacinação com as construções moleculares contendo o gene HBsAg (pCI-SAa) ou a sequencia quimérica HBsAg/HCV (pCI-SAaHCV) foi capaz de elicitar uma resposta imune humoral, com uma detecção de anticorpos anti -HBs cerca de 3 e 400 vezes, respectivamente, maior do que detectada nos camundongos imunizados com as partículas HBsAg subvirais obtidas pelas mesmas construções plasmidiais. O desenvolvimento dessa tecnologia se torna uma ferramenta útil para a produção de vacinas bivalentes, como insumos para testes de diagnóstico ou ainda como agente terapêutico / The hepatitis B virus (HBV) and hepatitis C virus (HCV) are the major causative agents of chronic hepatitis disease worldwide. The HBV recombinant vaccines are composed of the HBV small (S) envelope protein(HBsAg).These particles have the capacity of self-assemble into virus-like particles (VLPs), which can be produced in large quantities and are easily enriched and purified. Nevertheless, the HBsAg subviral particles may be used as a carrier for foreign epitopes. Due to this property we have constructed HBsAg recombinant plasmids from a HBV isolate of genotype A, subgenotype A1, which we have used to insert epitopes of the E2 hypervariable region 1 (HVR1) from HCV envelope protein, using a natural unique restriction site located into the a determinant of S region. The aim of this study is to characterize these chimeric subviral HBsAg vectors carrying HCV epitopes, to evaluate the antigenicity and immunogenicity of molecular constructions, as well as, the purified chimeric particles compared with HBsAg subviral particles. The chimeric HBsAg/HCV and wild type HBsAg sequences were cloned into three different mammalian commercial vectors, the pcDNA3.1D/V5-His-TOPO©, pcDNA3 and pCI. Transient transfection assays were carried out in Chinese Ramster Ovary (CHO) and Human Hepatoma (HuH7) cell lines. The evaluation of a poly-histidine tag fused to HBsAg sequence was performed using pCI vector constructions. The detection of HBsAg from medium and cells extracts of the transient transfection cell lines were analysed by immunosorbent assay. The recombinant proteins were partially purified by 20% sucrose cushion, characterized by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western-Blot analysis. The immunogenicity assays were performed with Male 4-week-old BALB/c mice. The expression patterns of HBsAg particles expressed by CHO and HuH7 cell lines were 2-fold lower in pCI vectors fused with a poly-histidine tag than commercial pCI vectors. The SDS-PAGE profile showed two protein bands of 30 kDa and 24 kDa at culture medium of transfected cells, which were absent at negative controls. These bands were detected in Western Blot assay, using a specific anti-HBs monoclonal antibody S protein, and corroborates the chimeric HBsAg (30 kDa) and wild type HBsAg (24 kDa) antigenicity. The immunogenicity assays performed at BALB/c mice showed the vaccination with molecular constructions, containing the HBsAg wild type (pCI-SAa) or chimeric HBsAg/HCV (pCI-SAaHCV) sequences, were able to elicit a humoral immune response, with anti-HBs antibodies titers about 3 to 400-fold higher than detected in mice immunized with wild type and chimeric HBsAg/HCV purified particles, obtained with the same molecular constructions. This study has practical applications, such as the development of bivalents vaccines, therapy, as well as, diagnosis fields.