In vielen tierischen Zellen und in Hefe wurden Membrandomänen als Plattformen für die Etablierung von Signalkomplexen bereits gut beschrieben (Foster et al., 2003) und entsprechend ihrer Resistenz gegenüber nicht-ionischen Detergenzien charakterisiert (Shogomori et al., 2003). Die Behandlung von Membranen mit solchen Detergenzien kann zu Artefakten führen und die Anwesenheit eines Proteins in diesen so genannten „DRMs“ bedeutet noch nicht, dass es auch in nativen Membrandomänen lokalisiert ist. Allerdings muss man sich, mangels besserer Methoden zur Aufreinigung von Membrandomänen, heute noch der Methode der DRM-Aufreinigung durch Detergenzien bedienen, um eine erste Vorstellung von der Proteinzusammensetzung dieser bestimmten Membranbereiche zu erhalten. Mittels Sterolreduktion der DRMs durch die Behandlung der isolierten Membranfraktionen mit MCD und anschließender HPLC-ESI-Massenspektrometrie, konnten 80 Proteine identifiziert werden, die somit als potentiell in Membrandomänen lokalisiert gelten können. Unter diesen befanden sich die beiden Arabidopsis-Remorine AtRem1.2 und AtRem1.3, die Ca2+-abhängige Proteinkinase CPK21 und die Proteinphosphatase 2C ABI1. Dieses Phosphatase-Kinase-Paar reguliert den membranständigen, im Mesophyll exprimierten, Anionenkanal SLAH3 in ABA-abhängiger Weise (Geiger et al., 2011). Mit Hilfe biochemischer, massenspektrometrischer und mikroskopischer Methoden konnte gezeigt werden, dass die Phosphatase ABI1 in Abwesenheit von ABA die Interaktion zwischen der Kinase CPK21 und dem Anionenkanal SLAH3 unterbindet. Dies geschieht indem SLAH3 und CPK21 aus den Membrandomänen in die umgebenden Membranbereiche verlagert werden und somit eine phosphorylierungsabhängige Aktivierung des Anionenkanals verhindert wird (Demir et al., 2013). Unter den in Nanodomänen lokalisiert Proteinen, konnte auch die NADPH-Oxidase AtrbohD als schwach sterolabhängig identifiziert werden. Diese zeigte im Gegensatz zu der homologen Oxidase AtrbohF, nach transienter Koexpression in Arabidopsis-Epidermiszellen zwar eine Lokalisation in distinkten Membrandomänen, aber keine Kolokalisation mit dem zuvor etablierten Membrandomänenmarker AtRem1.3 (Demir et al., 2013). Dieses Ergebnis impliziert, dass es verschiedene Arten von Membrandomänen geben könnte und dass die beiden Oxidasen (zumindest zeitweise) in unterschiedlichen Membrankompartimenten lokalisiert und dadurch womöglich auch unterschiedlich reguliert sein können. Nach Koexpression der Oxidase AtrbohD mit den weiteren 12 der insgesamt 16 Arabidopsis-Remorinen, konnte eine Kolokalisation der Oxidase mit AtRem1.4 bestätigt werden. Das Remorin AtRem1.4 zeigt in weiteren Versuchen nicht nur eine deutliche Lokalisierung in anderen sterolreichen Membrandomänen als AtRem1.3, es zeigt auch eine eindeutige laterale Immobilität und kann somit als ein Marker für Membrandomänen etabliert werden. Somit bestätigt sich die Annahme, dass es auch in Pflanzen unterschiedliche Arten von Membrankompartimenten gibt. Zu diesem Zeitpunkt war noch kein, die Funktion der Oxidase regulierender Interaktionspartner von AtrbohD bekannt, um die Frage des Zusammenhangs zwischen Lokalisation und Funktion der Oxidase beantworten zu können. Mit Hilfe verschiedener mikroskopischer Techniken (BiFC, SE-FRET, AB-FRET) zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen, konnte aus einer Auswahl von fünf Mesophyll-lokalisierten und Ca2+-unabhängigen Snrk2-Kinasen, zwei potentielle Interaktionspartner identifiziert werden. Genau wie mit der homologen Oxidase AtrbohF (Sirichandra et al., 2007), interagiert die ABA-abhängige Kinase OST1/Snrk2.6 auch mit AtrbohD. Bei dem zweiten potentiellen Interaktionspartner handelt es sich um Snrk2.7. Die Behandlung der transfizierten und in den Interaktionsmessungen eingesetzten Zellen mit der sterolreduzierenden Reagenz MCD resultierte in einem signifikanten Anstieg der zuvor gemessenen Interaktionseffizienzen (EFRET) aller fünf ausgewählten Snrk2-Kinasen mit AtrbohD. Eine Interaktion zwischen zwei Proteinen muss nicht zwingend bedeuten, dass sie eine funktionelle Einheit in einem Signalweg darstellen. Aus diesem Grund wurde der Einfluss der identifizierten potentiellen Interaktionspartner auf die ROS-Produktionsaktivität der NADPH-Oxidase AtrbohD untersucht. Es zeigt sich, dass Snrk2.7 die ROS-Produktion durch die Oxidase auf ein vergleichbar hohes Niveau steigern kann, wie die zu diesem Zeitpunkt als Interaktionspartner der Oxidase AtrbohD identifizierte Ca2+-abhängige Kinase CPK5 (Dubiella et al., 2013). Die Kinase Snrk2.7 interagiert also nicht nur mit AtrbohD, sondern kann die Oxidase auch phosphorylieren (wahrscheinlich an einer der beiden für die Phosphorylierung von AtrbohD als essentiell beschriebenen Positionen S343 oder S347 (Nühse et al., 2007) und nicht an der untersuchten Position S39) und somit aktivieren. Dem hingegen zeigt OST1, trotz einer zuvor bestätigten Interaktion mit AtrbohD, nicht die Fähigkeit diese Oxidase auch aktivieren zu können. Die Snrk2.7-vermittelte Aktivität von AtrbohD ist ebenfalls deutlich durch eine Behandlung der transfizierten Zellen mit MCD induzierbar. Die NADPH-Oxidase AtrbohD wird also in Abhängigkeit ihrer Lokalisierung in spezifischen Membrandomänen reguliert. Wenn die zwei essentiellen Phosphorylierungsstellen durch eine Punktmutation ausgeschaltet werden und die Oxidase nicht mehr als Antwort auf Pathogene aktiviert werden kann, lokalisiert diese nicht mehr in den AtRem1.4-markierten Membrandomänen. Auch zeigt sich, dass die Aktivität der Oxidase, induziert durch eine Interaktion mit der nicht in Membrandomänen lokalisierten Snrk2-Kinase Snrk2.7, gesteigert werden kann, wenn durch MCD die sterolreichen Membrandomänen abgereichert werden. Eventuell dienen Membrandomänen, zumindest im pflanzlichen System, nicht nur der Etablierung von Signalkomplexen, sondern in einigen Fällen auch der Negativregulierung von bestimmten Proteinaktivitäten, wie zum Beispiel in diesem Fall, der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). / In animal cells and yeast, membrane domains have been extensively characterized as signalling platforms (Foster et al., 2003) and characterized upon their resistance to treatment with non-ionic detergents (Shogomori et al., 2003). Such treatment of membranes can result in formation of artefacts and the appearance of a protein in these so-called “DRMs” is not necessarly related with its localization in native membrane domains. The lack of improved preparative methods, results in further use of DRM preparation to get a first insight into the protein composition of special membrane areas. The protein composition of isolated and MCD-treated detergent resistant membrane (DRM) fractions from purified plasma membrane of Arabidopsis thaliana was investigated by HPLC-ESI mass spectrometry. Eighty proteins could be identified which are thought to be localized in sterol rich membrane domains. Among these sterol-dependent proteins the two Remorins AtRem1.2 and AtRem1.3 and two essential ABA signalling components, namely the protein phosphatase 2C ABI1 and the kinase CPK21, could be identified. This phosphatase-kinase pair was very recently demonstrated to regulate the stomatal aperture via SLAH3-mediated anion release in an ABA-dependent manner (Geiger et al., 2011). Using biochemical, mass spectrometrical and microscopic approaches it could be shown that, in absence of ABA, the phosphatase ABI1 prevents the interaction between CPK21 and SLAH3 by dislocation of both proteins from membrane domains to surrounding membrane areas, which inhibits the phosphorylation and the activation of the channel (Demir et al., 2013). Among the potentially membrane domain localized proteins, the NADPH-oxidase AtrbohD could be identified to be weakly dependent upon a sterol rich environment. In contrast to the homologous AtrbohF, the isoform D shows no colocalization upon coexpression with the established membrane domain marker AtRem1.3 (Demir et al., 2013). This result implies that there must be co-residing membrane domains and that both oxidases are (at least temporarily) located in different membrane compartments. This could imply functionally different membrane platformes to regulate specific signalling cascades. After Coexpression of AtrbohD with 12 of the altogether 16 Remorin proteins, a colocalization with AtRem1.4 could be confirmed. In further experiments not only a clear localization in other membrane domains than the ones marked by AtRem1.3, but also a clear lateral immobility could be proofed for AtRem1.4, which therefore can be accepted as a marker for another kind of membrane domains. Regarding these results, the existence of diverse Types of membrane compartments, also in plants, can be accepted. At this time point of the investigations, no interaction partner of AtrbohD was known to regulate the function of the oxidase. Therefore, the relationship between localization and function of the oxidase was still an open question. Using different microscopic techniques (BiFC, SE-FRET, AB-FRET) to study protein-protein interactions, two potential interaction partners out of a set of five mesophyll expressed Ca2+-independent Snrk2-kinases, could be identified. The ABA-dependent kinase OST1/Snrk2.6, which also interacts with AtrbohF (Sirichandra et al., 2007), was demonstrated to be a potential interaction partner of AtrbohD as well as Snrk2.7. The treatment of transfected cells with MCD leads to a significant induction of the measured interaction efficiencies (EFRET) of all the five analysed Snrk2-kinases with AtrbohD. An interaction between two proteins does not automatically mean a functional regulation of a signalling pathway, therefore the influence of the identified potential interacting partners of AtrbohD on the ROS-producing activity was analysed. At this time point the Ca2+-dependent kinase CPK5 was identified to be an interacting and phosphorylating partner of AtrbohD. The kinase Snrk2.7 can induce the ROS-producing activity of AtrbohD to a similar level than CPK5, which means Snrk2.7 is not only interacting with AtrbohD, but also regulating its activity. The phosphorylation and activation of AtrbohD by Snrk2.7 is probably mediated by one of the two essential phosphorylation sites S343 and S347 (Nühse et al., 2007), but not on the analysed S39. In contrast, the kinase OST1 is indeed interacting with AtrbohD, but obviously not regulating its activity. The Snrk2.7-mediated ROS-producing activity of AtrbohD is also inducible upon treatment of the transfected cells with MCD. The NADPH-oxidase AtrbohD is regulated in dependency to its localization in specific membrane domains. Mutation oft the two essential phosphorylation sites leads to a dislocation from AtRem1.4-marked membrane domains. Treatment with MCD, that means disruption of the sterol rich membrane environment, resulted in significantly increased ROS-producing activity of AtrbohD upon interaction with the non-domain located kinase Snrk2.7. Probably the membrane domains do not only function as signalling platforms in plants, but in some cases also for negative regulation of certain protein activity, such as the production of reactive oxygen species (ROS).

Zsfassung in dt. Sprache. - Würzburg, Univ., Diss., 2008

Universiẗat, Diss., 2003--Dortmund.

Universiẗat, Diss., 2004--Münster (Westfalen).

Universiẗat, Diss., 2004--Düsseldorf.

Universiẗat, Diss., 2004--Frankfurt (Main).

G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR) sind Rezeptoren mit 7 Transmembrandomänen. Nach Bindung ihres Liganden werden über die Kopplung von G-Proteinen rezeptorspezifisch Signaltransduktionswege aktiviert. Ein bislang nicht ausreichend verstandener Prozess für die Funktion von GPCR ist deren Oligomerisierung. Für einige GPCR konnte gezeigt werden, dass die Oligomerisierung den Rezeptortransport und/oder die Dynamik der Rezeptoraktivierung moduliert. Dabei ist noch nicht aufgeklärt, ob die entsprechenden GPCR ausschließlich als Oligomere oder in einem bestimmten Monomer-Dimer Verhältnis (M/D) vorliegen und welcher Dynamik dieses Verhältnis unterliegt. In dieser Arbeit wurde die Homo-Oligomerisierung des Endothelin-B-Rezeptors (ETBR), des Vasopressin-V2-Rezeptors (V2R) und der Corticotropin-Releasing-Factor-Rezeptoren Typ 1 (CRF1R) und Typ 2(a) (CRF2(a)R) analysiert. Im Anschluss an diese Untersuchungen wurde das M/D der GPCR bestimmt. Zur Detektion der Protein-Protein Interaktionen wurden die biophysikalischen Methoden Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) und Fluoreszenz-Kreuzkorrelations-Spektroskopie (FCCS) eingesetzt. Mit Hilfe der FCCS konnte das spezifische M/D der GPCR bestimmt und über FRET ein Unterschied in der Interaktions-Dynamik zwischen den GPCR der Familie 1 (am Bsp. des V2R) und der Familie 2 (am Bsp. des CRF1R) ermittelt werden. Des Weiteren lieferten die genutzten Methoden den Nachweis, dass der zum CRF1R homologe CRF2(a)R ausschließlich als Monomer vorliegt. Zusätzliche Untersuchungen an Signalpeptidmutanten des CRF1R und des CRF2(a)R weisen darauf hin, dass das Pseudosignalpeptid des CRF2(a)R, welches bislang einzigartig in der Superfamilie der GPCR ist, die Oligomerisierung des Rezeptors verhindert. Zusätzlich zu diesen neuen Daten konnte in dieser Arbeit erstmals ein Zusammenhang zwischen Rezeptorinteraktion und G-Protein Selektivität für den CRF1R und den CRF2(a)R festgestellt werden / The heptahelical G protein-coupled receptors (GPCRs) are important drug targets. Following activation by their ligands, they exert their function via the binding of G proteins and activation of specific signal transduction cascades. To date, the functional significance of the oligomerization of GPCRs is not completely understood. For some GPCRs it could be shown that the oligomerization modulates receptor transport and/or the dynamics of receptor activation. Most importantly, it is not clear whether the GPCRs exist exclusively as oligomers or in a certain monomer-dimer ratio (M/D) or whether a given ratio is dynamic. In this work, the homo-oligomerization of the endothelin-B-receptor (ETBR), the vasopressin-V2-receptor (V2R) and the corticotropin-releasing-factor-receptors type 1 (CRF1R) and type 2(a) (CRF2(a)R) was analysed. In addition, the M/D of these GPCRs was determined. For the detection of the protein-protein interactions, the following biophysical methods were established: fluorescence-resonance-energy-transfer (FRET) and fluorescence-crosscorrelation-spectroscopy (FCCS). With the help of FCCS, a specific M/D could be determined for each of the GPCRs. Using FRET, differences in the interaction dynamics between family 1 (V2R) and family 2 GPCRs (CRF1R) could be described. Moreover, it was experimentally verified that the CRF2(a)R is exclusively expressed as a monomer, in contrast to the other GPCRs and even the highly homologous CRF1R. Using signal peptide swap experiments, it could be demonstrated that the N-terminal pseudo signal peptide of the CRF2(a)R, which is so far unique in the superfamily of GPCRs, prevents oligomerization of the receptor. In addition, a relation of receptor oligomerization and G protein coupling selectivity was established for the CRF1R and the CRF2(a)R which is novel for the GPCR protein family.