OLIVEIRA, Vinícius José Barros de. Construção de molécula de RNA de interferência para silenciar genes que promovem a formação de biofilmes por bactérias do gênero Staphylococcus. 2017. 44 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia de Recursos Naturais)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Coordenação PPGBiotec (ppgbiotec@ufc.br) on 2017-10-18T12:56:38Z No. of bitstreams: 1 2017_dis_vjboliveira.pdf: 1327735 bytes, checksum: 434b7c815c2f1a0ff4e63397e396cc07 (MD5) / Approved for entry into archive by Anderson Silva Pereira (anderson.pereiraaa@gmail.com) on 2017-11-16T16:50:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_dis_vjboliveira.pdf: 1327735 bytes, checksum: 434b7c815c2f1a0ff4e63397e396cc07 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-16T16:50:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_dis_vjboliveira.pdf: 1327735 bytes, checksum: 434b7c815c2f1a0ff4e63397e396cc07 (MD5) Previous issue date: 2017 / Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis are causative agents of common infections in humans and are important pathogens responsible for nosocomial infections associated with the use of implantable devices. One of its main factors of virulence and biofilm. Biofilm formation is regulated by a complex genetic machine, with sarA, operon ica and agr genes being the most studied. The indiscriminate use of antibiotics over time has generated an explosion of "superbugs", especially bacteria of the genus Staphylococcus, multiresistant to various antibiotics. Currently, many studies have documented the strategy to combat mechanisms of resistance in microorganisms. Interference RNA is a biological process that causes silencing of specific mRNA molecules and has been used as a tool for both the study of gene functions and gene silencing. Despite the many barriers that prevent the application of the technique to clinical use, researchers have overcome some problems from the use of hybrid RNADNA molecules, called siHybrids. This work aimed to construct hybrid RNA-DNA molecules (siHybrids) to silence an action of the icaA gene and the agr gene, thus preventing a biofilm formation. The results showed that biofilm production systems as the new therapeutic strategy for the inhibition of biofilm formation. This study is a program of efficacy of RNA: DNA hybrids against Staphylococcus spp. / Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis são agentes causadores de infecções comuns em seres humanos e são importantes patógenos responsáveis por infecções nosocomiais associadas ao uso de dispositivos implantáveis. Um dos seus principais fatores de virulência é o biofilme. A formação do biofilme é regulada por uma maquinaria genética complexa, sendo os gene sarA, operon ica e agr, os mais estudados. O uso indiscriminado de antibióticos ao longo dos tempos tem gerado uma explosão de “superbactérias”, especialmente bactérias do gênero Staphylococcus, multirresistentes a diversos antibióticos. Atualmente, muitos estudos vêm documentando estratégias de combate aos mecanismos de resistência em microorganismos. RNA de interferência é um processo biológico que causa silenciamento de moléculas de mRNA específicas e tem sido utilizado como uma ferramenta tanto para o estudo das funções dos genes como para o silenciamento de genes. Apesar das várias barreiras que impedem a aplicação dessa técnica ao uso clínico, pesquisadores conseguiram superar alguns desses problemas a partir do uso de moléculas híbridas de RNA-DNA, chamadas siHybrids. Esse trabalho teve como objetivo a construção de moléculas híbridas de RNA-DNA (siHybrids) para silenciar a ação do gene icaA e do gene agr, impedindo assim a formação de biofilme. Os resultados mostraram que os siHybrids foram eficientes no silenciamento gênico pós-transcricional em variadas concentrações, portanto os siHybrids podem ser utilizados como uma nova estratégia terapêutica para a inibição da formação de biofilme. Este estudo é um dos primeiros a anunciar a eficácia de híbridos de RNA:DNA contra biofilmes de Staphylococus spp.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:36:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2100606 bytes, checksum: 5e91a2b8b12b7ee39c9e424e7736aa78 (MD5) Previous issue date: 2009-02-18 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / The main objectives in this work were: i) to find the optimum conditions to disinfect tomato seeds (Solanum lycopersicum Mill.) and eggplant seeds (Solanum melongena L.); ii) to evaluate the influence of the type of sealing in the obtained seedlings and explants; iii) to evaluate the effect of sonication in the morphogenesis in vitro of the tomato explants and in the viability of Agrobacterium tumefaciens cells; iv) to establish the parameters that allow the genetic transformation mediate by A. tumefaciens aiming the genetic silencing mediate by RNAi from myo-inositol-phosphate synthase, using the GmMPIS1 gene. It was checked that the use of deionized water was more efficient to disinfect eggplant seeds than 0.13% v/v chlorine solution. The use of dry disinfection in chlorine cameras is not appropriate to clean the tomato and eggplant seeds due to the gas toxicity and that it also compromises their germination. It was observed that gas exchange helps the seedlings development and leads to a bigger number of explants and with better quality to be used in the genetic transformation via Agrobacterium tumefaciens. Using the SAAT technique (Sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation), the explants and the bacteria suspensions were exposed to ultrasound for 0, 3, 6 and 9 seconds. It was verified that the immersion time from 3 to 6 seconds was appropriate to be used in genetic transformation, since it shown the biggest transient expression areas evaluated by in situ histochemical analysis of the GUS gene, the biggest number of regenerated structures and less mortality in the A. tumefaciens cells. The process was optimized when the immersion of the A. tumefaciens suspension was made 24 hours after the exposition to ultrasound. To make possible to select the transformed plants it was established the dependence of the hygromycin agent lethality and the found concentration of the non-transformed selected cells was 7.5 mg.L-1 in cotyledonary hipocotyledonary and leaf tomato explants. It was found that concentrations above this value were toxic, showing chlorotic and necrotic areas in the explants. A genetic transformation in tomato and eggplant plants was successfully made to check the relation between the MIPS gene and the seeds development by A. tumefaciens containing plasmids with silencing construction by siRNA to the MIPS gene using a conserved sequence of the soy gene GmMIPS. The transgenic nature of the primary regenerators was confirmed by in situ histochemical tests of GUS and by PCR analysis with specific oligonucleotides initiators. The analysis of the genetic expression confirmed the MIPS gene silencing and the morphologic analysis of the fruits confirmed the hypothesis of the relationship between the myo-inositol- phosphate synthase and the seeds development. However, as shown by flow-citometry technique, the process of regeneration in vitro used in the tomato plants transformation protocol changed some transgenic plants to polypoids. This was not observed in eggplant plants. / Este trabalho teve como objetivo: i) a otimização das condições de desinfestação de seentes de tomateiros (Solanum lycopersicum Mill.) e berinjela (Solanum melongena L.); ii) a avaliação da influência do tipo de vedação sobre a qualidade das plântulas e explantes oriundos destas; iii) a avaliação do efeito da sonicação sobre a morfogênese in vitro de explantes de tomateiros e sobre a viabilidade de células de Agrobacterium tumefaciens; iv) o estabelecimento de parâmetros para possibilitar a transformação genética mediada por A. tumefaciens visando ao silenciamento gênico mediado por RNAi da sintase do mio-inositol-fosfato, utilizando-se o gene GmMIPS1. Na desinfestação das sementes de berinjela, comprovou-se que tratamentos utilizando imersão em água deionizada são mais eficientes que imersão em solução de 0,13% v/v de cloro. A utilização de desinfestação a seco, em câmara de gás cloro, não é indicada para a assepsia de sementes de tomate e berinjela, pela toxicidade do gás às sementes, comprometendo sua germinação. Observou-se que as trocas gasosas favorecem o desenvolvimento das plântulas e geram explantes em maior número e de melhor qualidade para utilização de transformação genética via Agrobacterium tumefaciens. Ao se utilizar a técnica de SAAT ( Sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation ), os explantes e a suspensão bacteriana foram expostos a tempos de exposição ao ultra-som (0, 3, 6 e 9 segundos). Verificou-se que o intervalo de 3 a 6 segundos é o indicado para se utilizar em transformação genética, pois resultou nas maiores áreas de expressão transiente avaliada pela análise histoquímica in situ do gene GUS, maior número de estruturas regeneradas e menor mortalidade nas células de A. tumefaciens. O processo foi otimizado quando a imersão em suspensão de A. tumefaciens foi realizado após 24 horas de exposição ao ultra-som. Para ser possível a seleção de transformantes foi estabelecida a curva de letalidade ao agente higromicina e a concentração encontrada para seleção de células não transformadas foi de 7,5 mg.L-1 em explantes cotiledonares, hipocotiledonares e foliares de tomateiro. Dosagens acima de 7,5 mg.L-1 mostratam-se tóxicas, resultando em explantes com áreas cloróticas e necróticas. A fim de verificar a relação do gene MIPS com o desenvolvimento de sementes, a transformação genética foi realizada com sucesso em tomateiro e berinjela, via A. tumefaciens contendo plasmídeo com construção de silenciamento por siRNA para o gene MIPS, utilizando uma seqüência conservada do gene de soja GmMIPS. A natureza transgênica dos regenerantes primários foi confirmada mediante o teste histoquímico in situ de GUS e análise de PCR com oligonucleotídeos iniciadores específicos. A análise de expresão gênica confirmou o silenciamento do gene MIPS, e a análise morfológica dos frutos confirmou a hipótese do relacionamento da mio-inositol-fosfato-sintase com o desenvolvimento de sementes. Porém, conforme detectado pela técnica de citometria de fluxo, o processo de regeneração in vitro adotado no protocolo de transformação de tomateiro, ao contrário de berinjela, induziu poliploidia em algumas plantas transgênicas.