Die Plasmaproteine dienen dem Körper u.a. als Transportproteine. Dem Serumal-bumin kommt hierbei die größte Bedeutung zu. Aufgrund seiner Aufgabe weist es eine Reihe unterschiedlicher Bindungsstellen für eine Vielzahl unterschiedlichster Liganden auf, wobei die Bindung von Substanzen sowohl an spezifischen Stellen als auch unspezifisch erfolgen kann. Das Ausmaß dieser Bindungen hat Einfluss auf andere pharmakokinetische Parameter, wie die Bioverfügbarkeit und die Elimination eines Arzneistoffes. Treten mehrere Stoffe in Wechselwirkung mit dem Albumin, so können sich diese gegenseitig in ihrer Bindung beeinflussen. Das Ausmaß der Beeinflussung ist von der Höhe der Bindung der einzelnen Stoffe und dem zugrunde liegenden Bindungsmechanismus abhängig. Die klinische Relevanz der Beeinflussung hängt von der therapeutischen Breite und von zusätzlich auftretenden Wechselwirkungen, der Substanzen wie z.B. wechselseitige Inhibition der Stoffwechselenzyme der Substanzen ab. Für die experimentelle Bestimmung der Proteinbindung stehen eine Reihe von Me-thoden zur Verfügung, die sich im Messprinzip, dem apparativen Aufwand und der Simulation der physiologischen Bedingungen unterscheiden. In der vorliegenden Arbeit wurde die kontinuierliche Ultrafiltration verwendet. Diese stellt die Bedingungen im Körper nach und ermöglicht die Bindungskinetik besser zu betrachten als andere Verfahren, da durch die Titration des Albumins mit der Arzneistofflösung die Wechselwirkung zwischen Arzneistoff und Protein über einen breiten Konzentrationsverlauf beobachtet werden. Die Methode wurde von Heinze etabliert, von Albert weiterentwickelte und jetzt opti-miert. Durch die Konstruktion neuer Messzellen sowie der Entwicklung eines neuen Puffersystems konnte sie für Substanzen zugänglich gemacht werden, die aufgrund ihrer hohen Lipophilie und ihrer starken Adsorption an die Messzellen bisher nicht messbar waren. Darüber hinaus wurden die folgenden Untersuchungen durchgeführt: a) Es wurde die gegenseitige Verdrängung von zwei Arzneistoffen aus der Proteinbindung untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich eine Reihe basischer Arzneistoffe durch saure Arzneistoffe verdrängen ließ, so z.B. Imipramin HCl durch Phenprocoumon. Das dem Phenprocoumon strukturell sehr ähnliche Warfarin rief diese Verdrängung hingegen nicht hervor. Tryptophan, das in HPLC Experimenten die Bindung von Imipramin HCl verringerte [117], hatte im Ultrafiltrationsexperiment keinen Einfluss auf dessen Bindung. Die gegenseitige Beeinflussung zweier Stoffe kann folglich sehr unterschiedlich sein und ist schwer vorhersagbar. Des Weiteren sind die Ergebnisse solcher Bestimmungen stark von der gewählten Methode abhängig und dadurch nur schwer zu vergleichen. Aufgrund der komplexen und uneinheitlichen Wechselwirkungen der basischen und sauren Arzneistoffe in Bezug auf ihre Bindung, kann davon ausgegangen werden, dass basische Arzneistoffe eine Bindestelle an Albumin besitzen. Jedoch lässt sich aus der vorliegenden Messung nicht beurteilen, wie spezifisch basische Stoffe an Albumin binden. b) Es konnte gezeigt werden, dass unterschiedliche Derivate des Acetylcysteins, die kovalent an Cys34 binden können, unterschiedliche Veränderung im Bindungsverhalten von Albumin hervorrufen. So nahm die Bindung des Diphenhydraminhydrochlorids in Gegenwart von äquimolaren Mengen Acetylcystein und Cysteamin ab, während die Anwesenheit von Acetylcysteamin den gegenteiligen Effekt hatte. Dies zeigt, dass der Veränderung der Bindung ein komplexerer Zusammenhang als die reine Belegung des Cys34 zugrunde liegen muss. c) Unterschiede in der Proteinbindung von Ephedrin und seiner Stereoisomere konnten mittels kontinuierlicher Ultrafiltration bestätigt werden. Die Abweichungen in den Ergebnissen in Bezug auf andere Bestimmungsmethoden [130-132] zeigten erneut, wie stark die Messung der Proteinbindung von den Versuchsbedingungen abhängt. d) Für die Messung des antiinfektiven Bisnaphthalimids MT02 wurde eine Messzelle aus PVDF konstruiert, die weniger Wechselwirkungen mit adsorbierenden Arzneistoffen zeigt. Aufgrund der Unbeständigkeit der Substanz unter den Versuchsbedingungen war die Messung dennoch nicht möglich. e) Die Proteinbindung des Naphthylisochinolins GB AP05 konnte mit Hilfe der bereits erwähnten neu konstruierten Messzelle bestimmt werden. Die Bindung war deutlich höher als bei anderen Vertretern dieser Gruppe. Die Ursache hierfür könnte in der Adsorption der Substanz an die Messzellen begründet sein. Da GB AP05 stark an den Kunststoff PMMA binden kann, der aufgrund seiner Beschaffenheit vorwiegend Wasserstoffbrückenbindungen für eine Adsorption bereitstellen kann, ist eine hohe Bindung an Albumin, das eine Vielzahl von Bindestellen mit unterschiedlichen chemischen Gruppen aufweist, nicht unwahrscheinlich. f) Für eine Reihe von Fluorchinoloncarboxamiden wurde das Ausmaß ihrer Protein-bindung bestimmt. Dieses lag in fast allen Fällen bei 80 % oder höher. Die einzigen Ausnahmen, GHQ237Ox und GHQ243Ox, legen den Schluss nahe, dass eine basi-sche Seitenkette in Position 1 und das Fehlen des Fluorsubstituenten in Position 6 die Bindung reduzieren können. Da nicht alle Substanzen in der Pufferlösung gelöst werden konnten, wurde neben dem bereits durch Albert etablierten DMSO-haltigen Puffer ein Polysorbat 20 haltiger entwickelt, in dem hoch lipophile Substanzen mizellar gelöst werden können. Durch Bestimmung der Proteinbindung von Carbamazepin konnte gezeigt werden, dass die Anwesenheit der Mizellen keinen Einfluss auf die Bindung hat, d.h. im Umkehrschluss dass die Methode zur Bestimmung des Ausmaßes der Proteinbindung geeignet ist. / Amongst others, plasma proteins serve as transport proteins in the human body, se-rumalbumin being the most important of them. Serumalbumin features a set of different binding sites for numerous different ligands, enabling the binding of substances either to specific binding sites or in unspecific manners. The extent of protein binding affects other pharmacokinetic parameters such as bioavailability and the elimination of a drug. In the case several substances interact with albumin simultaneously, they can mutually interfere with their respective binding behaviors. The degree of interference depends on the extent of the protein binding of the single substances and the underlying binding characteristics. The clinical relevance depends on the therapeutic index and on additional interactions of the substances with corresponding enzymes. In order to evaluate the protein binding experimentally, a number of different methods can be used which differ in the principle of the determination, technical effort and the simulation of the physiological conditions. The measurements in this present thesis were performed using the continuous ultra filtration (CUF). CUF is able to imitate the conditions within the human body and displays binding kinetics in a better way than other available procedures do. This is because titration of albumin with a drug solution allows studying of the interactions between the active substance and the protein within a wide range of concentration. In the context of this thesis, the procedures established by Heinze and refined by Al-bert were optimized. By constructing of new measuring cells as well as developing a new buffer system, the procedure could be expanded onto substances which could previously not be measured due to their high lipophilicity and their strong adsorption to the measuring cells. Apart from that, the following measurements were conducted: a) The mutual displacements of two pharmaceuticals from protein bindings were analyzed. It could be shown that a number of cationic drugs can be displaced by acidic drugs, e.g. imipramin-HCI can be displaced by phenprocoumon. In turn, Warfarin resembling phenprocoumon did not cause a displacement. Tryptophan, though being able to reduce binding of Imipramin-HCI in HPLC experiments, had no impact on the binding of Imipramin-HCI when ultra-filtrated [117]. Mutual displacement of two substances can therefore take place in quite different ways and is difficult to predict. Furthermore, the results of these measurements strongly depend on the chosen procedure which makes it difficult to compare them to each other. Due to the complex and inconsistent interactions between albumin and anionic acidic drugs with regard to their bindings, it can be assumed that cationic basic drugs have a binding site for albumin. The measurement, however, could not show a specific affinity between the binding site and cationic substances. b) It could be shown that different derivatives of acetylcysteine, which are able to bind covalently to Cys34, can cause different changes in the binding behaviors of albumin. The affinity of dipenhydramin HCl to albumin, for instance, decreased in the presence of equimolar amounts of acetylcysteine and cysteamine whereas the presence of acetylcysteamine has an opposite effect. This shows that the changing of the binding must be caused by a more complex process than the simple occupation of Cys34 only. c) Differences in the protein binding of ephedrine and its stereoisomeres could be confirmed by using CUF. Comparing the results of CUF with those of other methods [130-132] again revealed that the extent of protein binding is highly dependent on the experimental conditions. d) The measurement of the antiinfective bisnaphthalimide MT02 needed the design of a new ultra filtration cell with a lower degree of interaction with adsorbing pharmaceuticals. However, the measurements failed due to the instability of the substance under test conditions. e) The extent of protein binding of naphthylisoquinoline GB-AP05 could be determined using the aforementioned ultra filtration cell. The binding was significantly higher than those of other compounds of this group. However this was due to the adsorption of the substance to the ultra filtration cell. Because GB-AP05 has a strong preference to bind to the synthetical PMMA which mainly provides hydrogen bonds for adsorption it is quite likely for GB-AP05 to bind to albumin which has numerous binding sites for various chemical groups. f) Finally the degree of protein binding of fluoroquinolonecarboxamids was deter-mined. Mostly the extent of protein binding was up to 80% and higher. The only ex-ceptions, GHQ237Ox and GHQ243Ox suggest that a basic side group in position 1 and the missing of a fluorine substituent in position 6 reduce the binding. Due to the fact that some of the substances could not be dissolved in the buffer solu-tion, a buffer containing polysorbate-20 was developed which enables the micellar dissolving of highly lipophilic substances. By determination of the protein binding of carbamazepin it could be shown that the presence of the micell had no impact on the binding and this buffer can be used for determination of the extent of protein binding.

Zur Bestimmung der Bindungsaffinität von Liganden zu den Plasmaproteinen, insbesondere Albumin, wurden über die Jahre zahlreiche Methoden entwickelt. Die Grundlage dieser Arbeit war die Bestimmung der Plasmaproteinbindung der Ephedra-Alkaloide unter Verwendung einzelner dieser etablierten Methoden. Aufgrund ihres Anwendungsgebiets als Notfallmedikation bei Anästhesie-bedingter Hypotonie und den damit verbundenen Anforderungen an die Pharmakokinetik, sollten die Ephedra-Alkaloide niedrig-affine Liganden der Plasmaproteine darstellen. In der Literatur und in vorhergehenden Arbeiten wurden für die Ephedra-Alkaloide jedoch sehr unterschiedliche, teilweise der Indikation widersprechende Affinitäten bestimmt. Daher sollte im Rahmen dieser Arbeit das Ausmaß der Plasmaproteinbindung der Ephedra-Alkaloide weiter untersucht und die Affinität zu Albumin bzw. anderen Plasmaproteinen im humanen Serum bestimmt werden. Neben der Affinität sollte auch die Stereoselektivität der Bindung genauer betrachtet werden, die bei der Bindung vieler Wirkstoffe eine Rolle spielt. Als Referenzmethode diente die kontinuierliche Ultrafiltration, die auch schon bei Hörst verwendet wurde. Folgende Schlussfolgerungen konnten aus den Ergebnissen dieser Arbeit gezogen werden: 1) Die Ergebnisse der kontinuierlichen Ultrafiltration zeigten, dass die Ephedra-Alkaloide, Ephedrin und Pseudoephedrin, ein nur geringes Ausmaß an Plasmaprotein-bindung von 4 – 9 % gegenüber bovinem und humanem Serumalbumin zeigen. Eine deutlich höhere Plasmaproteinbindung von 19 – 37 % konnte hingegen bei der Verwendung von humanem Serum bestimmt werden. Die Affinität von Pseudoephedrin war dabei jeweils geringer als die von Ephedrin. 2) Diese Ergebnisse mit humanem Serum und die Tatsache, dass Albumin vorwiegend saure Stoffe bindet, legen nahe, dass die Ephedra-Alkaloide vermehrt an andere Plasmaproteine in Serum binden. Erste Messergebnisse mit saurem α1 Glykoprotein bestätigen diese Vermutung. 3) Eine Stereoselektivität konnte nur in geringem Maß bei (+) Ephedrin beobachtet werden, wobei der Unterschied nur im Serum signifikant ist. Pseudoephedrin dagegen zeigte keinerlei Stereoselektivität. Diese Beobachtung passt zu den Schlussfolgerungen der Pfeiffer‘schen Regel zur Stereoselektivität einer Bindung. 4) Andere Sympathomimetika mit einer zusätzlichen Phenolgruppe im Molekül zeigen eine ähnlich niedrige Affinität zu Albumin von ca. 10 %. Eine zusätzliche Phenolgruppe scheint die sauren Eigenschaften des Liganden nicht ausreichend zu erhöhen, um die Affinität zu Albumin signifikant zu steigern. 5) Das tertiäre Kohlenstoffatom am Stickstoff des Ephedrins scheint in gewisser Weise an der Bindung zu Albumin beteiligt zu sein. Sympathomimetika mit einer zusätzlichen Methylgruppe an diesem Kohlenstoffatom, wie Ephedrin, Pseudoephedrin und Oxilofrin, zeigen eine größere Streuung der Messergebnisse. Eine zusätzliche Methylgruppe in dieser Position scheint die Bindung daher sterisch zu hindern. 6) Die Ergebnisse der diskontinuierlichen Ultrafiltration bestätigen weitestgehend die Ergebnisse der kontinuierlichen Ultrafiltration 7) Eine Bestimmung des Ausmaßes der Plasmaproteinbindung von niedrig-affinen Stoffen ist mit den anderen orthogonalen Methoden ACE, NMR und iTC nicht möglich. Diese drei verwendeten Methoden trennen nicht wie die klassischen Methoden den gebundenen vom ungebundenen Wirkstoff, sondern beruhen auf einer Veränderung bestimmter Messparameter: bei der ACE die Migrationszeit, bei der NMR-Spektroskopie die chemische Verschiebung der Signale bzw. der Diffusionskoeffizient und bei der iTC die frei werdende Bindungswärme. Bei allen drei Methoden war die Änderung der Messgröße aufgrund der niedrigen Plasmaproteinbindung zu gering, um auswertbar zu sein. 8) Eine Störgröße bei die orthogonalen Methoden war vielfach auch das Albumin selbst bzw. dessen Eigenschaften. Bei der Affinitäts-Kapillarelektrophorese sind physiologische HSA-Konzentrationen wegen des starken Basislinienrauschens nicht messbar. Zudem bewirkt der Albuminzusatz im Trennpuffer eine Viskositätsänderung, die den EOF verlangsamt und so die Messung stört. Bei der NMR-Spektroskopie können wegen der Überlagerung der Signale durch die breiten Albuminbanden weder Veränderungen in der chemischen Verschiebung noch des Diffusionskoeffizienten zuverlässig bestimmt werden. In der iTC erschwerte die Schaumbildung der Lösung, die durch die Oberflächenaktivität des Albumins verursacht wird, die Messung. In dieser Arbeit konnte somit das Ausmaß der Plasmaproteinbindung der Ephedra-Alkaloide mit verschiedenen Methoden erfolgreich bestimmt werden. Damit bestätigte diese Arbeit, dass die Ephedra-Alkaloide, wie deren Indikation vermuten lässt, zu den niedrig affinen Liganden des Albumins zählen. Um genauer eingrenzen zu können durch welche Plasmaproteine im Blutserum die Ephedra-Alkaloide transportiert werden, sollten die Untersuchungen zum sauren α1-Glykoprotein fortgesetzt und gegebenenfalls durch weitere Bestimmungen mit anderen Plasmaproteinen ergänzt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit haben auch gezeigt, dass viele der unzähligen Methoden zur Untersuchung der Plasmaproteinbindung bei der Bestimmung von niedrig affinen Liganden ihre Grenzen haben. Nach wie vor sind zur Bestimmung einer niedrigen Bindungsaffinität weiterhin die klassischen Methoden, wie die kontinuierliche Ultrafiltration, Mittel der Wahl. Nicht zuletzt deshalb erfreuen sich diese Methoden auch heute noch großer Beliebtheit. / Over the years many methods have been developed to determine the binding affinity of ligands towards the plasma proteins, especially to albumin. The focus of this thesis was the determination of the plasma protein binding of the Ephedra alkaloids using several of those long established methods. Due to their application as emergency drugs for anaesthetic induced hypotension and the associated demands on pharmacokinetics, Ephedra alkaloids should display a low binding affinity towards plasma proteins. Yet in literature and in previous studies the Ephedra alkaloids showed a great variety of binding affinities, in parts even contradictory to their indication. Therefore the Ephedra alkaloids’ extent of plasma protein binding was further examined and the affinity towards albumin and other plasma proteins in human serum determined in the course of this study. Next to its affinity the bindings’ stereoselectivity was analysed as well, playing an important role in the binding of many drugs. The continuous ultrafiltration served as a reference method formerly also used by Hörst. The following conclusions can be drawn from the results of this study: 1. The results of the continuous ultrafiltration experiments show that the Ephedra alkaloids, ephedrine and pseudoephedrine, only have a low extent of 4 – 9 % of plasma protein binding towards bovine and human serum albumin. However using human serum a significantly higher plasma protein binding of 19 – 37 % can be measured. The affinity of pseudoephedrine was lower than ephedrine each time. 2. These results with human serum and the fact that albumin mainly binds acidic substances leads to the conclusion that Ephedra alkaloids principally bind to other plasma proteins in serum. First findings with α1 acid glycoprotein corroborate this hypothesis. 3. A minor stereoselectivity was observed only for (+) ephedrine, although the difference was merely significant in human serum. Pseudoephedrine on the other hand didn’t display any kind of stereoselectivity. These observations coincide with the reasoning of Pfeiffer’s rule regarding the stereoselectivity of binding. 4. Other sympathomimetics with an additional phenolic group in the molecule demonstrate a similar low binding affinity towards albumin of approx. 10 %. An additional phenolic group doesn’t seem to elevate the acidity of the ligand sufficiently in order to increase the affinity towards albumin significantly. 5. The tertiary carbon atom bound to the nitrogen in ephedrine appears to be involved in the binding to albumin in some way. Measured results display a higher variance for sympathomimetics with an additional methyl group in this position like ephedrine, pseudoephedrine and oxilofrine. The additional methyl group seems to hinder the binding sterically. 6. The results of the discontinuous ultrafiltration confirm the results of the continuous ultrafiltration experiments for most parts. 7. The determination of the extent of plasma protein binding is not feasible with the other orthogonal methods ACE, NMR and iTC for low affinity ligands. Those three methods don’t rely on the separation of bound and unbound drug as the classical methods do. Instead they are based on the alteration of certain measuring parameters: for the ACE it’s the migration time, in NMR spectroscopy it’s the chemical shift or the diffusion coefficient and using iTC it’s the released binding heat. For all three methods the change of those parameters was too low to be evaluable. 8. One disturbance with the orthogonal methods was often albumin itself or its properties. In affinity capillary electrophoresis physiological HSA concentrations are not measureable due to the high background noise caused by albumin. Furthermore the addition of albumin in the background electrolyte leads to a change in viscosity, slowing the EOF and thus falsifying the measurement. Using NMR spectroscopy neither changes in the chemical shift nor the diffusion coefficient can be reliably determined due to overlap of the albumin and ligand signals. During iTC experiments the foaming of the solution caused by the surface activity of albumin itself hinders the measurement. In summary the extent of plasma protein binding was successfully determined for the Ephedra alkaloids using different measuring techniques. Thereby this study confirmed that the Ephedra alkaloids are low affinity ligands of albumin as was suggested by their current use in drug therapy. To narrow down by which plasma proteins the Ephedra alkaloids are transported in serum further analysis with α1 acid glycoprotein and if applicable with other plasma proteins is necessary. The results of this study also show that countless methods for determining the extent of plasma protein binding fail to produce reliable results for low affinity ligands. After all the classical methods such as continuous ultrafiltration are still the methods of choice when it comes to determine low affinity binding. If nothing else this is the reason why those methods are still so popular to date.