La protéine découplante mitochondriale UCP2 est exprimée basalement dans différents tissus et le rôle de régulateur négatif de la production des espèces actives oxygénées (ROS) mitochondriales a été avancé. Les travaux présentés se sont intéressés à l'implication potentielle d'UCP2 dans le déroulement de la réponse immunitaire. Une induction de l'expression d'UCP2 est démontrée dans un modèle murin d'encéphalite par le virus Herpès simplex de type 1 (HSV-1) tout d'abord, puis dans un modèle parasitaire de leishmaniose causée par Leishmania donovani. Cette expression d'UCP2 a été observée dans les cellules immunitaires, colocalisée avec différents marqueurs inflammatoires exprimés à des niveaux élevés. Le modèle d'infection virale a montré un délai entre la mise en place de la réponse immunitaire innée et l'apparition d'UCP2 dans le cerveau, impliquant UCP2 dans les étapes tardives de la défense antivirale. A cette étape, la réplication du virus et la neuroinflammation sont au maximum, expliquant la susceptibilité des souris déficientes en UCP2. De plus, l'invalidation des gènes codant pour TNF-a et/ou IL-ip sensibilise au virus HSV-1 les souris naturellement résistantes et modifie le profil d'expression d'UCP2. Dans le modèle parasitaire, l'invalidation du gène codant UCP2 n'a pas permis de diminuer la croissance des parasites dans la première phase de la leishmaniose. Ainsi la protéine UCP2 ne serait pas impliquée dans les étapes précoces de mise en place de la défense antiparasitaire; les tactiques des parasites pour inhiber la réponse de l'hôte pourraient expliquer l'absence de différences nettes liées à la perte d'UCP2. La dernière étude portait sur la chronologie d'apparition d'UCP2 par rapport aux marqueurs neuroinflammatoires suite à l'injection intrastriatale de LPS. Dans ce modèle, une forte expression transitoire de TNF-a, bcBa et TLR2 est repérée dans la zone adjacente au site d'injection dès 6 h suivant l'injection puis diminue. UCP2 est seulement observable 48 h post injection dans les mêmes régions cérébrales. En conclusion, nous avons démontré dans 3 types de stimulations infectieuses de la réponse immunitaire que l'apparition d'UCP2 était liée avec un délai à l'expression de facteurs inflammatoires et UCP2 n'a semblée être qu'un marqueur. En effet, la fonction antioxydante tenue par UCP2 dans les étapes tardives de l'immunité semble modeste à la vue des résultats des souris déficientes en UCP2, mais ce rôle reste encore à préciser. / Mitochondrial uncoupling protein 2 (UCP2) is basally expressed in diverse tissues and a function of negative regulator of reactive oxygen species (ROS) production has been proposed. Studies presented in this thesis emphasize the potential role of UCP2 in immunity. Induction of UCP2 expression was demonstrated first in a murine model of encephalitis caused by Herpes simplex virus type 1 (HSV-1), then in a parasitic leishmaniasis model. UCP2 mRNA expression was observed in immune cells, colocalized with different inflammatory factors at high levels. Models of viral infection demonstrated that the transcriptional activation of UCP2 was delayed compared with the inflammatory response, involving UCP2 in the later stages of the antiviral response. At those later steps, viral replication and neuroinflammation were maximal, which could explain susceptibility in UCP2-deficient mice. Moreover, invalidation of the genes encoding TNFa and/or IL1B in resistant mice allowed HSV-1 for replicating in neurons and modified the distribution pattern of UCP2m RNA in the brain. In parasitic models, growth of parasites in UCP2- deficient mice was not impaired in the first phase of pathogenesis. Therefore UCP2 did not appear to be implicated in early steps of the antiparasitic response; parasites could develop strategies for inhibiting the host response, which would explain the similarity in the immune responses between UCP2-deficient and wild type mice. The last study addressed the chronology of UCP2 expression in relation with neuroinflammation following intrastriatal injection of LPS. In this model, strong and transitory expressions of TNFa, IkB and TLR2 were shown in ipsilateral region at 6h after injection. UCP2 was only expressed 48h post injection in the same cerebral region. In conclusion, we have demonstrated, in three models of infection triggering an immune response that the induction of UCP2 expression occurs in a coordinated but delayed manner with that of common inflammatory factors. UCP2 appears to be a marker of the severity of the immune response. It does not appear, based on the results obtained in UCP2-deficient mice, to play an essential role in the models of infection that we used. The role of UCP2 in those models remains to be folly elucidated.

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A typical problem in traffic control is the steering over a network of vehicles with different origins and destinations. In this report this scenario is formulated as a multi-commodity network flow problem, a linear programming problem whose objective is to transport, with minimum cost, different commodities from their respective sources to their sinks through a network, while respecting the capacity constraints of the roads. The dynamic network flow formulation of the problem is also presented, extending the network over time to incorporate the temporal dimension. Different algorithms for solving the multi-commodity network flow problem are examined. First, the simplex method, more precisely its revised version, is considered, and then the Dantzig-Wolfe decomposition is illustrated, an optimization algorithm which exploits specific block structures in the constraints. These methods are applied using state-of-the-art linear programming solvers and evaluated with a simulation based on the road network in central Stockholm. The results show that both methods allow for solving the traffic flow problem, with limitations given by the specifics of the solvers and by the space and time discretization of the problem. In particular, the revised simplex algorithm results the faster method.

Herpes simplex virus Typ 1 (HSV-1) ist ein humanpathogenes Virus der Familie Herpesviridae. Für eine erfolgreiche Virusreplikation besitzt HSV-1 mehrere Gene, die in den meisten infizierten Zelltypen Apoptose verhindern. Im Gegensatz dazu führt die HSV-1 Infektion eines zentralen Zelltyps des Immunsystems, den unreifen dendritischen Zellen (iDCs), zu Apoptose. Dies könnte ein Aspekt der HSV-1 Immunevasion sein. Bisher waren die Ursachen der Apoptose von HSV-1 infizierten iDCs unzureichend aufgeklärt. Es wurde jedoch gezeigt, dass das antiapoptotische zelluläre Protein c-FLIP in HSV-1 infizierten iDCs reduziert ist. In dieser Arbeit wurde die c-FLIP Menge in iDCs erstmalig mit Hilfe von RNA Interferenz erfolgreich reduziert. Dies bestätigte die Bedeutung von c-FLIP für die Lebensfähigkeit von iDCs. Folglich könnte auch die Reduktion der c-FLIP Menge nach HSV-1 Infektion iDCs für Apoptose empfindlich machen. Die HSV-1 induzierte c-FLIP Reduktion erfolgte in späten Stadien der Infektion, abhängig von der ordnungsgemäßen Expression viraler „early“ und „leaky late“ Gene. Sie fand nicht auf RNA Ebene statt und war unabhängig vom Proteasom und der Bindung an den „death inducing signaling complex“. Stattdessen wurde c-FLIP wahrscheinlich von einer viralen oder zellulären Protease abgebaut. In dieser Arbeit wurde erstmals gezeigt, dass zusätzlich zu Veränderungen im zellulären Apoptosesignalnetzwerk der Mangel an einem antiapoptotischen viralen Faktor zur Apoptose von HSV-1 infizierten iDCs beiträgt. Eine Microarray Analyse der HSV-1 Genexpression ergab, dass HSV-1 Latenz-assoziierte Transkripte (LATs) in apoptotischen iDCs signifikant geringer exprimiert waren als in nicht-apoptotischen epithelialen Zellen. LATs besitzen in Neuronen und epithelialen Zellen eine antiapoptotische Aktivität. Diese könnte den Mangel an c-FLIP kompensieren. Übereinstimmend mit dieser Hypothese induzierte eine HSV-1 LAT-Deletionsmutante mehr Apoptose in iDCs im Vergleich zum Wildtyp-Virus. / Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) is a human pathogen which belongs to the family Herpesviridae. HSV-1 encodes several genes, which serve to efficiently prevent apoptosis in most infected cell types, thereby ensuring successful virus replication. In contrast, HSV-1 infection of one central cell type of the immune system, immature dendritic cells (iDCs), results in apoptosis. This could be one aspect of HSV-1 immunevasion. So far, the mechanisms underlying apoptosis of HSV-1 infected iDCs were poorly defined. However, it has been shown that the antiapoptotic cellular protein c-FLIP is reduced in HSV-1 infected iDCs. In this work, the amount of c-FLIP was for the first time successfully reduced in iDCs by RNA interference. This confirmed the importance of c-FLIP for viability of iDCs. Therefore, it is likely that c-FLIP reduction after HSV-1 infection also sensitizes iDCs to apoptosis. HSV-1 induced c-FLIP reduction occurred at late stages of infection and was dependent on proper expression of early and leaky late virus genes. Furthermore, it was not operative at the RNA level and was independent from the proteasome and binding to the death inducing signaling complex. Rather, c-FLIP was presumably degraded by a viral or cellular protease. In this work it was shown for the first time, that in addition to changes in the cellular apoptosis signaling network, the lack of one antiapoptotic viral factor contributes to apoptosis of HSV-1 infected iDCs. HSV-1 latency-associated transcripts (LATs) were significantly lower expressed in apoptotic iDCs compared to non-apoptotic epithelial cells, determined by microarray analysis of HSV-1 gene expression. It is known that in neurons and epithelial cells, LATs possess a potent antiapoptotic activity. This could compensate the lack of c-FLIP. Consistent with this hypothesis, a LAT deletion mutant of HSV-1 induced more apoptosis in iDCs compared to the respective wild type virus.

Made available in DSpace on 2017-07-21T18:53:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Doris Oliveira Gregianin.pdf: 1718205 bytes, checksum: 59a8cb966255e87e0fa3f347f2a191cb (MD5) Previous issue date: 2014-08-28 / The increased incidence of cardiovascular disease and various cancers have been the cause of searching for changing habits in a large portion of the population, seeking the physical activity in conjunction with the consumption of healthier foods with higher nutritional content. Considering the high biological value of the proteins of sweet whey and the recognized effect in reducing risk of cardiovascular disease of soy protein, the aim of this study was to develop a mixed chocolate-soluble soybean extract dissolved in sweet whey. The different proportions of carrageenan stabilizers, pectin and tapioca starch were defined by the experimental design of mixtures simplex centroid. By optimizing the response surface was definitely the best formulation in relation to the physic-chemical and sensory parameters. The simultaneous optimization of response variables indicated that the optimal formulation should contain 46% carrageenan and 54% pectin and 0% starch, with a desirability index of 0.929. The formulation indicated for the desirability function was made with water soluble soy extract dissolved in sweet whey and; on sweet whey with reduced lactose content. Serum was hydrolyzed by the action of lactase from Kluyveromyces lactis yeast enzyme at a concentration of 2500 NLU / L in reaction 4 hr at 37 ° C. The sensory attributes were evaluated by nine points hedonic scale and attitude scale in purchase intent. For overall impression, the formulations presented average value of 7.11 ±1.09, while purchase intent the average value was 3.99 ± 1.28, and the multiple regression models proved to be predictive. The most widely accepted formulations were those who had lower viscosity and instrumental containing pectin in its constitution. The results obtained indicate that the combination of sweet whey and soy aqueous extract is a viable option for the preparation of a chocolate beverage. It was also observed that the use of cassava starch as a thickener does not interfere negatively on the rheological and sensory characteristics and; that the combined carrageenan and pectin concentrations defined predictive model ensures greater acceptability of the product. / O aumento da incidência de doenças cardiovasculares e diversos tipos de câncer tem sido a causa da procura por mudanças de hábitos em grande parte da população, buscando-se a prática de atividades físicas em conjunto com o consumo de alimentos mais saudáveis, com maior valor nutricional. Considerando o alto valor biológico das proteínas do soro de leite doce e o reconhecido efeito na diminuição de risco de doenças cardiovasculares da proteína de soja, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um achocolatado misto de extrato hidrossolúvel de soja dissolvido em soro de leite doce. As diferentes proporções dos estabilizantes carragena, pectina e amido de mandioca foram definidas pelo planejamento experimental de misturas simplex centróide. Através da otimização da Superfície de Resposta foi definida a melhor formulação em relação aos parâmetros físico-químicos e sensoriais. A otimização simultânea das variáveis de resposta indicou que a formulação ideal deveria conter 46% de carragena e 54% de pectina e 0% de amido, com um índice de desejabilidade de 0,929. A formulação indicada pela função de desejabilidade foi elaborada com extrato hidrossolúvel de soja dissolvido em soro de leite doce e; em soro doce com teor de lactose reduzido. O soro foi hidrolisado pela ação da enzima lactase proveniente da levedura Kluyveromyces lactis, na concentração de 2.500 NLU/L numa reação de 4 horas à temperatura de 37°C. Os atributos sensoriais foram avaliados pela escala hedônica de nove pontos e escala de atitude na intenção de compra. Para impressão global as formulações apresentaram valor médio 7,11 ±1,09, enquanto que para intenção de compra o valor médio foi de 3,99 ±1,28, sendo que os modelos de regressão múltipla mostraram-se preditivos. As formulações mais aceitas foram aquelas que apresentaram menor viscosidade instrumental e que continham pectina em sua constituição. Os resultados obtidos indicam que a combinação do soro doce de leite e extrato aquoso de soja é uma opção viável para a elaboração de uma bebida achocolatada. Também foi possível observar que o uso do amido de mandioca como espessante não interfere negativamente nas características reológicas e sensoriais do produto e; que a carragena e pectinas combinadas, nas concentrações definidas pelo modelo preditivo, garantem maior aceitabilidade ao produto.

Durante la última década, los métodos de optimización heurísticos basados en imitar a nivel computacional procesos naturales, biológicos, sociales o culturales, han despertado el interés de la comunidad científica debido a su capacidad para explorar eficientemente espacios de soluciones multimodales y multidimensionales. En este ámbito, esta tesis aborda el desarrollo, análisis y puesta a punto de diferentes métodos de optimización tradicionales y heurísticos. En concreto, se considera un método de búsqueda local basado en símplex y varios métodos heurísticos, tales como el recocido simulado, los algoritmos genéticos y la optimización con enjambre de partículas. Para estos dos últimos algoritmos se investigan diferentes esquemas con el objetivo de superar las limitaciones propias de los esquemas clásicos.La puesta a punto de los diferentes métodos de optimización se realiza considerando como problema de referencia la caracterización de la radiación de antenas a partir de medidas en campo próximo sobre geometría plana, utilizando un método de transformación de campo cercano a campo lejano basado en corrientes equivalentes. Para cada método de optimización se incluye un análisis paramétrico, en los casos en los que se ha considerado necesario, así como resultados de transformación de campo teóricos obtenidos para diferentes antenas de apertura y antenas de bocina piramidal. Los resultados de un estudio comparativo, realizado utilizando fuentes teóricas y medidas, demuestran la utilidad del método y permiten concluir que la optimización con enjambre de partículas es el algoritmo que proporciona las mejores prestaciones para esta aplicación.Los métodos de optimización desarrollados e investigados en este trabajo han sido también aplicados a otros problemas como son la síntesis de agrupaciones lineales o el modelado de fuente en aplicaciones de compatibilidad electromagnética. / For the last decade, heuristic optimization methods based on imitating natural, biological, social or cultural processes in a computational way have aroused great interest among the scientific community, due to its ability to explore efficiently multimodal and high-dimension solution spaces. On this basis, this thesis tackles the development, analysis and tuning of different traditional and heuristic optimization methods. In short, a local search method based on simplex and several heuristic methods, such as simulated annealing, genetic algorithms and particle swarm optimization are considered. For these last two algorithms different schemes are investigated so as to overcome the typical limitations of classical schemes.The tuning of the optimization methods is carried out considering as a reference problem the antenna radiation characterization from near-field measurements over a planar geometry, using a near-field to far-field transformation method based on equivalent currents. A parametric analysis is included for each optimization method, in those cases in which it has been considered necessary, as well as theoretical field transformation results obtained with aperture and pyramidal horn antennas. Results of a comparative study, carried out using theoretical sources and measurements, demonstrate the usefulness of the method and make it possible to conclude that the particle swarm optimization is the algorithm that provides the best performance for this application.The optimization methods developed and investigated in this work have also been applied to other problems, such as the synthesis of linear arrays or the source modelling in electromagnetic compatibility applications.

Nach dem Eintritt in den Wirtsorganismus und initialer Replikation infizieren Alphaherpesviren Neuronen zur weiteren Ausbreitung im Nervensystem und zur Etablierung einer Latenz. Dazu werden die Viruspartikel innerhalb der Axone retrograd von der Peripherie zum neuronalen Zellkörper transportiert. Die umgekehrte Richtung beschreibt den Weg des anterograden Transports vom Zellkörper zur Synapse für weitere Infektionen von Neuronen höherer Ordnung oder zurück zur Peripherie. Der retrograde intraaxonale Transport ist gut untersucht. Dagegen wird über den anterograden Transport kontrovers diskutiert. Zwei verschiedene Transportmodelle werden vermutet. Das „Married Model“ postuliert, dass umhüllte Virionen innerhalb von Vesikeln entlang des Axons transportiert werden. Die Freisetzung der Partikel erfolgt an der jeweiligen Synapse durch Endocytose. Das „Subassembly Model“ geht dagegen davon aus, dass einzelne Virusstrukurkomponenten (Nukleokapsid, Hülle) entlang des Axons transportiert werden. Der Zusammenbau und die Freisetzung erfolgt am Axonterminus bzw. an der Synapse (in vivo) oder am Wachstumskegel (in vitro) oder an speziellen Auftreibungen des Axons, den sogenannten Varicosities. Nach Infektion eines neuronalen Explantatsystems mit dem Pseudorabiesvirus (PrV) konnten ultrastrukturell umhüllte Virionen in Vesikeln detektiert werden und so der Nachweis der Gültigkeit des „Married Model“ als vorherrschendes Transportmodell geführt werden. Dagegen ist die Situation beim prototypischen Alphaherpesvirus, dem Herpes Simplex Virus Typ 1 (HSV-1), weiterhin ungeklärt. Aufgrund der zahlreichen unterschiedlichen Analysemethoden und -systeme war ein direkter Vergleich der beiden Viren bislang nicht möglich. Daher sollte in dieser Arbeit ein standardisiertes neuronales Kultursystem genutzt werden, um vier verschiedene HSV-1 Stämme im Vergleich zu PrV zu untersuchen. Für die Infektionen wurden sowohl Neuronen aus dem oberen Cervikalganglion als auch aus Spinalganglien genutzt. So konnte gezeigt werden, dass in Neuronen, welche mit den HSV-1 Stämmen HFEM, 17+ und SC16 infiziert waren ca. 75% als umhüllte Virionen in Vesikeln und ca. 25% als nackte Kapside vorlagen. Ingesamt war die Anzahl der Viruspartikel in HSV-1 infizierten Neuronen signifikant geringer als in PrV infizierten Kulturen. Überraschenderweise zeigten mit HSV-1 KOS infizierte Neuronen ein reverses Bild. Hier lagen nur 25% der Viruspartikel als umhüllte Virionen in Vesikeln vor, während 75% als nackte Kapside detektiert wurden. Dieser unerwartete Phänotyp sollte auf molekularbiologischer Ebene genauer untersucht werden. Dabei wurde auf die Genregion von US9 fokussiert. Das von US9 codierte Membranprotein spielt eine wichtige Rolle während des Zusammenbaus der Virionen und bei anschließenden axonalen anterograden Transportvorgängen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das HSV-1 KOS Genom durch verschiedene Basenaustausche an der vorhergesagten TATA-Box von US9 eine Mutation aufweist. Zusätzlich trägt das offene Leseraster durch eine weitere Mutation ein vorzeitiges Stopcodon auf und wird dadurch auf 58 Kodons reduziert, im Gegensatz zu anderen HSV-1 Stämmen, wo es 91 Kodons umfasst. Die Mutation an der TATA-Box verändert auch das ursprüngliche Stopcodon vom US8a Gen, was zur einer Verlängerung von ursprünglich 161 zu 191 Kodons führt. In Northern Blot Analysen konnte eine reduzierte Transkription von US9 in HSV-1 KOS infizierten Zellen detektiert werden. In HSV-1 KOS infizierten Zellen konnten mittels eines spezifischen Antiserums gegen US9 im Western Blot kein Genprodukt nachgewiesen werden. Auch Immunfluoreszenzanalysen zeigten, dass das abgeleitete verkürzte Protein offenbar nicht stabil exprimiert wird. Dagegen konnten Western Blot Analysen die Vergrößerung des pUS8a bestätigen. Der beobachtete auffällige intraaxonale Phänotyp könnte somit durch die Mutation des US9 Protein erklärt werden. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass auch bei HSV-1 vorwiegend das „Married Model“ für den anterograden intraaxonalen Transportweg bevorzugt wird und somit beide Alphaherpesviren, HSV-1 und PrV, denselben Transportweg nutzen.

Σκοπός της παρούσας Διπλωματικής Εργασίας είναι η ανάπτυξη συγκεκριμένης μεθοδολογίας και αλγορίθμων ψηφιακής επεξεργασίας εικόνων για την αυτόματη εκτίμηση των διαμέτρων αγγείων σε οφθαλμολογικές εικόνες. Η συγκεκριμένη μέτρηση της διαμέτρου των αγγείων διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην έγκαιρη διάγνωση παθήσεων καθώς έχει αποδειχθεί ότι υπάρχει συσχετισμός μεταξύ των μεταβολών των τιμών των εν λόγω διαμέτρων και της εμφάνισης αλλοιώσεων στον αμφιβληστροειδή. Στα πλαίσια της εργασίας, υλοποιήθηκαν δύο μεθοδολογίες για τον υπολογισμό των διαμέτρων αγγείων οφθαλμολογικών εικόνων, οι οποίες συλλέγονται με χρήση κάμερας πυθμένα (fundus camera). Η πρώτη μεθοδολογία στηρίζεται στην εύρεση των σημείων που αποτελούν τους κεντρικούς άξονες των υπό εξέταση αγγείων με χρήση διαφορικού λογισμού. Ακολούθως, σε κάθε σημείο που ανήκει σε κεντρικό άξονα αγγείου, υπολογίζονται οι παράμετροι μιας συνάρτησης. Η εν λόγω συνάρτηση περιγράφει βέλτιστα τα επίπεδα φωτεινότητας της εικόνας κατά μήκος του ευθύγραμμου τμήματος που διέρχεται από το σημείο και είναι κάθετο στο αγγείο. H εύρεση των παραμέτρων της συνάρτησης πραγματοποιείται με χρήση τεχνικών βελτιστοποίησης. Το τελικό βήμα της μεθοδολογίας είναι η εκτίμηση της διαμέτρου των αγγείων από τις τιμές των παραμέτρων που έχουν υπολογιστεί. Η δεύτερη μεθοδολογία στηρίζεται στον αλγόριθμο που προτείνει ο P.H. Gregson. Αρχικά, πραγματοποιείται κατάτμηση της εικόνας με κατωφλίωση και εφαρμόζονται μορφολογικοί τελεστές συστολής και διαστολής στην εικόνα. Στη συνέχεια, εφαρμόζεται ο αλγόριθμος λέπτυνσης (thinning algorithm) με σκοπό την εύρεση των κεντρικών αξόνων των αγγείων και τέλος εκτιμάται η διάμετρος σε κάθε σημείο του κεντρικού άξονα με χρήση των επιπέδων του γκρίζου των εικονοστοιχείων που κείνται στην ευθεία που είναι κάθετη στο αγγείο σε κάθε σημείο του. / The scope of this Thesis is the development of a methodology and advance image processing techniques in order to automatically estimate vessel diameters in ophthalmological images. Motivation for the thesis is the fact that the measurement of vessel diameter plays significant role in the seasonable diagnosis of vascular disorders, as it is believed to be a relation between the variation in diameters and the detection of retinal disorders. In this thesis, two methodologies are developed in order to be applied in ophthalmological images that are collected by using a fundus camera. The first methodology is based on the detection of the pixels that constitute the centerlines of vessels, by using differential calculus. Specifically, at each pixel that belongs to a centerline of vessel, the parameters of a specific function are calculated. This function describes as accurately as possible the intensity levels along the segment that passes through the specific pixel and is perpendicular to the vessel. The parameters of this function are estimated using optimization techniques. The final step of the methodology is the assessment of the diameters of vessels using the values of the parameters. The second methodology is based on the algorithm that P.H.Gregson has proposed. At first, the vessels are detected by tresholding and a morphological closing algorithm is applied. Then, a thinning algorithm is used in order to detect the pixels that constitute the centerlines of the vessels and ultimately the diameter at each pixel of the centerlines is assessed using the gray levels of the pixels that constitute the segment that is perpendicular to the vessel at each specific pixel.

Abstract Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) is a common pathogen with an age-standardized seroprevalence of 52% in Finland. The most common manifestation of HSV-1 infection is labial herpes, but recently HSV-1 has emerged as the most common cause of primary genital herpes in Finnish women. HSV-1 can also lead to severe conditions such as encephalitis. After the primary lytic HSV-1 infection at the epithelia, the progeny viruses infect the innervating sensory neurons. The neuronal infection may lead to a quiescent infection form, called latency. Periodically, the virus may reactivate, which can lead to recurrent infection at the epithelia. During different phases of the viral life cycle the host cells try to restrict the infection. This study set out to investigate the roles of two HSV-1 proteins, γ134.5 and Us3 during different phases of the HSV-1 life cycle. The aim of the first study was to investigate how the deletion of Us3 affected host responses, especially Toll-like Receptor (TLR) signaling, in monocytic U937 cells. TLR3 expression was increased during Us3 deletion virus infections. This also led to increased activation of IRF-3 and increased expression of type I interferons (IFN) and an interferon stimulated protein. This study shows that TLR3 is involved in controlling the HSV-1 infection and that Us3 regulates IRF-3 activation. The second study focused on the role of the γ134.5 protein in HSV-1 latency. Embryonic mouse dorsal root ganglion (DRG) cultures were used as a cell culture model for HSV-1 latency and reactivation. In this model γ134.5 deletion viruses did not reactivate as efficiently as wild-type viruses, even though they replicated well and established latency in the neurons. Stress granules are part of the host response. In the third study, the roles of the innate immunity effectors HSV-1 Us3 and human Z-DNA binding protein 1 (ZBP1) in stress granule formation (SG) were studied. Wild-type HSV-1 efficiently prevented the formation of SGs. The overexpression of ZBP1 resulted in accumulation of smaller but more abundant SGs during oxidative stress. Overexpression of Us3 did not significantly affect the size or number of SGs, but during Us3 deletion virus infection, SG proteins localized to cis-Golgi. This work shows that HSV-1 uses Us3 to evade and modulate host responses and that the γ134.5 protein is required for reactivation in mouse DRG cultures. / Tiivistelmä Herpes simplex virus tyyppi 1 (HSV-1) on yleinen taudinaiheuttaja, jonka ikävakioitu seroprevalenssi Suomessa on 52 %. HSV-1 tunnetaan yleisimmin huuliherpeksen aiheuttajana, mutta myös kasvava osuus genitaaliherpeksistä on HSV-1:n aiheuttamia. HSV-1 voi johtaa myös vakaviin ilmentymiin, kuten aivotulehdukseen. Epiteelisolujen infektion tuottamia viruksia siirtyy aluetta hermottaviin tuntohermosoluihin, mikä voi johtaa piilevään infektiomuotoon eli latenssiin. Latentti virus voi ajoittain reaktivoitua, mistä voi seurata uusintainfektio. Isäntäsolu pyrkii rajoittamaan infektiota sen eri vaiheissa. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää kahden HSV-1:n virulenssiproteiinin, γ134.5:n ja Us3:n, merkitystä HSV-1:n elinkierrossa. Osatyössä I tutkittiin, miten Us3:n poisto vaikuttaa luontaisen immuniteetin vasteisiin, keskittyen etenkin Tollin kaltaisten reseptorien (TLR) signaalivälitykseen U937-monosyyttisoluissa. Us3-poistogeenisillä viruksilla suoritetuissa infektioissa TLR3:n ilmentyminen lisääntyi merkittävästi. Tämä johti myös lisääntyneeseen IRF-3-aktivaatioon sekä tyypin I interferonien ja interferonistimuloituvan proteiinin lisääntyneeseen ilmentymiseen. Tämä osoittaa, että TLR3 osallistuu HSV-1-viruksen tunnistukseen ja että Us3 säätelee IRF-3:n aktivaatiota. Osatyössä II keskityttiin γ134.5-proteiinin merkitykseen HSV-1:n latenssissa. Hiirialkioiden takajuuren hermoganglioita käytettiin soluviljelymallina HSV-1:n latenssin ja reaktivaation tutkimisessa. Tässä mallissa γ134.5-poistogeeniset virukset kasvoivat hyvin ja asettuivat latenteiksi, mutta eivät silti reaktivoituneet kuten luonnonkannan virukset. Stressijyväset ovat osa luontaista immuniteettia. Osatyössä III määritettiin HSV-1:n Us3-proteiinin ja ihmisen Z-DNA:han sitoutuvan proteiini 1:n (ZBP1) merkitystä stressijyvästen muodostumisessa. Luonnonkannan virus kykeni tehokkaasti estämään jyvästen muodostumisen. ZBP1:n yli-ilmentäminen oksidatiivisen stressin aikana johti suureen määrään pienikokoisia stressijyväsiä. Us3:n yli-ilmentäminen ei vaikuttanut stressijyväsiin, kun taas Us3-poistogeenisellä viruksella suoritetuissa infektioissa stressijyväsproteiinit paikantuivat Golgin laitteeseen. Tämä tutkimus osoittaa, että HSV-1 käyttää Us3-proteiinia luontaisten immuunivasteiden muunteluun ja että γ134.5-proteiini on välttämätön reaktivaatiossa hiiren hermoganglioissa.