Orientador: Erick da Cruz Castelli / Resumo: O gene KIR2DL4 codifica um importante receptor de células Natural Killer (NK). O único ligante de KIR2DL4 conhecido é a molécula HLA-G, expressa principalmente na placenta, modulando a ação das células NK durante a gestação. O gene KIR2DL4 parece ser bastante variável, quando considerado os bancos de dados que armazenam suas sequências conhecidas, porém não está claro o nível de diversidade deste gene em populações reais e heterogêneas. Polimorfismos presentes no gene KIR2DL4 poderiam influenciar a interação entre KIR2DL4 e HLA-G, modificando a ação das células NK. Neste estudo exploramos a variabilidade genética de KIR2DL4 em 157 indivíduos oriundos do Estado de São Paulo/Brasil. Devido à alta similaridade de sequências entre os genes KIR, erros de genotipagem são esperados quando se utiliza sequenciamento de segunda geração. Por este motivo, desenvolvemos uma abordagem para classificar cada leitura com base em sequências KIR conhecidas, endereçando-as ao gene mais provável. Também utilizamos o painel SNPforID 34-plex para avaliar a ancestralidade dessas amostras. Considerando o segmento completo desse gene, indo da região 5’URR até a 3’UTR, com aproximadamente 13kb, o gene KIR2DL4 se mostrou pouco polimórfico, com 152 pontos de variações identificados (MAF 1%). Esses pontos de variação estão organizados em 32 haplótipos estendidos que codificam 13 proteínas diferentes. Foram encontrados 11 haplótipos na região promotora, sendo que 8 possuem MAF maior que 1%. Na região codif... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: KIR2DL4 is the most unusual Killer Cell Immunoglobulin-Like receptor (KIR) family member in terms of structure, expression, and signaling properties. The only known KIR2DL4 ligand is HLA-G, and polymorphisms might disrupt this interaction. KIR2DL4 variability is not well explored in admixed populations. Here we explored KIR2DL4 exon variability in 157 individuals from the State of São Paulo/Brazil. Because of sequence similarity with other KIR genes, it is expected genotyping errors when using secondgeneration sequencing. We developed an approach to score each read based on known KIR sequences, addressing them to the most likely locus. We evaluated the SNPforID 34-plex panel to assess ancestry. The methodology was applied to survey the variability of a very admixed population, such as Brazilian, counting with 157 samples of São Paulo State. Considering a segment of about 13-kb, KIR2DL4 gene was conserved with few different and frequent sequences. Overall, 152 variable sites were detected, arranged in 32 haplotypes codifying 13 protein. We found 11 promoter haplotypes, 8 with a frequency greater than 1%. In the coding region we detected 70 haplotypes, four of which correspond to 50% of the coding sequences (KIR2DL4 * 0080204, * 008105, * 001, * 005). In the 3'UTR region, 14 haplotypes were identified with MAF greater than 1%. The KIR2DL4 coding region was the most variable segment. We observed that KIR2DL4 variability is strongly influenced by the sample ancestry background. K... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Os micro-organismos que habitam o trato digestivo dos ruminantes têm uma profunda influência no desenvolvimento e funcionamento do animal hospedeiro. O rúmen abriga comunidades microbianas complexas dominadas por bactérias que participam de um processo eficiente de degradação dos materiais que compõem a parede celular vegetal. Por esta razão, o microbioma do rúmen representa uma fonte inexplorada de enzimas hidrolíticas com potencial aplicação na produção de combustíveis a partir da biomassa lignocelulósica. Nós usamos a plataforma Ion Torrent (PGM) para acessar o microbioma do rúmen de quatro animais da raça Santa Inês submetidos a uma dieta base. A fim de descrever a estrutura da comunidade microbiana no rúmen de ovinos e explorar o seu potencial como uma fonte de genes de degradação da biomassa, usamos a abordagem de sequenciamento do gene RNA ribossomal 16S (rRNA), utilizando Ion Tags, e a abordagem de sequenciamento metagenômico shotgun (DNA total), respectivamente. Além disso, medimos parâmetros químicos do ambiente do rúmen, relacionados a cada animal, incluindo pH, Degradabilidade da Matéria Orgânica (OMD), Produção total de Gás (GP) e Emissões de Metano (CH4), a fim de buscar correlações entre estas variáveis químicas e os grupos bacterianos. Em termos de estrutura da comunidade microbiana (bacteriana), encontramos Bacteroidetes como o filo dominante, seguido por Firmicutes, Proteobacteria e Actinobacteria. Alguns táxons foram correlacionados com os parâmetros químicos, como as famílias Corynebacteriaceae e Streptococcaceae, que foram positivamente correlacionadas com OMD; e a família Streptomycetaceae, negativamente correlacionada com GP e CH4. Algumas glicosil hidrolases conhecidas foram identificadas, como Endo-1,4-beta-glucanases, Beta-D-glicosídioglicohidrolases e outras foram designadas como putativas. Estas descobertas mostram interações ecológicas entre os grupos microbianos e funções importantes do rúmen, assim como o potencial do rúmen de ovinos para a descoberta de novas enzimas celulolíticas. / The microorganisms inhabiting the digestive tracts of ruminants have a profound influence on the host animal development and functioning. The rumen harbors complex microbial communities dominated by bacteria, which participate in an efficient process to digest plant cell wall materials. For this reason, the rumen microbiome represents an untapped source of hydrolytic enzymes with potential application for fuel production from lignocellulosic biomass. We used the Ion Torrent (PGM) platform to access the rumen microbiome of four animals of Santa Inês breed under a base diet. In order to describe the structure of the microbial community in the sheep rumen and explore its potential as a source of biomass-degrading genes, we used 16S ribosomal RNA (rRNA) Ion Tags sequencing approach and shotgun metagenomic sequencing (total DNA) approach, respectively. Furthermore, we measured rumen chemical environmental parameters related to each animal, including pH, Organic Matter Degradability (OMD), Total Gas Production (GP) and Methane emissions (CH4) in order to search for correlations between these chemical variables and bacterial groups. In terms of microbial (bacterial) community structure, we found Bacteroidetes as the dominant phylum in sheep rumen microbiome, followed by Proteobacteria, Firmicutes and Actinobacteria. Some taxa were correlated with the environmental parameters, like the Corynebacteriaceae and Streptococcaceae families, which was positively correlated with OMD, and the Streptomycetaceae family, negatively correlated with GP and CH4. Some known glycoside hydrolases were identified, such as Endo-1,4-betaglucanases, Beta-D-glucoside glucohydrolases and others were designated as putative ones. These findings show ecological interactions among microbial groups and important rumen functions, as well as the potential of the sheep rumen for the discovery of new cellulolytic enzymes.

Os micro-organismos que habitam o trato digestivo dos ruminantes têm uma profunda influência no desenvolvimento e funcionamento do animal hospedeiro. O rúmen abriga comunidades microbianas complexas dominadas por bactérias que participam de um processo eficiente de degradação dos materiais que compõem a parede celular vegetal. Por esta razão, o microbioma do rúmen representa uma fonte inexplorada de enzimas hidrolíticas com potencial aplicação na produção de combustíveis a partir da biomassa lignocelulósica. Nós usamos a plataforma Ion Torrent (PGM) para acessar o microbioma do rúmen de quatro animais da raça Santa Inês submetidos a uma dieta base. A fim de descrever a estrutura da comunidade microbiana no rúmen de ovinos e explorar o seu potencial como uma fonte de genes de degradação da biomassa, usamos a abordagem de sequenciamento do gene RNA ribossomal 16S (rRNA), utilizando Ion Tags, e a abordagem de sequenciamento metagenômico shotgun (DNA total), respectivamente. Além disso, medimos parâmetros químicos do ambiente do rúmen, relacionados a cada animal, incluindo pH, Degradabilidade da Matéria Orgânica (OMD), Produção total de Gás (GP) e Emissões de Metano (CH4), a fim de buscar correlações entre estas variáveis químicas e os grupos bacterianos. Em termos de estrutura da comunidade microbiana (bacteriana), encontramos Bacteroidetes como o filo dominante, seguido por Firmicutes, Proteobacteria e Actinobacteria. Alguns táxons foram correlacionados com os parâmetros químicos, como as famílias Corynebacteriaceae e Streptococcaceae, que foram positivamente correlacionadas com OMD; e a família Streptomycetaceae, negativamente correlacionada com GP e CH4. Algumas glicosil hidrolases conhecidas foram identificadas, como Endo-1,4-beta-glucanases, Beta-D-glicosídioglicohidrolases e outras foram designadas como putativas. Estas descobertas mostram interações ecológicas entre os grupos microbianos e funções importantes do rúmen, assim como o potencial do rúmen de ovinos para a descoberta de novas enzimas celulolíticas. / The microorganisms inhabiting the digestive tracts of ruminants have a profound influence on the host animal development and functioning. The rumen harbors complex microbial communities dominated by bacteria, which participate in an efficient process to digest plant cell wall materials. For this reason, the rumen microbiome represents an untapped source of hydrolytic enzymes with potential application for fuel production from lignocellulosic biomass. We used the Ion Torrent (PGM) platform to access the rumen microbiome of four animals of Santa Inês breed under a base diet. In order to describe the structure of the microbial community in the sheep rumen and explore its potential as a source of biomass-degrading genes, we used 16S ribosomal RNA (rRNA) Ion Tags sequencing approach and shotgun metagenomic sequencing (total DNA) approach, respectively. Furthermore, we measured rumen chemical environmental parameters related to each animal, including pH, Organic Matter Degradability (OMD), Total Gas Production (GP) and Methane emissions (CH4) in order to search for correlations between these chemical variables and bacterial groups. In terms of microbial (bacterial) community structure, we found Bacteroidetes as the dominant phylum in sheep rumen microbiome, followed by Proteobacteria, Firmicutes and Actinobacteria. Some taxa were correlated with the environmental parameters, like the Corynebacteriaceae and Streptococcaceae families, which was positively correlated with OMD, and the Streptomycetaceae family, negatively correlated with GP and CH4. Some known glycoside hydrolases were identified, such as Endo-1,4-betaglucanases, Beta-D-glucoside glucohydrolases and others were designated as putative ones. These findings show ecological interactions among microbial groups and important rumen functions, as well as the potential of the sheep rumen for the discovery of new cellulolytic enzymes.

Submitted by Claudia Rocha (claudia.rocha@udesc.br) on 2018-02-28T15:12:17Z No. of bitstreams: 1 PGPV16MA213.pdf: 884034 bytes, checksum: 7cc478a7cc0d8b7316468ee785e7565f (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-28T15:12:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGPV16MA213.pdf: 884034 bytes, checksum: 7cc478a7cc0d8b7316468ee785e7565f (MD5) Previous issue date: 2016-08-26 / Microsatellites or simple sequence repeats (SSR) are co-dominant and highly polymorphic genetic markers used for population genetic studies. Mimosa scabrella Benth., popularly known as ‘‘bracatinga’’, is a pioneer and endemic species of Brazil, occurring in Mixed Ombrophilous Forest associated to Brazilian Atlantic Rainforest biome. It is a fast-growing tree of Fabaceae family which facilitates the dynamics of ecological succession. SSR development when there is no sequence is time and labor intensive, there are no molecular markers for Mimosa scabrella Benth. Due to reduced time, the use of second generation sequencing is a powerful tool for microsatellite development for population genetic studies. This current project proposed to develop and validate the first microsatellite markers for the species, evaluating mother trees and progenies. Using Second Generation Sequencing of Illumina platform, this project identified 290 SSR loci e 211 primer pairs. A subset of 11 primer pairs was synthetized with fluorescence in the Forward primer for PCR and capillary electrophoresis validation with leaf DNA of 33 adult and 411 progeny individuals. Polymorphic loci percentage was 36, four in 11 loci, 3 chloroplast SSR and one nuclear SSR. Allele number of polymorphic loci ranged from two to 11 alleles considering all sampling. Second-generation sequencing has enabled a large number of microsatellite loci identification for bracatinga, resulting in SSR markers development for the species. The assessed and validated SSR markers are suitable and useful for analysis and population genetic studies. Other SSR markers were identified, but still need to be synthesized and evaluated for polymorphism and consistency between mother trees and progenies for validation / Microssatélites ou simple sequence repeats (SSR) são marcadores genéticos codominantes e altamente polimórficos usados para estudos de genética de populações. Mimosa scabrella Benth., popularmente conhecida como bracatinga, é uma espécie pioneira e endêmica do Brasil, ocorrendo na Floresta Ombrófila Mista, associado ao bioma Mata Atlântica. É uma espécie arbórea da família Fabaceae, de rápido crescimento, que facilita a dinâmica de sucessão ecológica. O desenvolvimento de SSR quando não há sequências é demorado e laborioso, e não há marcadores moleculares desenvolvidos para Mimosa scabrella Benth. Devido ao tempo reduzido, o uso de sequenciamento de segunda geração é uma ferramenta poderosa para o desenvolvimento de microssatélites nos estudos de genética de populações. O presente trabalho se propôs a desenvolver e validar os primeiros marcadores microssatélites para a espécie, avaliando matrizes e progênies. Usando o sequenciamento de segunda geração pela plataforma Illumina, este trabalho identificou 290 locos SSR e 211 pares de primers. Um subconjunto de 11 pares de primers foi sintetizado com fluorescência no primer forward para validação por PCR e eletroforese capilar a partir do DNA de folhas de 33 adultos e 411 progênies. A porcentagem de locos polimórficos foi de 36, quatro locos em 11, três SSR cloroplastidiais e um SSR nuclear. O número de alelos por loco polimórfico variou de 2 a 11 considerando toda a amostragem. O sequenciamento de segunda geração possibilitou a identificação de um grande número de locos microssatélites para a bracatinga, resultando no desenvolvimento de marcadores SSR para a espécie. Os marcadores SSR avaliados e validados são aptos e úteis para análises e estudos de genética de populações. Outros marcadores SSR foram identificados, mas ainda precisam ser sintetizados e avaliados quanto ao polimorfismo e consistência entre matrizes e progênies para validação