A tecnologia de sequenciamento de nova geração (next-generation sequencing – NGS) e suas aplicações tem sido cada vez mais utilizada na prática médica para elucidar a base molecular de doenças Mendelianas. Embora seja uma poderosa ferramenta de pesquisa, ainda existe uma importante transição quanto à análise dos dados entre as tecnologias tradicionais de sequenciamento e o NGS. A primeira parte deste trabalho aborda aspectos analíticos envolvidos nesta mudança, com foco na plataforma Ion Torrent Personal Genome Machine. Esta é uma plataforma amplamente utilizada para sequenciar painéis de genes, já que esta aplicação requer menor rendimento de dados. Este trabalho demonstra indicadores adequados para avaliar a qualidade de corridas de sequenciamento e também uma estratégia baseada em valores de profundidade de cobertura para avaliar a performance de amplicons em diferentes cenários. Por outro lado, o NGS permitiu a realização de estudos populacionais em larga escala que estão mudando nossa compreensão sobre as variações genéticas humanas. Um desses exemplos são as mutações até então chamadas de silenciosas, que estão sendo implicadas como causadoras de doenças humanas. A segunda parte deste trabalho investiga a patogenicidade de polimorfismos de núcleotídeo único sinônimos (synonymous single nucleotide polymorphisms – sSNP) baseado em dados públicos obtidos do Exome Aggregation Consortium (ExAC) (exac.broadinstitute.org/) utilizando o software Silent Variant Analysis (SilVA) (compbio.cs.toronto.edu/silva/) e outros recursos para reunir informações adicionais sobre consequências funcionais visando fornecer um panorama dos efeitos patogênicos de sSNP em mais de 60.000 exomas humanos. Nós demonstramos que de 1,691,045 variantes sinônimas, um total de 26,034 foram classificadas como patogênicas pelo SilVA, com frequência alélica menor que 0,05. Análises funcionais in silico revelaram que as variantes sinônimas patogênicas estão envolvidas em processos biológicos importantes, como regulação celular, metabolismo e transporte. Ao expor um cenário de variações sinônimas patogênicas em exomas humanos, nós concluímos que filtrar sSNP em workflows de priorização é razoável, no entanto em situações específicas os sSNP podem ser considerados. Pesquisas futuras neste campo poderão fornecer uma imagem clara do papel de tais variações em doenças genéticas. / Next-generation sequencing (NGS) technologies and its applications are increasingly used in medicine to elucidate the molecular basis of Mendelian diseases. Although it is a powerful research tool, there is still an important transition regarding data analysis between traditional sequencing techniques and NGS. The first part of this work addresses analytical aspects involved on this switch-over, focusing on the Ion Torrent Personal Genome Machine platform. This is a widely used platform for sequencing gene panels, as this application demands lower throughput of data. We present indicators suitable to evaluate quality of sequencing runs and also a strategy based on depth of coverage values to evaluate amplicon performance on different scenarios. On the other hand, NGS enabled large-scale population studies that are changing our understanding about human genetic variations. One of these examples are the so-called silent mutations, that are being implied as causative of human diseases. The second part of this work investigates the pathogenicity of synonymous single nucleotide polymorphisms (sSNP) based on public data obtained from the Exome Aggregation Consortium (ExAC) (exac.broadinstitute.org/) using the software Silent Variant Analysis (SilVA) (compbio.cs.toronto.edu/silva/) and other sources to gather additional information about affected protein domains, mRNA folding and functional consequences aiming to provide a landscape of harmfulness of sSNP on more than 60,000 human exomes. We show that from 1,691,045 synonymous variants a total of 26,034 were classified as pathogenic and by SilVA, with allele frequency lower than 0.05. In silico functional analysis revealed that pathogenic synonymous variants found are involved in important biological process, such as cellular regulation, metabolism and transport. By exposing a scenario of pathogenic synonymous variants on human exomes we conclude that filtering out sSNP on prioritization workflows is reasonable, although in some specific cases sSNP should be considered. Future research on this field will provide a clear picture of such variations on genetic diseases.

A tecnologia de sequenciamento de nova geração (next-generation sequencing – NGS) e suas aplicações tem sido cada vez mais utilizada na prática médica para elucidar a base molecular de doenças Mendelianas. Embora seja uma poderosa ferramenta de pesquisa, ainda existe uma importante transição quanto à análise dos dados entre as tecnologias tradicionais de sequenciamento e o NGS. A primeira parte deste trabalho aborda aspectos analíticos envolvidos nesta mudança, com foco na plataforma Ion Torrent Personal Genome Machine. Esta é uma plataforma amplamente utilizada para sequenciar painéis de genes, já que esta aplicação requer menor rendimento de dados. Este trabalho demonstra indicadores adequados para avaliar a qualidade de corridas de sequenciamento e também uma estratégia baseada em valores de profundidade de cobertura para avaliar a performance de amplicons em diferentes cenários. Por outro lado, o NGS permitiu a realização de estudos populacionais em larga escala que estão mudando nossa compreensão sobre as variações genéticas humanas. Um desses exemplos são as mutações até então chamadas de silenciosas, que estão sendo implicadas como causadoras de doenças humanas. A segunda parte deste trabalho investiga a patogenicidade de polimorfismos de núcleotídeo único sinônimos (synonymous single nucleotide polymorphisms – sSNP) baseado em dados públicos obtidos do Exome Aggregation Consortium (ExAC) (exac.broadinstitute.org/) utilizando o software Silent Variant Analysis (SilVA) (compbio.cs.toronto.edu/silva/) e outros recursos para reunir informações adicionais sobre consequências funcionais visando fornecer um panorama dos efeitos patogênicos de sSNP em mais de 60.000 exomas humanos. Nós demonstramos que de 1,691,045 variantes sinônimas, um total de 26,034 foram classificadas como patogênicas pelo SilVA, com frequência alélica menor que 0,05. Análises funcionais in silico revelaram que as variantes sinônimas patogênicas estão envolvidas em processos biológicos importantes, como regulação celular, metabolismo e transporte. Ao expor um cenário de variações sinônimas patogênicas em exomas humanos, nós concluímos que filtrar sSNP em workflows de priorização é razoável, no entanto em situações específicas os sSNP podem ser considerados. Pesquisas futuras neste campo poderão fornecer uma imagem clara do papel de tais variações em doenças genéticas. / Next-generation sequencing (NGS) technologies and its applications are increasingly used in medicine to elucidate the molecular basis of Mendelian diseases. Although it is a powerful research tool, there is still an important transition regarding data analysis between traditional sequencing techniques and NGS. The first part of this work addresses analytical aspects involved on this switch-over, focusing on the Ion Torrent Personal Genome Machine platform. This is a widely used platform for sequencing gene panels, as this application demands lower throughput of data. We present indicators suitable to evaluate quality of sequencing runs and also a strategy based on depth of coverage values to evaluate amplicon performance on different scenarios. On the other hand, NGS enabled large-scale population studies that are changing our understanding about human genetic variations. One of these examples are the so-called silent mutations, that are being implied as causative of human diseases. The second part of this work investigates the pathogenicity of synonymous single nucleotide polymorphisms (sSNP) based on public data obtained from the Exome Aggregation Consortium (ExAC) (exac.broadinstitute.org/) using the software Silent Variant Analysis (SilVA) (compbio.cs.toronto.edu/silva/) and other sources to gather additional information about affected protein domains, mRNA folding and functional consequences aiming to provide a landscape of harmfulness of sSNP on more than 60,000 human exomes. We show that from 1,691,045 synonymous variants a total of 26,034 were classified as pathogenic and by SilVA, with allele frequency lower than 0.05. In silico functional analysis revealed that pathogenic synonymous variants found are involved in important biological process, such as cellular regulation, metabolism and transport. By exposing a scenario of pathogenic synonymous variants on human exomes we conclude that filtering out sSNP on prioritization workflows is reasonable, although in some specific cases sSNP should be considered. Future research on this field will provide a clear picture of such variations on genetic diseases.

Orientador: Silvia Regina Rogatto / Resumo: A identificação de fatores de predisposição e a caracterização de fatores genéticos de risco para odesenvolvimento do câncer são essenciais para o diagnóstico, prognóstico e aconselhamento genéticodos pacientes afetados e seus familiares. Há uma alta incidência de pacientes que possuem carcinomasde mama (CM) e/ou carcinoma de tireoide (CT) e com história familial destes tumores, sugerindo oenvolvimento de gene(s) associado(s) com a predisposição hereditária ao câncer. O objetivo destetrabalho foi investigar a presença de genes de predisposição ao desenvolvimento de CM e CT pormeio do sequenciamento total do exoma, em pacientes que sejam afetados por pelo menos um destestumores e possuam história familial de câncer. Foram incluídas seis pacientes que apresentavam CM,12 com CT e seis com ambos os tumores, todos com história destes tumores em suas famílias. O DNAde sangue periférico foi sequenciado pela plataforma HiSeq 1000 (Illumina). Após análise debioinformática foram identificadas alterações em genes de alta e baixa penetrância comuns e raras. Asalterações raras destes genes foram consideradas como patogênicas quando presentes em pelo menostrês bancos de dados e em até dois indivíduos. A paciente 14 teve diagnóstico de síndrome de Cowdenconfirmado pela presença da mutação p.R233X no gene PTEN. Também foram investigadas outrasalterações em novos genes o que resultou em 911 SNVs (single nucleotide variations), sendo 287 não-sinônimas e 50 alteraç... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The identification of predisposing genes and characterization of genetic risk factors for cancer development are essential for the diagnosis, prognosis and genetic counseling of affected patients and their families. A significant number of patients with breast (BC) and papillary thyroid carcinomas (TC) and family history of these tumors suggest the involvement a hereditary cancer predisposition gene. The aim of this study was to evaluate new predisposing genes related to BC and TC by whole exome sequencing, in patients who are affected by at least one of these tumors and have cancer family history. Six patients with CM, 12 with CT and six with both tumors were included in the study, all of them with family history of these tumors. DNA from peripheral blood sample was sequenced by HiSeq 1000 platform (Illumina). After the bioinformatics analysis, variations in high and lowpenetrance genes were identified; most of them were considered common according to 1000 Genomes and 6500 Exomes. Furthermore, rare variations were described in these genes, which were considered pathogenic in at least three databases and observed in up to two patients. Patient 14 presented the p.R233X mutation in PTEN confirming the diagnosis of Cowden Syndrome. Other genes were investigated in order to characterize new variations related to the phenotype studied. This analysis resulted in 911 SNVs (single nucleotide variations), 287 non-synonymous alterations and 50 rare pathogenic variations (detected in at... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

A tecnologia de sequenciamento de nova geração (next-generation sequencing – NGS) e suas aplicações tem sido cada vez mais utilizada na prática médica para elucidar a base molecular de doenças Mendelianas. Embora seja uma poderosa ferramenta de pesquisa, ainda existe uma importante transição quanto à análise dos dados entre as tecnologias tradicionais de sequenciamento e o NGS. A primeira parte deste trabalho aborda aspectos analíticos envolvidos nesta mudança, com foco na plataforma Ion Torrent Personal Genome Machine. Esta é uma plataforma amplamente utilizada para sequenciar painéis de genes, já que esta aplicação requer menor rendimento de dados. Este trabalho demonstra indicadores adequados para avaliar a qualidade de corridas de sequenciamento e também uma estratégia baseada em valores de profundidade de cobertura para avaliar a performance de amplicons em diferentes cenários. Por outro lado, o NGS permitiu a realização de estudos populacionais em larga escala que estão mudando nossa compreensão sobre as variações genéticas humanas. Um desses exemplos são as mutações até então chamadas de silenciosas, que estão sendo implicadas como causadoras de doenças humanas. A segunda parte deste trabalho investiga a patogenicidade de polimorfismos de núcleotídeo único sinônimos (synonymous single nucleotide polymorphisms – sSNP) baseado em dados públicos obtidos do Exome Aggregation Consortium (ExAC) (exac.broadinstitute.org/) utilizando o software Silent Variant Analysis (SilVA) (compbio.cs.toronto.edu/silva/) e outros recursos para reunir informações adicionais sobre consequências funcionais visando fornecer um panorama dos efeitos patogênicos de sSNP em mais de 60.000 exomas humanos. Nós demonstramos que de 1,691,045 variantes sinônimas, um total de 26,034 foram classificadas como patogênicas pelo SilVA, com frequência alélica menor que 0,05. Análises funcionais in silico revelaram que as variantes sinônimas patogênicas estão envolvidas em processos biológicos importantes, como regulação celular, metabolismo e transporte. Ao expor um cenário de variações sinônimas patogênicas em exomas humanos, nós concluímos que filtrar sSNP em workflows de priorização é razoável, no entanto em situações específicas os sSNP podem ser considerados. Pesquisas futuras neste campo poderão fornecer uma imagem clara do papel de tais variações em doenças genéticas. / Next-generation sequencing (NGS) technologies and its applications are increasingly used in medicine to elucidate the molecular basis of Mendelian diseases. Although it is a powerful research tool, there is still an important transition regarding data analysis between traditional sequencing techniques and NGS. The first part of this work addresses analytical aspects involved on this switch-over, focusing on the Ion Torrent Personal Genome Machine platform. This is a widely used platform for sequencing gene panels, as this application demands lower throughput of data. We present indicators suitable to evaluate quality of sequencing runs and also a strategy based on depth of coverage values to evaluate amplicon performance on different scenarios. On the other hand, NGS enabled large-scale population studies that are changing our understanding about human genetic variations. One of these examples are the so-called silent mutations, that are being implied as causative of human diseases. The second part of this work investigates the pathogenicity of synonymous single nucleotide polymorphisms (sSNP) based on public data obtained from the Exome Aggregation Consortium (ExAC) (exac.broadinstitute.org/) using the software Silent Variant Analysis (SilVA) (compbio.cs.toronto.edu/silva/) and other sources to gather additional information about affected protein domains, mRNA folding and functional consequences aiming to provide a landscape of harmfulness of sSNP on more than 60,000 human exomes. We show that from 1,691,045 synonymous variants a total of 26,034 were classified as pathogenic and by SilVA, with allele frequency lower than 0.05. In silico functional analysis revealed that pathogenic synonymous variants found are involved in important biological process, such as cellular regulation, metabolism and transport. By exposing a scenario of pathogenic synonymous variants on human exomes we conclude that filtering out sSNP on prioritization workflows is reasonable, although in some specific cases sSNP should be considered. Future research on this field will provide a clear picture of such variations on genetic diseases.

O desenvolvimento embrionário dos membros é um processo complexo e dinâmico. É controlado por diversos genes e diversos mecanismos morfogenéticos, muitos dos quais ainda não estão completamente elucidados. O objetivo deste estudo é identificar as alterações genéticas responsáveis por defeitos de membros em quatro famílias brasileiras. A família 1 apresenta três indivíduos com um espectro extremamente variável de displasia ectodérmica, ectrodactilia e fenda labiopalatina, características da síndrome EEC. O gene TP63 foi analisado por sequenciamento de Sanger e foi descoberta uma variante nunca descrita anteriormente, c.1037C>A (p.Ala346Gly), em heterozigose, segregando com o fenótipo. Mutações no gene TP63 já foram associadas com casos da síndrome EEC. Concluímos que a variante no gene TP63 é a responsável pelo quadro clínico de EEC na família. A família 2 incluiu cinco indivíduos afetados por polegar trifalângico. O fenótipo de um dos indivíduos é mais grave e se caracteriza por, além do polegar trifalângico, pela presença de braço direito grosseiramente curto e deformado com dedos hipoplásicos, pé direito malformado com metatarsos hipoplásicos e orelha direita pequena e protuberante. Estudos de mapeamento gênico com arrays de SNPs revelaram Lod scores sugestivos de ligação com 8 regiões cromossômicas distintas. O sequenciamento massivo em paralelo do exoma com a amostra de um dos afetados, seguida da seleção das variantes presentes nas regiões com Lod scores sugestivos, revelou a presença da variante c.410dupG (p.Gly138Argfs∗43) no gene SALL4, a qual nunca havia sido descrita. Mutações no SALL4 que alteram a matriz de leitura já foram associadas com casos da síndrome de Okihiro, a qual é caracterizada por defeitos radiais de membros e anomalia oftalmológica de Duane. A segregação da variante entre os indivíduos afetados foi confirmada por sequenciamento de Sanger. Concluimos que esta variante é responsável pelo quadro clínico da família, a qual apresenta a síndrome de Okihiro, porém sem a anomalia de Duane. A análise de todos os casos descritos com variantes no gene SALL4 sugere que há uma correlação entre defeitos nos membros inferiores e o tamanho reduzido da proteína truncada SALL4. A família 3 apresenta três indivíduos afetados por sindactilia completa com polidactilia pré-axial nas mãos, classificada como sindactilia do tipo IV. O sequenciamento massivo em paralelo do exoma com as amostras de três indivíduos afetados e dois normais não revelou a presença de qualquer alteração genética candidata a explicar o quadro clínico. O estudo do array-CGH revelou uma duplicação de aproximadamente 97 kb no gene LMBR1 abrangendo a região de enhancer (ZRS) do gene SHH. Duplicações no ZRS já foram identificadas em casos de sindactilia do tipo IV. Concluímos que a duplicação no ZRS é responsável pelo quadro. A revisão da literatura sobre os casos com duplicação dessa região sugere uma correlação entre duplicações com tamanho ao redor de 97 kb e o fenótipo clássico de sindactilia do tipo IV. A família 4 apresenta seis indivíduos afetados por uma síndrome relativamente nova descrita por nossa equipe em 2008, a síndrome de Santos. Essa síndrome é caracterizada por aplasia/hipoplasia fibular e anoniquia/hipoplasia ungueal dentre outros defeitos de membros. O estudo de ligação com array de SNP e marcadores de microssatélites, com posterior cálculo de Lod score, indicou duas regiões no cromossomo 3 como candidatas a conter a alteração genética responsável pelo fenótipo. Análise dos genes presentes nessas regiões indicou o gene WNT7A como o principal candidato. Alterações neste gene já foram associadas com a síndrome de Fuhrmann e a AARRS (Al-Awadi⁄Raas-Rothschild syndrome), de herança recessiva, as quais apresentam fenótipos correlatos aos presentes na síndrome de Santos. O sequenciamento de Sanger deste gene revelou a presença da variante c.934G>A (p.Gly312Ser), não descrita, em homozigose em cinco dos seis indivíduos afetados da família. O sexto indivíduo afetado é heterozigoto e apresenta fenótipo muito menos grave. Não apresenta qualquer defeito fibular e ungueal, característicos da síndrome. Esse é o primeiro relato de um caso de defeitos de membros como resultado da presença de uma variante em heterozigose no gene WNT7A. O sequenciamento massivo em paralelo do exoma foi realizado com as amostras deste indivíduo e de um dos indivíduos afetados. Contudo, nenhuma outra variante se mostrou candidata a explicar o quadro clínico. Concluímos que a síndrome de Santos é o resultado desta mutação no gene WNT7A. Estudos funcionais in situ baseados na atividade da Luciferase estão em andamento para comprovar o efeito deletério desta variante / Limb development is a complex and dynamic process driven by many different genes and morphogenetic mechanisms. Many of them have not been properly clarified yet. The aim of this study is to identify genetic alterations responsible for limb defects in four Brazilian families. Family 1 includes three individuals affected by an extremely variable phenotype of ectrodactyly, ectodermal dysplasia and cleft lip/palate, and other clinical signs of EEC syndrome. The TP63 gene, associated with this condition, was analyzed through Sanger sequencing and a novel variant, c.1037C>A (p.Ala346Gly), was found; the variant segregated in heterozygous state with the EEC phenotype. Mutations in TP63 gene are already known to be associated with EEC syndrome. Due to the extremely variable phenotype presented by the individuals in the family, the possibility of the mutation c.1037C>G being related to acro-dermato-ungual-lacrimal-tooth (ADULT) syndrome and SHFM cannot be ruled out. Family 2 presents five individuals affected by preaxial polydactyly (triphalangeal thumbs). The phenotype of the proband is more severe, being characterized by triphalangeal thumb, with the following manifestations: grossly shortened and deformed forearm, markedly hypoplastic and appendicular thumb and malformed right foot with hypoplastic metatarsals. Linkage studies by SNP-array pointed to suggestive Lod score values in 8 distinct chromosomal regions. Whole exome sequencing with the sample from one affected individual revealed a novel frameshift variant, c.410dupG (p.Gly138Argfs∗43) in the SALL4 gene. Frameshift mutations in the SALL4 were already associated to Okihiro syndrome, which is characterized by radial limb defects and Duane anomaly. The segregation of the variant among the affected individuals was confirmed by Sanger sequencing. We concluded that this variant is the cause of the clinical signs in the family, which was classified as presenting Okihiro syndrome without Duane anomaly. The review of all clinical cases reported with SALL4 variants indicates a possible correlation between the foot malformation and the reduced size of the SALL4 protein. Family 3 has affected individuals with complete hand syndactyly associated to pre-axial polydactyly (syndactyly type IV). Whole exome sequencing was performed with the samples collected from the three affected individuals and two non-affected ones and no pathogenic variant was detected in genes related to limb development segregating with the phenotype. Through array-CGH, nevertheless, a duplication of about 97 kb including the enhancer (ZRS) of the SHH gene was detected. Duplications in ZRS region were already reported in Syndactyly type IV. We concluded that the 97-kb duplication is the cause of the syndactyly type IV in the family. A review of reported cases (including ours) suggested a possible correlation between the duplication with 97 kb size and the classic phenotype of syndactyly type IV. Family 4 has six individuals affected by a new syndrome (Santos syndrome) described by members of our group in 2008, a condition characterized by fibular agenesis/hipoplasia and ungual hypoplasia⁄anonychia, among other limb defects. Linkage study by SNP-array and microsatellite markers was performed and Lod score calculation pointed to two candidate regions on chromosome 3. Search for candidate genes revealed the WNT7A as the best candidate. Mutations in WNT7A gene, in homozygous state, are known to cause two other limb defect syndromes, Fuhrmann syndrome and AARRS (Al-Awadi/Raas-Rothschild syndrome), both presenting similar phenotypes to Santos syndrome. Sanger sequencing showed a novel variant, in homozygous state, c.934G>A (p.Gly312Ser) in the WNT7A gene in five out of six affected individuals. One affected individual, much less severely affected than his relatives, carries the mutation in heterozygous state. He does not present fibular or ungual malformations, characteristic signals of the syndrome; instead, he is the carrier of a complex polydactyly in his left hand. This is the first report about a heterozygous variant in WNT7A gene resulting in limb defect. Whole exome sequencing was performed with the samples from two affected individuals. However, no other variant in candidate gene to explain the limb defects was detected. We concluded that Santos syndrome is caused by a mutation in the WNT7A gene. Functional assays, based on Luciferase activity, are in execution to test the deleterious effect of the c.934G>A variant in the WNT7A gene

Deficiência intelectual (DI) é um distúrbio frequente do neurodesenvolvimento que afeta ~1% da população mundial e a causa genética é desconhecida em grande parte dos casos. O sequenciamento de exoma é uma ferramenta valiosa na elucidação da etiologia da DI e foi utilizada neste trabalho para investigar 25 famílias com dois ou mais indivíduos afetados. Nosso objetivo foi identificar novos genes ou variantes em genes já conhecidos que pudessem explicar a DI nessas famílias. Identificamos variantes que podem explicar a DI em nove das 25 famílias (36%); três variantes em genes já associados a DI de herança autossômica dominante (SETBP1, MED13L e MBD5), duas em um gene já associado a DI de herança autossômica recessiva (CDK5RAP2 - heterozigose composta) e cinco em genes de herança ligada ao X (UBE2A, MED12, SCL6A8, ARHGAP4 e PHF6). Nenhuma dessas variantes havia sido previamente descrita. O gene ARHGAP4 aparece como um novo candidato e novos estudos serão necessários para estabelecer seu papel na DI. No gene PHF6, a variante identificada mapeia na região 3´UTR e potencialmente interfere com as interações de miRNA reguladores. A variante no gene SETBP1, que apresenta padrão de herança dominante, foi detectada em duas irmãs, indicando que um genitor seria portador obrigatório; essa variante foi detectada em 0,13% das células de sangue periférico da mãe com a utilização da técnica de PCR digital. Essa variante em SETBP1, juntamente com as variantes em MED13L e no gene MBD5, salientam a contribuição de mosaicismo gonadal assim como genitor também com quadro clínico na DI de herança autossômica dominante. A repetição da DI nas irmandades foi essencial para determinar a patogenicidade das variantes identificadas do tipo missense. Dois irmãos portadores de variante missense ainda não descrita no gene UBE2A apresentavam quadro clínico atipicamente leve, trazendo dúvidas sobre a patogenicidade dessa variante; o estudo funcional do gene demonstrou que a mutação de fato prejudicava a função da proteína. Embora estudos funcionais sejam o padrão-ouro para determinar a patogenicidade de uma variante, é difícil sua implementação na rotina diagnóstica / Intellectual deficiency (ID) is a common neurodevelopmental disorder affecting ~1% of the world population, and in which the genetic underlying condition is not determined in many cases. Whole exome sequencing is a valuable tool to elucidate ID etiology and was used in the present work to investigate 25 families with two or more affected individuals. Our main goal was to identify either new genes or variants in already known genes that might explain ID in these families. We detected variants in nine out of the 25 families (36%), with three variants in autossomal dominant ID genes (SETBP1, MED13L e MBD5), two in an autossomal recessive ID gene (compound heterozygote - CDK5RAP2) and five in X-linked ID genes (UBE2A, MED12, SCL6A8, ARHGAP4 e PHF6). None of the variants had been previously described. ARHGAP4 emerged as a new candidate gene and further studies are needed to establish its role in ID. In PHF6, the identified variant mapped to the 3\'UTR region and potentially interferes with miRNA interactions. The variant in SETBP1, which segregates as an autossomal dominant, is present in two sisters, indicating that one parent is an obligate carrier; in fact, the variant was only identified in 0.13% of the mother\'s blood cells after using digital PCR. This case, together with the variants in MED13L and MBD5, highlight the contribution of gonadal mosaicism and affected parent in the autossomal dominant ID. The ID reccurrence in the sibships was essential to determine the putative pathogenicity of missense variants. Two affected brothers carrying a novel missense variant in UBE2A exhibited an atypically mild phenotype, and raised questions regarding the pathogenicity of this variant; associated functional studies showed that the variant impairs gene function. Although functional studies are the gold standard to determine a variant pathogenicity, its implementation as a diagnostic routine is still difficult

As fissuras orofaciais, ou fissuras labiopalatinas, são malformações prevalentes na população mundial, presente em cerca de um a cada 700 nascimentos. Dentro das fissuras orofaciais, um grupo etiologicamente distinto é composto pelas fissuras de lábio com ou sem fissura de palato, que, em 70% dos casos, não estão associadas a nenhuma comorbidade (fissuras de lábio com ou sem palato não sindrômicas, FL/P NS). A etiologia das FL/P NS é complexa, e em muitos casos apresenta herança multifatorial. A contribuição genética para as FL/P NS, embora sabidamente relevante, ainda é pouco conhecida. Ainda, os loci de suscetibilidade consistentemente associados às FL/P NS, não conferem um risco que explique a herdabilidade total da doença. O objetivo do presente trabalho foi investigar, por meio de diferentes estratégias, variantes de risco às FL/P NS. Utilizando sequenciamento de exoma em casos familiais, verificamos que o gene codificante da caderina epitelial, CDH1, contribui importantemente com variantes raras de efeito moderado a alto na etiologia das FL/Ps. Além disso, propusemos que também podem ter relevância etiológica genes envolvidos na via de polaridade planar celular, transição epitélio-mesênquima, adesão celular, regulação de ciclo celular ou de interação com microtúbulos. Por meio de um estudo de associação com correção para estratificação populacional, caracterizamos o intervalo de associação da região 8q24, o principal locus de suscetibilidade às FL/P, e identificamos associação significativa também para a região 20q12. Por fim, combinando o estudo de associação com mapeamento de eQTLs, encontramos pela primeira vez a associação entre marcadores na região 2p13, que regulam MRPL53, em FL/P NS. Em conclusão, este trabalho contribui para o melhor entendimento da relevância de variantes raras, de efeito moderado a alto, e comuns, de efeito pequeno, na etiologia das FL/P NS / Orofacial clefts (or cleft lip/palate) are congenital malformations with high prevalence in population (∼1:700 births). Among the orofacial cleft types, an etiologically distinct group is composed by cleft lip with or without cleft palate, which, in 70% of cases, is not accompanied by other malformations (nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate, NSCL/P). NSCL/P presents complex etiology, often with multifactorial inheritance. Although important, the genetic contribution to NSCL/P is still poorly comprehended, and the susceptibility loci that have been associated with NSCL/P do not explain the totality of the disease\'s heritability. In light of this, our aim was to investigate risk variants for NSCL/P by means of different strategies. With exome sequencing for NSCL/P familial cases, we report that the epithelial cadherin-encoding gene contributes with rare, moderate-to-high risk variants to NSCL/P etiology. In addition, we suggest an etiological contribution of genes laying in planar cell polarity pathway, or involved with epithelial-mesenchymal transition, cell adhesion, cell cycle regulation, and interaction with microtubules. Using structured association approach, we narrowed the associated interval of 8q24 region in a Brazilian population, and also validated the association for 20q12. Finally, by combining association analysis with eQTL mapping, we found association of regulatory variants of MRPL53, in 2p13, with NSCL/P. In conclusion, this study contributes with a deeper comprehension of the etiological role of rare and common variants for NSCL/P

As fissuras orofaciais, ou fissuras labiopalatinas, são malformações prevalentes na população mundial, presente em cerca de um a cada 700 nascimentos. Dentro das fissuras orofaciais, um grupo etiologicamente distinto é composto pelas fissuras de lábio com ou sem fissura de palato, que, em 70% dos casos, não estão associadas a nenhuma comorbidade (fissuras de lábio com ou sem palato não sindrômicas, FL/P NS). A etiologia das FL/P NS é complexa, e em muitos casos apresenta herança multifatorial. A contribuição genética para as FL/P NS, embora sabidamente relevante, ainda é pouco conhecida. Ainda, os loci de suscetibilidade consistentemente associados às FL/P NS, não conferem um risco que explique a herdabilidade total da doença. O objetivo do presente trabalho foi investigar, por meio de diferentes estratégias, variantes de risco às FL/P NS. Utilizando sequenciamento de exoma em casos familiais, verificamos que o gene codificante da caderina epitelial, CDH1, contribui importantemente com variantes raras de efeito moderado a alto na etiologia das FL/Ps. Além disso, propusemos que também podem ter relevância etiológica genes envolvidos na via de polaridade planar celular, transição epitélio-mesênquima, adesão celular, regulação de ciclo celular ou de interação com microtúbulos. Por meio de um estudo de associação com correção para estratificação populacional, caracterizamos o intervalo de associação da região 8q24, o principal locus de suscetibilidade às FL/P, e identificamos associação significativa também para a região 20q12. Por fim, combinando o estudo de associação com mapeamento de eQTLs, encontramos pela primeira vez a associação entre marcadores na região 2p13, que regulam MRPL53, em FL/P NS. Em conclusão, este trabalho contribui para o melhor entendimento da relevância de variantes raras, de efeito moderado a alto, e comuns, de efeito pequeno, na etiologia das FL/P NS / Orofacial clefts (or cleft lip/palate) are congenital malformations with high prevalence in population (∼1:700 births). Among the orofacial cleft types, an etiologically distinct group is composed by cleft lip with or without cleft palate, which, in 70% of cases, is not accompanied by other malformations (nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate, NSCL/P). NSCL/P presents complex etiology, often with multifactorial inheritance. Although important, the genetic contribution to NSCL/P is still poorly comprehended, and the susceptibility loci that have been associated with NSCL/P do not explain the totality of the disease\'s heritability. In light of this, our aim was to investigate risk variants for NSCL/P by means of different strategies. With exome sequencing for NSCL/P familial cases, we report that the epithelial cadherin-encoding gene contributes with rare, moderate-to-high risk variants to NSCL/P etiology. In addition, we suggest an etiological contribution of genes laying in planar cell polarity pathway, or involved with epithelial-mesenchymal transition, cell adhesion, cell cycle regulation, and interaction with microtubules. Using structured association approach, we narrowed the associated interval of 8q24 region in a Brazilian population, and also validated the association for 20q12. Finally, by combining association analysis with eQTL mapping, we found association of regulatory variants of MRPL53, in 2p13, with NSCL/P. In conclusion, this study contributes with a deeper comprehension of the etiological role of rare and common variants for NSCL/P