Les bactéries du genre Shigella sont responsables de la dysenterie bacillaire, ou shigellose, chez l'être humain, causant plus de 125 millions d'épisodes et 14 000 morts par an. Cette infection est caractérisée par l'inflammation et la destruction de la muqueuse intestinale. La bactérie utilise un système de sécrétion de type III (SST3) pour manipuler la physiologie des cellules épithéliales intestinales et du système immunitaire favorisant l'invasion de la muqueuse et enrayant la mise en place d'une réponse adaptative efficace. Le SST3 peut être comparé à une seringue moléculaire traversant la paroi bactérienne sous la forme d'anneaux membranaires, contenant une tige interne (MxiI), et d’une aiguille extracellulaire (MxiH). L'assemblage de cette dernière se termine par la mise en place d'un complexe d'extrémité formé par plusieurs copies des protéines IpaD et IpaB. Le SST3 prend en charge différentes classes de substrats à sa base via un complexe protéique comprenant l'ATPase Spa47. Les translocateurs (IpaB et IpaC) sont les premiers substrats à être sécrétés. Ceux-ci sont stockés dans le cytoplasme en complexe avec leur chaperon IpgC et sont recrutés à l'extrémité de l'aiguille lors du contact avec la membrane de la cellule hôte pour y former un pore à l'aide de la protéine IpaD. Ce pore permet l'injection des autres substrats du SST3 (effecteurs) qui vont interférer avec les voies de signalisation cellulaire. Il existe deux classes d'effecteurs, les effecteurs précoces (dont OspD1) stockés au préalable dans le cytoplasme et sécrétés suite au contact cellulaire. Ce contact active l’expression des effecteurs tardifs via un couplage assuré par deux complexes, OspD1-MxiE et translocateurs-IpgC. La sécrétion d’OspD1 et des translocateurs libère leurs partenaires qui agissent comme activateurs transcriptionnels. La régulation de la sécrétion dépend de plusieurs acteurs situés dans les différentes parties du SST3. Le complexe d'extrémité et la protéine MxiC contrôlent la sécrétion aux niveaux extra- et intracellulaires alors que l'aiguille transmettrait le signal de sécrétion entre ces deux complexes. Ce paradigme reste cependant encore peu compris et le mode de fonctionnement du complexe d’extrémité et de la protéine MxiC reste à éclaircir.<p>Nos travaux menés sur la protéine IpaD nous ont permis de mettre en évidence un phénotype de sécrétion intermédiaire. Celui-ci est caractérisé par la sécrétion des translocateurs et des effecteurs précoces, sans toutefois observer de sécrétion d’OspD1 et des effecteurs tardifs, suggérant un mécanisme de discrimination entre OspD1 et les effecteurs précoces. Ce phénotype de sécrétion est similaire à celui induit par l’interaction IpaD-désoxycholate. En effet, les variants d’ipaD restant fonctionnels pour la mise en place du pore provoquent également une augmentation de l’insertion des translocateurs et du pouvoir invasif. Nous avons également identifié la région d’IpaD nécessaire au maintien d’IpaB au niveau du complexe d’extrémité ainsi qu’un rôle de son domaine central dans l’insertion du pore. Nous avons enfin étudié l’effet d’anticorps monoclonaux anti-IpaD. Ces résultats nous ont permis de proposer un modèle de fonctionnement du complexe d’extrémité lors de l’insertion du pore, d’identifier les épitopes conférant une protection in vitro et in vivo ainsi que l’existence d’un polymorphisme qui empêche la liaison de ces anticorps à IpaD provenant d’autres sérotypes.<p>Notre étude sur MxiC a mis en évidence de nouveaux partenaires d’interaction (MxiI et IpgC). Ces résultats montrent que l’interaction MxiC-MxiI est nécessaire pour la régulation de la sécrétion des effecteurs précoces par MxiC. De même, la mutation mxiIQ67A provoque un phénotype similaire à la mutation mxiHK69A, ce qui suggère que le mécanisme de régulation impliquant l’aiguille est similaire pour la tige interne. Enfin, l’interaction renforcée MxiC-Spa47, via IpgC probablement couplée à un translocateur, apporte des pistes quant au rôle de MxiC dans la sécrétion des translocateurs.<p>Les rôles identifiés pour les différents régulateurs de la sécrétion ouvrent de nouvelles pistes pour la compréhension du fonctionnement du SST3. Leurs modes de fonctionnement restent cependant encore flous et nécessitent des études complémentaires.<p><p><p>Shigella are responsible for bacillary dysentery, or shigellosis, in human beings causing over 125 million episodes and 14 000 deaths per year. This infection is characterized by inflammation and destruction of the intestinal mucosa. The bacteria use a type III secretion system (T3SS) to manipulate the physiology of intestinal epithelial cells and the immune system favoring the invasion of the mucosa and halting the development of an efficient adaptive response. The T3SS can be compared to a molecular syringe that extends from the bacterial cell wall which contains an internal rod (MxiI), and an extracellular needle (MxiH). The assembly of the latter ends with assembly of a tip complex formed by multiple copies of IpaB and IpaD proteins. The T3SS recruits different classes of substrates at its base via a complex comprising the Spa47 ATPase. The translocators (IpaB and IpaC) are the first substrates to be secreted. They are stored in the cytoplasm in complex with their chaperone (IpgC) and are recruited at the needle tip upon contact with host cell membrane to form a pore via IpaD. This pore allows the injection of other substrates of the T3SS (effectors), which will interfere with the cellular signaling pathways. There are two classes of effectors, early effector (including OspD1) stored in the cytoplasm and secreted upon cell contact. This contact activates the expression of late effectors genes through a complex formed by MxiE (blocked by OspD1) and IpgC. Both proteins are released through OspD1 and translocators secretion. Secretion regulation depends on several actors located at different parts of the T3SS. The tip complex and the gatekeeper MxiC regulate secretion at the T3SS tip and base, the needle subunits transmitting a secretion signal between these two complexes. This paradigm, however, is still poorly understood and the operating mode of the tip complex and MxiC remains unclear.<p><p>Our work on IpaD protein allowed us to identify an intermediate secretion phenotype which is characterized by the secretion of translocators and early effector, but no secretion of OspD1 and late effectors, suggesting a discriminating mechanism between early effectors and OspD1. This secretion phenotype is similar to that induced by deoxycholate-IpaD interaction. Indeed, IpaD point mutants responsible for this phenotype cause an increase in the pore insertion and cell invasion. We also identified the region of IpaD necessary to maintain IpaB at the needle tip as well as a role of IpaD central domain in the pore insertion. We finally studied the effect of anti-IpaD monoclonal antibodies. These results allowed us to propose a working model of the tip complex end upon pore insertion, identify epitopes conferring protection in vitro and in vivo as well as the existence of a polymorphism that prevents the binding of these antibodies to IpaD from other serotypes.<p><p>Our MxiC study showed new interaction partners (MxiI and IpgC). These results showed that the MxiC-MxiI interaction is necessary for the regulation of early effectors secretion of by MxiC. Moreover, a mxiIQ67A mutation causes a phenotype similar to the mutation mxiHK69A, suggesting that the regulatory mechanism involving the needle is shared by the inner rod. Finally, the enhanced interaction MxiC-Spa47 through IpgC, probably in complex with a translocator, provides clues for the role of MxiC in translocators secretion.<p><p>The roles identified for the various regulators of secretion open up new avenues for understanding how the T3SS functions. Their ways of working are however still unclear and require further study.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Shigella flexneri est une bactérie à Gram négatif responsable du décès d’environ un million d’individus par an dont la majorité est des enfants âgés de moins de 5 ans. A ce jour, aucun vaccin satisfaisant n’est disponible et la résistance aux antibiotiques ne cesse dangereusement d’augmenter. Pour éradiquer la shigellose il est impératif de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires associés à la pathogénie de Shigella.<p>Dans le cadre de notre projet de thèse, nous nous sommes intéressés à la caractérisation de plusieurs gènes situés sur le plasmide de virulence de S. flexneri dont SfpgdA, Sfgtr4, virK et les gènes spa9, spa24 et spa29 localisés dans la région d’entrée spécifiant l’appareil de sécrétion de type 3 (AST3). Pour ce faire, nous avons dans un premier temps généré des souches de Shigella mutées (KO) de ces gènes et étudié ensuite leurs propriétés de virulence aussi bien in vitro, dans des modèles cellulaires, qu’in vivo, dans un modèle animal. Nos résultats montrent que le gène SfpgdA code pour une peptidoglycane (PG) déacétylase nécessaire à la survie de Shigella dans les polymorphonucleaire neutrophiles (PMNs). Nous avons également montré que le gène Sfgtr4 spécifie une lipopolysacharide (LPS) glycosyle transférase impliquée dans la résistance au lysozyme et dans la survie dans les PMNs. Des études antérieures avaient montré qu’une mutation à l’aide d’un transposon du gène virK abolissait la dissémination de Shigella entre les cellules épithéliales par un mécanisme restant inconnu. Afin d’investiguer ce mécanisme, nous avons construit un mutant non-polaire du gène virK et étudié son phénotype. A notre grand étonnement, nous avons démontré que ce mutant présente les mêmes propriétés de virulence que la souche sauvage de Shigella. Par contre, comme pour les gènes SfpgdA et Sfgtr4, nous avons montré que le mutant virK est également affecté dans sa résistance au lysozyme et dans sa persistance dans les PMNs. De plus, nous avons montré que l’ensemble des gènes SfpgdA, Sfgtr4 et virK, est impliqué dans la résistance au système immunitaire grâce à la régulation de la sécrétion des cytokines proinflammatoires TNF-α et IL-6. L’existence d’homologie frappante entre les 3 gènes étudiés et des gènes impliqués dans la formation de biofilm chez plusieurs bactéries nous a incités à investiguer cette propriété pour Shigella. Nous avons ainsi montré, pour la première fois, que la souche sauvage de Shigella forme des biofilms in vitro. De plus, nous avons montré que cette formation est accélérée dans les mutants SfpgdA, Sfgtr4 et virK. Finalement, nous avons identifié un réseau d’interactions entre SfPgdA, SfGtr4, VirK et MsbB2, suggérant l’existence d’un complexe localisé à la surface bactérienne qui serait responsable des modifications engendrées au niveau du PG et ou LPS. <p>Dans une autre partie de notre travail nous nous sommes intéressés aux gènes spa9, spa24 et spa29. Nous avons montré que ces 3 gènes sont nécessaires à la sécrétion des protéines de virulence et à l’invasion cellulaire. De plus, nous avons montré qu’un domaine central de la protéine Spa24 (Spa24SD) est nécessaire à l’assemblage de l’AST3 grâce à ces interactions avec différents composants de ce système.<p>La dernière partie de notre travail a porté sur l’étude du gène orf182 et du gène ushA qui existe en 2 copies dans le génome bactérien (un plasmidique et un chromosomique). Les souches de Shigella KO de ces gènes, dans les tests effectués in vitro, présentent approximativement le phénotype sauvage et devraient faire l’objet d’étude plus avancées. <p>En conclusion, nos travaux feront l’objet de 4 publications et représentent une contribution importante à la compréhension des mécanismes moléculaires associés à la pathogénie de Shigella. De plus, nos travaux dépasseront le cadre de Shigella puisque les gènes étudiés ici sont conservés chez plusieurs bactéries pathogènes.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Shigella provoque la dysenterie bacillaire en envahissant les muqueuses du colon. Cette maladie diarrhéique est responsable d’un million de décès par an essentiellement dans les pays en voie développement. Les gènes nécessaires àl’entrée dans les cellules hôtes sont regroupés sur un fragment d’ADN plasmidique de 30-kb. Celui-ci contient deux types de gènes, les gènes ipa(B, C et D) et ipgcodant pour des protéines responsables de l’entrée de la bactérie dans les cellules, et les gènes mxi/spacodant pour un système de sécrétion appelétype III (SST3) nécessaire àla sécrétion des facteurs de virulence. Les gènes mxi/spaetipa/ipgsont exprimés à37°C et les protéines Ipa/Ipgrestent dans le cytoplasme jusqu’àce que le SST3 soit activéau contact de la cellule hôte. Ce contact induit l’internalisation de la bactérie par macropinocytose, suivie de sa dissémination intra-et intercellulaire. Des observations en microscopie électronique (ME) montrent que le SST3 est composéde trois parties: i) une aiguille dont la longueur est régulée à50 nm par la protéine Spa32, ii) un corps basal qui traverse les membranes interneet externe ainsi que le peptidoglycane, et iii) un bulbe cytoplasmique. Le SST3 est le dispositif principal de virulence et permet l’injection de facteurs de virulences du cytoplasme bactérien vers celui de la cellule cible. Shigelladoit sécréter ces protéines de manière ordonnée. Très peu de travaux ont abordécette question. L’objectif principal de ce travail de thèse a étéd’étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans la hiérarchie de sécrétion.Nous avons principalement investiguéle rôle de 3 protéines: Spa32, Spa40 et MxiC dans la sécrétion. Nous avons montré, par des études génétiques, que contrairement aux études publiées sur les protéines homologues, Spa32 n’agit pas comme un «molecularruler»pour réguler la taille de l’aiguille. Nous avons montréque cette régulation nécessite l’interaction de Spa32 via ses résidus 206-246 au domaine C-terminal de Spa40 (Spa40C) (Botteaux et al. 2008a). Ayant identifiécette interaction avec Spa40, l’étape suivante de notre travail a portésur la caractérisation de la fonction du gène spa40par des méthodes génétique, biochimique et structurale (ME). Nos résultats montrent que Spa40 joue un rôle important dans l’assemblage du SST3. Des plus, nous avons mis en évidence de nouvelles interactions impliquant Spa40C et des composants du SST3 (Botteaux et al. in preparation).Parallèlement àces travaux, nous avons montréque l’inactivation du gène mxiCaboutit àune dérégulation spécifique de la sécrétion des effecteurs sans altérer celle des translocateurs IpaB et IpaC. Cette augmentation de sécrétion est due àune augmentation de transcription des gènes tardifs, conséquence de la sécrétion précoce de l’anti-activateur transcriptionnel, OspD1 (Botteaux et al. 2008b). De plus, nous avons montréque MxiC est un substrat de l’appareil de sécrétion et que cette sécrétion est associée àsa fonction. Finalement, la mise en évidence d’une interaction entre MxiC et Spa47, l’ATPase du SST3 nous permet de proposer un modèle régulant la hiérarchie de sécrétion des effecteurs.Dans une autre partie de notre travail, nous avons identifié, par des expériences de ME et d’immunomarquage, que l’invasineIpaD est localisée au sommet de l’aiguille du SST3 oùelle lui sert de bouchon. Enfin, de manière très intéressante, nous avons montréque des anticorps anti-IpaD neutralisent l’entrée de Shigelladans les cellules (Sani, Botteaux et al. 2007, dépôt de brevet). IpaD, étant conservée dans les isolats invasifs de Shigella, représente donc un réel candidat vaccinal pouvant pallier la diversitédes sérotypesbactériens.En conclusion, nos travaux représentent une contribution importante àla compréhension des mécanismes de virulence bactériens et dépassent le cadre de Shigellapuisque les systèmes de sécrétion sont hautement conservés parmi plusieurs pathogènes. L’identification de drogues pouvant interférer avec ces systèmes de sécrétion représente une voie d’avenir pour le développement de nouveaux agents anti-infectieux. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

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Diarrhoea, particularly infectious diarrhoea, in children below five years of age is recognised as one of the leading cause of morbidity and mortality throughout the world. This is especially true in residential areas of developing countries where there is substandard sanitation and overcrowding which are reservoirs for farther transmission. Shigellosis is endemic in developing countries and in Sub-Saharan Africa, including South Africa, a region where unique geographic, economic, political, sociocultural, and personal factors interact to create distinctive continuing challenges to prevention and control. Our study was undertaken to establish baseline information on incidences of Shigella, its serotype and resistant pattern of isolates from human faeces from residents of Johannesburg, South Africa. All stools received from January to April 2013 from the private health care system were cultured on standard media for isolation of Shigella and confirmed by standard biochemical reactions and serological method. Antibiotic sensitivity test was determined by the agar diffusion method. 11009 stool samples were assayed from patients aged between 22 days to 94 years with a 110 Shigella isolates yield, of which 47 (43%) were S. flexneri, 61 (55%) S. sonnei and 1 (1%) of S. dysentriae and S. boydii respectively. Majority of patients 76 (69%) were children between < 1 to 5 years old followed by those between 6 to 10 years 13(12%). Of the four species isolated from children of up to 10 years old, S. sonnie was confirmed in 52 cases (59%) and S. flexneri in 36 cases (41%). A total of 53 (48%) males and 57 (52%) females were infected. However, a hundred per cent susceptibility to ciprofloxacin and ceftriaxone but high levels of resistance to Co-trimoxazole (83%), tetracycline (72%), and ampicillin (26%) was noted. From the 110 isolates, 96 (87%) were resistant to one or more drugs while 14 (13%) were fully susceptible. These results show that S. sonnei followed by S. flexneri as predominating aetiology of shigellosis and Ceftriaxone and ciprofloxacin as effective drugs against all four Shigella species. / Health Studies / M. Sc. (Life Sciences)

Diarrhoea, particularly infectious diarrhoea, in children below five years of age is recognised as one of the leading cause of morbidity and mortality throughout the world. This is especially true in residential areas of developing countries where there is substandard sanitation and overcrowding which are reservoirs for farther transmission. Shigellosis is endemic in developing countries and in Sub-Saharan Africa, including South Africa, a region where unique geographic, economic, political, sociocultural, and personal factors interact to create distinctive continuing challenges to prevention and control. Our study was undertaken to establish baseline information on incidences of Shigella, its serotype and resistant pattern of isolates from human faeces from residents of Johannesburg, South Africa. All stools received from January to April 2013 from the private health care system were cultured on standard media for isolation of Shigella and confirmed by standard biochemical reactions and serological method. Antibiotic sensitivity test was determined by the agar diffusion method. 11009 stool samples were assayed from patients aged between 22 days to 94 years with a 110 Shigella isolates yield, of which 47 (43%) were S. flexneri, 61 (55%) S. sonnei and 1 (1%) of S. dysentriae and S. boydii respectively. Majority of patients 76 (69%) were children between < 1 to 5 years old followed by those between 6 to 10 years 13(12%). Of the four species isolated from children of up to 10 years old, S. sonnie was confirmed in 52 cases (59%) and S. flexneri in 36 cases (41%). A total of 53 (48%) males and 57 (52%) females were infected. However, a hundred per cent susceptibility to ciprofloxacin and ceftriaxone but high levels of resistance to Co-trimoxazole (83%), tetracycline (72%), and ampicillin (26%) was noted. From the 110 isolates, 96 (87%) were resistant to one or more drugs while 14 (13%) were fully susceptible. These results show that S. sonnei followed by S. flexneri as predominating aetiology of shigellosis and Ceftriaxone and ciprofloxacin as effective drugs against all four Shigella species. / Health Studies / M. Sc. (Life Sciences)

Les bactéries du genre Shigella sont responsables de la shigellose, une maladie diarrhéique invasive du colon. L’entrée et la dissémination de Shigella à travers l’épithélium colique sont médiées par un système de sécrétion de type III (SST3) codé par un plasmide de virulence. Au sein de ce plasmide se trouve une région de 30-kb comportant les gènes impliqués dans l’entrée de la bactérie dans les cellules hôtes. Ces gènes sont regroupés en deux loci :le locus ipa-ipg qui code pour les protéines sécrétées et leurs chaperons ainsi que le locus mxi-spa codant pour les composants de l’appareil de sécrétion de type III (AST3), constitué d’un bulbe cytoplasmique, d’un corps basal transmembranaire et d’une aiguille se projetant au niveau extracellulaire. Ce système permet la sécrétion ordonnée et hiérarchique de différentes classes de protéines et la translocation de certaines d’entre elles (appelées effecteurs) dans le cytoplasme de la cellule hôte où elles interfèrent avec les voies de signalisation cellulaires. Avant le contact avec la cellule hôte, l’AST3 est inactif et verrouillé par les protéines IpaB et IpaD formant le complexe d’extrémité.<p>Chez Shigella, le gatekeeper MxiC séquestre les effecteurs au niveau du cytoplasme bactérien avant la transmission par l’aiguille du signal d’activation de la sécrétion mais les composants intermédiaires liant l’aiguille à MxiC restaient inconnus. Au cours de ce travail, nous avons montré que MxiC forme un complexe avec la sous-unité de la tige interne, MxiI, afin de bloquer l’entrée du canal de sécrétion et que cette interaction est conservée chez Yersinia et Salmonella. Nous démontrons que, suite au contact cellulaire, la dissociation de ce complexe facilite le switch de sécrétion des translocateurs aux effecteurs. Nos résultats révèlent également que MxiC est capable de s’associer au chaperon IpgC afin de réguler la sécrétion des translocateurs. De plus, nous avons identifié les domaines de MxiC engagés dans la régulation du SST3 et rapporté un nouveau rôle de MxiC dans l’échappement aux macrophage impliquant une possible inhibition de la voie apoptotique classique afin de promouvoir une pyroptose. Chez Shigella, IpaD gouverne la composition du complexe d’extrémité et est impliqué dans la régulation de la sécrétion. Nous avons développé une étude phénotypique de ses régions coiled-coil et centrale et montré que la composition du complexe d’extrémité permet de définir à la fois l’état d’inductibilité de l’AST3 et la sécrétion des effecteurs tardifs. Par ailleurs, notre étude fonctionnelle des domaines de MxiC et IpaD suggère que les capacités de Shigella à échapper au macrophage et à insérer un pore de translocation ne sont pas strictement couplées. <p>La dernière partie de ce travail s’est focalisée sur la caractérisation de la protéine Spa13 de Shigella. Nous avons découvert que le défaut de sécrétion du mutant spa13 est dû à l’instabilité de la sous-unité MxiH de l’aiguille et que Spa13 n’est pas sécrété par le SST3. Nos résultats indiquent également un rôle de Spa13 dans l’escorte de chaperons et l’activation de l’appareil d’exportation afin de promouvoir la sécrétion des substrats./Shigella is the causative agent of shigellosis, also known as bacillary dysentery, an invasive disease of the human colonic epithelium. During infection, Shigella uses a type III secretion system (T3SS) to penetrate enterocytes and to disseminate into the colonic epithelium, leading to destruction of the mucosal lining and shigellosis symptoms. Most of the virulence factors of Shigella are encoded by a large plasmid harboring a 30-kb region that is sufficient to promote bacterial entry into host cells. This entry region is organized in two loci, one corresponding to the the ipa-ipg genes encoding the secreted proteins and their cognate chaperones while the other encodes Mxi-Spa proteins that form the type III secretion apparatus (T3SA), consisting of a cytoplasmic bulb, a basal body spanning the bacterial envelope and a hollow needle. The T3SS allows the ordered and hierarchical secretion of effectors by inserting a translocation pore in the host cell membrane through which effector proteins are injected into the cytosol. Before host cell contact, the T3SA is inactive and plugged by the tip complex proteins IpaB and IpaD. <p>In Shigella, the gatekeeper MxiC is known to sequester effectors within the cytoplasm prior to receiving the activation signal from the needle but the molecules involved in linking the needle and MxiC are unknown. We demonstrated that MxiC and the predicted inner-rod component MxiI form a complex plugging the T3SA entry gate and showed that this interaction is conserved in Yersinia and Salmonella. Dissociation of this complex seems to facilitate the switch in secretion from translocators to effectors upon host cell contact. Our results also revealed that MxiC binds to the chaperone IpgC to regulate translocators secretion. Moreover, we identified the domains of MxiC involved in the T3S regulation and reported a new role in macrophage escape by potential inhibition of the classical apoptosis to promote pro-inflammatory pyroptosis. <p>In Shigella, IpaD rules the composition of the tip complex and is involved in secretion control and translocon insertion. We therefore undertook a phenotypic analysis of its coiled-coil and central regions and showed that the composition of the tip complex defines both the T3SA inducibility state and late effectors secretion. Besides, our functional study on MxiC and IpaD domains suggests that Shigella abilities to escape macrophage vacuole and to insert the translocation pore are uncoupled.<p>The last part of this work is related to the characterization of the Spa13 protein of Shigella. We found that the secretion defect of the spa13 mutant is due to the instability of the needle component MxiH and that Spa13 is not a secreted substrat. Our results also support a dual role of Spa13 as a chaperone escort and as an export gate-activator switch to promote substrates secretion. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

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