Thèse ou mémoire avec insertion d'articles / Le virus de l'herpès simplex de type 1 (VHS-1) est un virus enveloppé hautement contagieux et répandu dans le monde entier, où 67 % de la population mondiale est infectée. Ce virus cause des maladies incurables bénignes, dont la plus commune est l'herpès labial (ou boutons de fièvre), soit des lésions autour de la bouche. Toutefois, des infections bien plus graves, telles que l'encéphalite, peuvent aussi survenir. Peu d'études ont exploré le VHS-1 dans un contexte agroalimentaire. Bien que le VHS-1 ne soit pas considéré comme un virus d'origine alimentaire, certains travaux ont démontré qu'il pouvait survivre dans l'environnement alimentaire. En plus de persister sur des surfaces couramment rencontrées en industrie alimentaire et sur des aliments fréquemment consommés, la majorité des personnes infectées sont des porteurs asymptomatiques du VHS-1, ce qui contribue grandement à la propagation de celui-ci. D'ailleurs, la main-d'œuvre pratiquant de mauvaises habitudes d'hygiène et le concept de partage entre les individus (partage d'aliments, de boissons, d'ustensiles, etc.) sont des facteurs qui augmentent le risque de transmission du VHS-1. Ce mémoire avait comme objectif d'étudier la persistance du VHS-1 sur des surfaces en contact avec les aliments et sur des aliments prêts-à-manger qui peuvent se partager ; en plus d'évaluer également le potentiel de transfert du VHS-1 d'une surface non poreuse vers un gant. Ce projet de maîtrise a démontré que les surfaces et les aliments pouvaient être des vecteurs potentiels de transmission du VHS-1, puisqu'une récupération du virus infectieux était possible selon les conditions environnementales. En effet, la température, le pH des aliments et potentiellement des composés avec des propriétés antivirales ont affecté la persistance du VHS-1. En conclusion, les résultats de ce mémoire ont pour but de sensibiliser et d'éduquer la population en ce qui a trait aux risques de transmission du VHS-1 entre les personnes. / Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) is an enveloped virus that is highly contagious and widespread throughout the world, where 67 % of the world's population is infected. This virus causes mild lifelong diseases, which herpes labialis (or cold sores) is the most common one. However, much more serious infections, such as encephalitis, can also occur. Few studies have explored HSV-1 in an agri-food context. Although HSV-1 is not considered a foodborne virus, some studies have shown that it can survive in the food environment. In addition to persisting on surfaces commonly encountered in the food industry and on frequently consumed foods, most infected people are asymptomatic carriers of HSV-1, which greatly contributes to the spread of this virus. Moreover, the food handlers that have poor hygiene practices and the concept of sharing (sharing food, drinks, utensils, etc.) are factors that may increase HSV-1 transmission. The objective of this thesis was to study the persistence of HSV-1 on surfaces in contact with food and ready-to-eat (RTE) foods that can be shared; and assess the potential for transmission of HSV-1 from a non-porous surface to a glove. This master's project demonstrated that surfaces and food could be potential vectors of HSV-1 since recovery of infectious virus was possible depending on environmental conditions. Indeed, the persistence of HSV-1 was affected by the temperature, the food pH and potentially compounds with antiviral properties. In conclusion, the results of this thesis are intended to raise awareness and educate the population regarding the risks of transmission of HSV-1 between people.

Les Virus herpès simplex sont connus pour infecter les gens partout dans le monde et possèdent l'habileté d'établir un état de latence. Les manifestations cliniques les plus sévères d'une infection avec les virus herpès simplex sont observées chez les patients imInunosupprimés qui peuvent être infectés avec des souches virales résistantes aux antiviraux. Les mutations causant la résistance à l'antiviral acyclovir peuvent se retrouver soit au niveau de l'ADN polymérase ou de la thymidine kinase virale, tandis que les mutations entraînant une résistance au foscamet se retrouvent seulement au niveau de l'ADN polymérase. Lors de ce projet, nous avons testé les capacités réplicatives, la neurovirulence, ainsi que l'habileté à établir un état de latence pour quatres souches virales mutantes isolées de patients atteints du VIH ne répondant pas aux traitements antiviraux avec l'acyclovir et/ou le foscamet. Nous avons observé que le mutant au niveau de l'ADN polymérase S724N résistant à l'acyclovir et au foscamet possède des caractéristiques similaires au virus de type sauvage, tandis qu'un autre Inutant au niveau de l'ADN polymérase, L850I, démontrait une capacité replicative et une neurovirulence diminuées. Le virus mutant au niveau de la thymidine kinase, G439.5, ainsi que le virus double mutant au niveau des deux gènes C467del/A912V avaient des capacités réplicatives réduites ainsi qu'une neurovirulence atténuée, mais possédaient la capacité d'établir une latence. Ce projet nous a donc permis de démontrer que des études in vitro de réplication virale de différents virus herpès simplex résistants aux antiviraux peuvent aider à prédire le niveau de virulence de ces virus dans des modèles animaux.

La structure des ADN polymérases (pol) du cytomégalovirus humain (CMV) et du virus herpès simplex 1 (VHS-1), appartenant tous deux à la famille des Herpesviridae, est associée à la forme d'une main droite comportant entre autres les domaines de la paume, du pouce et des doigts. L'ADN pol adopte différentes conformations (ouverte et fermée) impliquant un mouvement du domaine des doigts dans le but de faciliter l'interaction entre le nucléotide et l'ADN en cours d'élongation. Il a été montré que l'antiviral foscarnet (FOS) qui cible l'ADN pol du CMV et du VHS-1 se lierait à l'enzyme quand elle est dans sa conformation fermée et que des mutations dans le domaine des doigts conférant la résistance à cet antiviral favoriseraient une conformation plus ouverte de l'enzyme pour laquelle le FOS a une affinité plus faible. Nous avons voulu analyser si cette hypothèse s'appliquait également à des mutations qui sont localisées dans des régions du domaine NH₂-terminal et de la paume qui interagissent avec le domaine des doigts lors des changements de conformation de l'enzyme au cours de la réaction de polymérisation. Notre hypothèse est que des mutations localisées dans l'hélice K (domaine NH₂-terminal) et la région II (domaine de la paume) qui participent aux changements de conformation de l'enzyme pourraient favoriser une conformation plus ouverte des ADN pol virales, et par conséquent, réduire la sensibilité des virus au FOS. Nous avons donc sélectionné des substitutions théoriques en utilisant une stratégie basée sur l'alignement des séquences en acides aminés des ADN pol du CMV et du VHS-1 (sensibles au FOS) avec celles des bactériophages RB69 et T4 (résistantes au FOS). Nous avons tenté de générer les virus recombinants CMV et VHS-1 possédant les différentes substitutions théoriques sélectionnées. Cependant, l'introduction de certaines substitutions [Q578P, R581T, L587F (hélice K), P712Y, F718L (région II) pour le CMV et Q617P, R620T, L626F (hélice K), F718L (région II) pour le VHS-1] étaient délétères pour les ADN pol, ce qui empêchait les virus recombinants de se répliquer en culture cellulaire. Parmi les substitutions sélectionnées dans l'hélice K, la substitution I619K confère une résistance du VHS-1 au FOS. Au sein de l'hélice K, nous avons également caractérisé la substitution théorique Q579I qui conférait une hypersensibilité du CMV au FOS. Nous avons caractérisé cette substitution en la comparant à la mutation K805Q localisée dans l'hélice P (domaine des doigts) déjà connue pour induire une hypersensibilité du CMV au FOS. Dans la région II, les substitutions V715S et A719T confèrent une résistance des deux virus au FOS. La substitution Q697P du CMV confère une résistance du CMV au FOS mais pas pour le VHS-1. Les profils de sensibilité des virus recombinants au FOS ont également été confirmés par des tests enzymatiques dans lesquels nous avons déterminé l'inhibition de l'activité des ADN pol recombinantes mutées par cet antiviral. Nous avons également constaté une diminution des capacités réplicatives des CMV et VHS-1 recombinants possédant ces substitutions par rapport à celle des virus sauvages correspondants. Des analyses tri-dimensionnelles ont été réalisées et ont suggéré que les substitutions conférant une résistance au FOS seraient associées à une déstabilisation de la conformation fermée des ADN pol et favoriseraient une conformation plus ouverte pour laquelle l'antiviral a une plus faible affinité. D'autre part, les modélisations tri-dimensionnelles des protéines possédant les substitutions conférant une hypersensibilité au FOS ont montré que les ADN pol favorisaient une conformation plus fermée pour laquelle le FOS a une plus grande affinité. La caractérisation de la substitution théorique V715S du CMV et du VHS-1 (FOSᴿ/GCVᴿ et FOSᴿ/ACVᴿ, respectivement) a été comparée aux substitutions V715G du VHS-1 (FOSᴿ/ACVᴿ), V715M du CMV et du VHS-1 (FOSᴿ/GCV[exposant S] et FOS[exposant S]/ACVᴿ, respectivement), déjà décrites dans la littérature. Brièvement, nous avons montré que l'introduction de ces différentes substitutions induisaient des changements au niveau de l'environnement hydrophobe de la valine à la position 715 influençant ainsi les phénotypes de sensibilité aux antiviraux observés. L'ensemble de ces résultats nous ont permis d'appuyer notre hypothèse selon laquelle les mutations localisées dans l'hélice K et la région II peuvent influencer la sensibilité des virus au FOS en modifiant la structure de la protéine et en interférant avec les changements de conformation de l'enzyme. / The structure of the human cytomegalovirus (HCMV) and herpes simplex virus 1 (HSV-1) DNA polymerase (pol), belonging to the Herpesviridae family, is associated to a right hand with palm, thumb and fingers domains. The viral DNA pol adopts different conformations (open and closed) that implies a move of the fingers domain to facilitate the interaction between the nucleotide and the elongating DNA. It has been shown that the antiviral foscarnet (FOS) which targets the HCMV and HSV-1 DNA pol binds to the enzyme in its closed conformation and mutations confering resistance to this antiviral and localised in the fingers domain would favor a more open conformation of the enzyme for which FOS has a lower affinity. The aim of this thesis was to analyse whether this hypothesis could be extended to mutations localised in the NH₂-terminal and the palm domains which interact with the fingers domain during the conformational changes of the enzyme during the polymerization process. Our hypothesis is that mutations localized in the helix K (NH₂-terminal domain) and region II (palm domain) that participate in the conformational changes of the enzyme could favor a more open conformation of the viral DNA pol, and thus, decrease the susceptibility of viruses to FOS. We selected theoretical substitutions using a strategy based on amino acid sequences alignement of the DNA pol of HCMV and HSV-1 (susceptible to FOS) with those of RB69 and T4 bacteriophages (naturally resistants to this antiviral). We tried to generate recombinant HCMV and HSV-1 containing the different theoretical substitutions that we selected. However, the introduction of some theoretical substitutions [Q578P, R581T, L587F (helix K), P712Y, F718L (region II) for HCMV and Q617P, R620T, L626F (helix K), F718L (region II) for HSV-1] was so detrimental for the DNA pol that recombinant viruses were not able to grow in cell culture. Among the substitutions selected in the helix K, the substitution I619K confers resistance of HSV-1 to FOS. In the helix K, we also characterized the theoretical Q579I substitution that confers hypersusceptibility of HCMV to FOS. We compared this substitution with the K805Q substitution located in the helix P (fingers domain), already known to induce hypersusceptibility of HCMV to FOS. In region II, substitutions V715S and A719T confer resistance of both viruses to FOS whereas the Q697P substitution was associated with resistance of HCMV to FOS but not for HSV-1. The susceptibility profiles of recombinant viruses to FOS were confirmed by enzymatic assays that allowed us to determine the inhibition of the recombinant mutated DNA pol activity by this antiviral compound. We observed a decrease of the replicative capacities of recombinant HCMV and HSV-1 harboring these mutations compared to their wild-type counterparts. Tri-dimensional modeling was also performed to better understand the impact of these substitutions on the DNA pol of HCMV and HSV-1. On the one hand, substitutions confering resistance to FOS were associated to a destabilization of the closed conformation of the DNA pol and would favor a more open conformation for which the antiviral has a lower affinity. On the other hand, substitutions associated to a hypersusceptibility profile would favor a more closed conformation of the DNA pol for which FOS has a higher affinity. The characterization of the theoretical substitution V715S of HCMV and HSV-1 (FOSᴿ/GCVᴿ and FOSᴿ/ACVᴿ, respectively) was compared to the substitutions V715G of HSV-1 (FOSᴿ/ACVᴿ), V715M of HCMV and HSV-1 (FOSᴿ/GCV[superscript S] and FOS[superscript S]/ACVᴿ, respectively), already described in the literature and that were, thus, associated with different antiviral susceptibility phenotypes compared to those of V715S. Briefly, we showed that the introduction of these different substitutions could induce varying changes of the hydrophobic environment of the valine at position 715 influencing the antiviral susceptibility profile. Altogether, these results support our hypothesis that substitutions in helix K and region II could influence the susceptibility of HCMV and HSV-1 to FOS by modifiying the protein structure and impacting the correct conformational changes of the enzyme.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les infections au virus herpès simplex I (VHS-1) sont souvent bénignes mais peuvent être responsables de pathologies sévères, telle que l'infection du système nerveux central, telle que l'encéphalite herpétique (EH). Cette dernière représente l'encéphalite virale sporadique la plus répandue dans les pays développés. Malgré la disponibilité des antiviraux, le taux de mortalité est de plus que 30%. De plus, la majorité des survivants souffrent des séquelles neurologiques. Le mécanisme par lequel l'encéphalite herpétique est létale n'est pas encore clairement établi. Bien que la réplication virale cause des dommages importants, de plus en plus d'évidences suggèrent que l'inflammation induite en réponse à l'infection joue également un rôle dans la pathogénèse de cette maladie. L'hypothèse principale de notre équipe est que la réponse immunitaire cérébrale innée induite au cours de cette infection est une arme à double tranchant car elle est critique pour contenir la réplication virale dans le cerveau durant la phase précoce de la maladie, mais si elle est incontrôlée, elle peut résulter en une réponse inflammatoire exacerbée qui peut être néfaste. Les microglies sont les seules cellules immunitaires résidentes du cerveau. Plusieurs études ont rapporté que ces cellules qui forment la première ligne de défense, jouaient un rôle clé dans le contrôle des infections du SNC. En revanche, la microglie réactive semblerait contribuer à la neuroinflammation. De plus, il est proposé que ces microglies réactives participent à la perturbation de la barrière hématoencéphalique au cours de l'EH, que nous avons également pu constater chez la souris BALB/c infectée par la voie intranasale, décrite dans la première partie de nos travaux. Cependant, le rôle exact des microglies dans l'EH n'a pas encore été élucidé. Alors, nous avons décidé de mener des travaux dans le but de comprendre l'implication des microglies dans le contrôle de l'EH et de caractériser les mécanismes exploités par ces cellules. Pour atteindre nos objectifs, nous avons d'abord évalué l'effet de l'activation des microglies par le « macrophage colony-stimulating factor » (M-CSF) administré avant l'infection. Ce traitement a significativement augmenté la survie des souris et diminué les titres viraux cérébraux au J6 p.i. En parallèle, l'augmentation du nombre de microglies CD68⁺ observée dans les cerveaux des souris traitées avec du M-CSF a mené à l'hypothèse que la microglie CSF1R⁺ était responsable de cette amélioration du pronostic de l'EH. Pour répondre à cette question, nous avons déplété la microglie chez des souris CSF1R-loxP-CX3CR1-cre/ERT2. Le taux de survie réduit et des titres viraux cérébraux plus élevés pour ces souris déplétées des microglies ont souligné l'importance de la réponse microgliale dans la phase précoce de l'infection. Suivant ces observations, les mécanismes impliqués dans la réponse immunitaire microgliale au cours de l'EH ont été étudiés à l'aide de la microscopie électronique et du séquençage d'ARNm sur une cellule unique. Dans cette partie, nous avons étudié uniquement les microglies situées dans le noyau postéro-ventral (VPL, pour « Ventral posterolateral nucleus »), qui a été identifié, à l'aide du VHS-1 recombinant neurovirulent que nous avons décrit dans la première partie des travaux, comme la région la plus infectée du cerveau chez des souris C57BL/6 au J6 p.i. Nos analyses ont confirmé que ces cellules limitaient l'infection à l'aide de la phagocytose et de la présentation d'antigènes. En outre, nous avons pu décrire une nouvelle réponse transcriptionnelle, associée à une population cellulaire rare, que nous avons appelées des microglies « en transition ». L'expression élevée des transcrits viraux par ces cellules pourrait correspondre à la réponse immunitaire antivirale intrinsèque des microglies infectées par le VHS-1 dans le VPL. Enfin, l'analyse de ce transcriptome révélant l'augmentation d'expression des gènes impliqués dans la production d'interleukine IL-1β médiée par l'inflammasome NLRP (pour « Nucleotide-binding oligomerization domain, Leucine rich Repeat and Pyrin domain containing ») 3, a suggéré que ces microglies « en transition » infectées favoriseraient l'exacerbation de l'inflammation au cours de l'EH L'ensemble de nos données montrent que les microglies sont nécessaires en phase précoce pour un meilleure contrôle de l'EH. Ceci peut évoluer vers un phénotype pro-inflammatoire et contribuer ensuite à l'exacerbation de l'inflammation. De plus, nos résultats suggèrent que l'infection de ces microglies du VPL par le VHS-1 pourrait ainsi induire l'acquisition de cette réponse transcriptionelle pro-inflammatoire. / Herpes simplex virus I (HSV-1) infections are often mild, but can be responsible for severe pathologies, such as the infection of the central nervous system, also called herpes simplex encephalitis (HSE). The latter is the most common sporadic viral encephalitis in developed countries. Despite available antivirals, the mortality rate is higher than 30%. In addition, most survivors suffer from neurological sequelae. The mechanism by which herpes encephalitis is lethal is not yet clearly established. Although viral replication causes significant neural damage, growing evidence suggests that the inflammatory response also plays a major role in the pathogenesis of HSE. The main hypothesis of our team is that the innate immune response induced by HSV-1 infection is a double-edged sword. We believe that this immune response, critical to limit viral replication in the brain during the early phase of the disease, become later uncontrolled, and result in an exacerbated inflammatory response which is deleterious. Microglia are the only resident immune cells in the brain. Several studies reported that these cells, which form the first line of defense, play a key role in controlling CNS infections. In contrast, reactive microglia appear to contribute to neuroinflammation. In addition, it is proposed that these reactive microglia participate in the disruption of the blood-brain barrier during HSE, which we have also been able to observe in intranasally-infected BALB/c mice, as described in the first part of our work. However, the exact role of microglia in HE has not yet been elucidated. So, we decided to conduct this research to understand the involvement of microglia in the control of HE and to characterize the mechanisms exploited by these cells. We first evaluated the effect of microglial activation by macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) administered prior to the infection. This treatment significantly increased survival rate and decreased brain viral titers at day 6 pi. In parallel, the increased number of CD68⁺ microglia found in the brains of M-CSF treated mice led the question whether CSF1R⁺ microglia were responsible for this improvement of HSE prognosis. To answer that question, we depleted microglia using CSF1R-loxP-CX3CR1-cre/ERT2 mice. The reduced survival rate and higher brain viral titers for these microglia-depleted mice highlighted the importance of the microglial response during the early phase of infection. Following these observations, the mechanisms involved in the microglial immune response during HSE have been investigated using electron microscopy and single cell mRNA sequencing. In this part, we studied only the microglia located at VPL, which was identified as the most infected region of the infected C57BL/6 brain on day 6 p.i. using a new neurovirulent recombinant HSV-1 that we described in the first part of our work. Our results confirmed that microglia limit the infection by phagocytosis and antigen presentation. Furthermore, we described a new transcriptional response, associated with a rare cell population in VPL (Ventral posterolateral nucleus), which we called "in transition" microglia. The high expression of viral transcripts by these cells suggested that this distinct transcriptome might correspond to the intrinsic antiviral immune response of HSV-1-infected microglia in the VPL. Finally, the analysis of this transcriptome revealing the increased expression of genes involved in the production of interleukin IL-1β mediated by the NLRP3 inflammasome, suggested that these infected "in transition" microglia would promote the exacerbation of the inflammation in HE. Altogether, our work shows that the microglia, necessary in the early phase for a better control of HSE, can evolve towards a pro-inflammatory phenotype and contribute to the exacerbation of inflammation. Moreover, our results suggest that the infection of microglia by HSV-1 in VPL could thus induce the acquisition of this pro-inflammatory transcriptional response.

La résistance du virus herpes simplex (VHS) aux antiviraux, particulièrement chez des sujets immunosupprimés, et sa capacité d’envahir le système nerveux central soulèvent de nombreuses questions au niveau clinique. Des mutations au sein du gène de la thymidine kinase et de l’ADN polymérase virale sont responsables de la résistance aux traitements antiviraux. Il est donc important d’élucider davantage les différents mécanismes moléculaires à l’origine de ces évènements de résistance et de développer de nouvelles avenues thérapeutiques. De plus, le VHS est la cause la plus fréquente d’encéphalite sporadique et potentiellement fatale dans les pays de l’ouest. Ce type de pathologie est occasionné en partie par une intense réplication virale mais également par une réponse immunologique encore incomprise jusqu’à maintenant. Les travaux présentés dans cette thèse de doctorat ont pour but de développer de nouveaux modèles in vitro et in vivo permettant d’étudier ces deux facettes importantes du VHS. L’impact de certaines mutations et l’effet d’un nouveau traitement dans la résistance du VHS aux antiviraux ont été évalués. La réponse immunitaire innée cérébrale de même qu’une nouvelle approche thérapeutique en rapport avec une encéphalite à VHS ont également été caractérisées. / Herpes simplex virus (HSV) resistance to antiviral treatment is a real concern among immunocompromised population. Mutations localized in the thymidine kinase (TK) and/or the DNA polymerase (pol) genes are mainly responsible for those resistance issues. Thus, it is becoming important to increase knowledge in this area and to develop new therapeutic strategies. Also, HSV has this unique biological property to invade the nervous central system and causes encephalitis. During this type of infection, an important immunological process occurs. However, this inflammatory response is still very controversial and needs to be elucidated. The main objectives of this doctoral thesis consisted of: 1- the characterization of antiviral resistance and 2- the elucidation of the brain inflammatory response to HSV. The first part consisted in the development of an in vitro system allowing the characterization of several mutations in the TK and/or the DNA pol genes responsible for antiviral resistance and the elaboration of a new antiviral strategy. The second part was to characterize the inflammatory response following the induction of HSV-1 encephalitis in a mouse model and to develop an alternative immunomodulatory approache. Mutations localized in conserved and non-conserved regions of the TK are associated with ACV resistance. Hydroxyurea increases the activity of nucleoside (ACV) and nucleotide (CDV) analogues. A delayed glucocorticoid treatment is highly beneficial by decreasing the brain viral load as well as pro-inflammatory cytokine production in the brain of infected mice. TNF- and IL-1permit the initiation of an innate immune response allowing a control of the viral replication and an efficient transition to the adaptive immune response required for viral clearance during HSV-1 encephalitis. A prophylactic treatment with a TLR3 agonist significantly increases the mean life expectancy and survival rate of mice infected with HSV-1 compared to non-treated mice. The experimental models developed during this Ph. D. allow a better understanding of the molecular mechanisms of resistance and of the brain inflammatory response to the HSV.

Les infections au virus herpès simplex I (VHS-1) sont souvent bénignes mais peuvent être responsables de pathologies sévères, telle que l'infection du système nerveux central, telle que l'encéphalite herpétique (EH). Cette dernière représente l'encéphalite virale sporadique la plus répandue dans les pays développés. Malgré la disponibilité des antiviraux, le taux de mortalité est de plus que 30%. De plus, la majorité des survivants souffrent des séquelles neurologiques. Le mécanisme par lequel l'encéphalite herpétique est létale n'est pas encore clairement établi. Bien que la réplication virale cause des dommages importants, de plus en plus d'évidences suggèrent que l'inflammation induite en réponse à l'infection joue également un rôle dans la pathogénèse de cette maladie. L'hypothèse principale de notre équipe est que la réponse immunitaire cérébrale innée induite au cours de cette infection est une arme à double tranchant car elle est critique pour contenir la réplication virale dans le cerveau durant la phase précoce de la maladie, mais si elle est incontrôlée, elle peut résulter en une réponse inflammatoire exacerbée qui peut être néfaste. Les microglies sont les seules cellules immunitaires résidentes du cerveau. Plusieurs études ont rapporté que ces cellules qui forment la première ligne de défense, jouaient un rôle clé dans le contrôle des infections du SNC. En revanche, la microglie réactive semblerait contribuer à la neuroinflammation. De plus, il est proposé que ces microglies réactives participent à la perturbation de la barrière hématoencéphalique au cours de l'EH, que nous avons également pu constater chez la souris BALB/c infectée par la voie intranasale, décrite dans la première partie de nos travaux. Cependant, le rôle exact des microglies dans l'EH n'a pas encore été élucidé. Alors, nous avons décidé de mener des travaux dans le but de comprendre l'implication des microglies dans le contrôle de l'EH et de caractériser les mécanismes exploités par ces cellules. Pour atteindre nos objectifs, nous avons d'abord évalué l'effet de l'activation des microglies par le « macrophage colony-stimulating factor » (M-CSF) administré avant l'infection. Ce traitement a significativement augmenté la survie des souris et diminué les titres viraux cérébraux au J6 p.i. En parallèle, l'augmentation du nombre de microglies CD68⁺ observée dans les cerveaux des souris traitées avec du M-CSF a mené à l'hypothèse que la microglie CSF1R⁺ était responsable de cette amélioration du pronostic de l'EH. Pour répondre à cette question, nous avons déplété la microglie chez des souris CSF1R-loxP-CX3CR1-cre/ERT2. Le taux de survie réduit et des titres viraux cérébraux plus élevés pour ces souris déplétées des microglies ont souligné l'importance de la réponse microgliale dans la phase précoce de l'infection. Suivant ces observations, les mécanismes impliqués dans la réponse immunitaire microgliale au cours de l'EH ont été étudiés à l'aide de la microscopie électronique et du séquençage d'ARNm sur une cellule unique. Dans cette partie, nous avons étudié uniquement les microglies situées dans le noyau postéro-ventral (VPL, pour « Ventral posterolateral nucleus »), qui a été identifié, à l'aide du VHS-1 recombinant neurovirulent que nous avons décrit dans la première partie des travaux, comme la région la plus infectée du cerveau chez des souris C57BL/6 au J6 p.i. Nos analyses ont confirmé que ces cellules limitaient l'infection à l'aide de la phagocytose et de la présentation d'antigènes. En outre, nous avons pu décrire une nouvelle réponse transcriptionnelle, associée à une population cellulaire rare, que nous avons appelées des microglies « en transition ». L'expression élevée des transcrits viraux par ces cellules pourrait correspondre à la réponse immunitaire antivirale intrinsèque des microglies infectées par le VHS-1 dans le VPL. Enfin, l'analyse de ce transcriptome révélant l'augmentation d'expression des gènes impliqués dans la production d'interleukine IL-1β médiée par l'inflammasome NLRP (pour « Nucleotide-binding oligomerization domain, Leucine rich Repeat and Pyrin domain containing ») 3, a suggéré que ces microglies « en transition » infectées favoriseraient l'exacerbation de l'inflammation au cours de l'EH L'ensemble de nos données montrent que les microglies sont nécessaires en phase précoce pour un meilleure contrôle de l'EH. Ceci peut évoluer vers un phénotype pro-inflammatoire et contribuer ensuite à l'exacerbation de l'inflammation. De plus, nos résultats suggèrent que l'infection de ces microglies du VPL par le VHS-1 pourrait ainsi induire l'acquisition de cette réponse transcriptionelle pro-inflammatoire. / Herpes simplex virus I (HSV-1) infections are often mild, but can be responsible for severe pathologies, such as the infection of the central nervous system, also called herpes simplex encephalitis (HSE). The latter is the most common sporadic viral encephalitis in developed countries. Despite available antivirals, the mortality rate is higher than 30%. In addition, most survivors suffer from neurological sequelae. The mechanism by which herpes encephalitis is lethal is not yet clearly established. Although viral replication causes significant neural damage, growing evidence suggests that the inflammatory response also plays a major role in the pathogenesis of HSE. The main hypothesis of our team is that the innate immune response induced by HSV-1 infection is a double-edged sword. We believe that this immune response, critical to limit viral replication in the brain during the early phase of the disease, become later uncontrolled, and result in an exacerbated inflammatory response which is deleterious. Microglia are the only resident immune cells in the brain. Several studies reported that these cells, which form the first line of defense, play a key role in controlling CNS infections. In contrast, reactive microglia appear to contribute to neuroinflammation. In addition, it is proposed that these reactive microglia participate in the disruption of the blood-brain barrier during HSE, which we have also been able to observe in intranasally-infected BALB/c mice, as described in the first part of our work. However, the exact role of microglia in HE has not yet been elucidated. So, we decided to conduct this research to understand the involvement of microglia in the control of HE and to characterize the mechanisms exploited by these cells. We first evaluated the effect of microglial activation by macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) administered prior to the infection. This treatment significantly increased survival rate and decreased brain viral titers at day 6 pi. In parallel, the increased number of CD68⁺ microglia found in the brains of M-CSF treated mice led the question whether CSF1R⁺ microglia were responsible for this improvement of HSE prognosis. To answer that question, we depleted microglia using CSF1R-loxP-CX3CR1-cre/ERT2 mice. The reduced survival rate and higher brain viral titers for these microglia-depleted mice highlighted the importance of the microglial response during the early phase of infection. Following these observations, the mechanisms involved in the microglial immune response during HSE have been investigated using electron microscopy and single cell mRNA sequencing. In this part, we studied only the microglia located at VPL, which was identified as the most infected region of the infected C57BL/6 brain on day 6 p.i. using a new neurovirulent recombinant HSV-1 that we described in the first part of our work. Our results confirmed that microglia limit the infection by phagocytosis and antigen presentation. Furthermore, we described a new transcriptional response, associated with a rare cell population in VPL (Ventral posterolateral nucleus), which we called "in transition" microglia. The high expression of viral transcripts by these cells suggested that this distinct transcriptome might correspond to the intrinsic antiviral immune response of HSV-1-infected microglia in the VPL. Finally, the analysis of this transcriptome revealing the increased expression of genes involved in the production of interleukin IL-1β mediated by the NLRP3 inflammasome, suggested that these infected "in transition" microglia would promote the exacerbation of the inflammation in HE. Altogether, our work shows that the microglia, necessary in the early phase for a better control of HSE, can evolve towards a pro-inflammatory phenotype and contribute to the exacerbation of inflammation. Moreover, our results suggest that the infection of microglia by HSV-1 in VPL could thus induce the acquisition of this pro-inflammatory transcriptional response.

Les virus herpès simplex (VHS) possèdent une propriété biologique unique très importante, soit la neurovirulence. Les VHS peuvent ainsi atteindre le système nerveux central (SNC) et causer une encéphalite. Cette infection déclenche une réponse inflammatoire menant à l'infiltration de cellules immunitaires périphériques dans le SNC. De ce fait, l'encéphalite représente l'infection associée au VHS de type 1 (VHS-1) la plus dévastatrice et est la principale cause d'encéphalite sporadique virale, potentiellement fatale dans les pays développés. Bien que différents modèles animaux permettent l'étude de l'encéphalite, la complexité du SNC et de sa réponse immunitaire en limite encore notre compréhension. L'objectif de recherche principal de cette thèse est de mieux comprendre la réponse immunitaire innée impliquant différentes voies de signalisation associées à la reconnaissance du VHS-1. Les travaux réalisés dans le cadre de cette thèse de doctorat ont permis de démontrer le rôle clé de 1TFN-β, de la voie de signalisation des récepteurs Tolllike 3 (TLR3) et TLR9 ainsi que des protéines adaptatrices TRIF et IPS-1. Ainsi, le prétraitement des souris par un agoniste du TLR3 permet de créer un environnement proinflammatoire qui est néfaste à la replication virale initiale, permettant, à des temps plus tardifs, de diminuer la production de cytokines et de la charge virale. De plus, la stimulation de la voie du TLR9 est bénéfique avant l'infection, mais il est nécessaire de contenir celle-ci suite à l'infection. Comme il l'a déjà été suggéré, 1TFN-β peut exercer un effet bénéfique contre l'infection au VHS-1 mais le dosage et le temps d'administration après l'infection peuvent fortement influencer la replication virale et la survie. Enfin, les protéines adaptatrices TRIF et IPS-1 jouent un rôle très important au niveau de la réponse immunitaire innée en menant à la production d'IFN-β, bien que TRIF affecte davantage la replication virale précoce qu'IPS-1. Ainsi, au cours de ce doctorat, plusieurs modèles expérimentaux ont été développés pour mieux comprendre la réponse immunitaire innée au niveau du SNC au cours de l'encéphalite herpétique, le recrutement de différentes cellules immunitaires ainsi que pour mieux caractériser le rôle de l'IFN-β.

L’infection du système nerveux central (SNC) par le virus herpès simplex 1 (VHS-1) peut mener au développement d’une encéphalite herpétique qui représente l’infection cérébrale sporadique la plus répandue dans les pays développés. Cette infection dévastatrice a une prévalence de 1/250 000 individus, et atteint un taux de mortalité de 30% malgré l’administration d’un traitement antiviral à base d’acyclovir. De plus, la majorité des patients qui survivent à l’infection conservent des séquelles neurologiques graves et permanentes. Il est suggéré, qu’en plus des dommages causés par la réplication virale, la réponse immunitaire inflammatoire induite par l’infection serait responsable de l’exacerbation de l’encéphalite herpétique. Cette réponse inflammatoire est initiée par les macrophages résidents du SNC, nommés microglies. Dans certains désordres neurologiques, Il est proposé qu’en plus des microglies, les monocytes sanguins pourraient infiltrer le SNC et participer à la réponse immunitaire. Les connaissances concernant le recrutement des monocytes périphériques au SNC et leur rôle dans l’élaboration de la réponse immunitaire durant l’encéphalite herpétique sont très limitées. Une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans cette réponse dirigée contre l’infection du cerveau par le VHS-1 pourrait permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et mener au développement de nouvelles stratégies combinant des antiviraux et des agents immunomodulateurs pour contrôler à la fois la propagation du virus et l'état inflammatoire dans le SNC. Les travaux présentés dans le cadre de cette thèse s’intéressent à l’implication des monocytes périphériques recrutés au niveau du cerveau dans la réponse immunitaire innée développée dans un modèle murin d’encéphalite herpétique. Pour atteindre nos objectifs, nous avons d’abord utilisé des souris chimériques dont les précurseurs myéloïdes dérivés de la moelle osseuse et les leucocytes sanguins expriment la protéine fluorescente verte (GFP pour «green fluorescent protein»). Ce modèle nous a principalement permis de distinguer les macrophages d’origine hématopoïétique des microglies résidentes du SNC car il n’existe aucun marqueur naturel permettant de différencier ces deux populations cellulaires. Cette stratégie nous a aidé à mieux caractériser la cinétique d’infiltration des monocytes, leur localisation dans le cerveau, et leur participation à la réponse immunitaire suite à l’infection du SNC par le VHS-1. La deuxième partie des travaux porte sur les mécanismes impliqués dans le recrutement de ces monocytes et dans le contrôle de l’état inflammatoire au niveau du SNC durant l’encéphalite herpétique. Plus précisément, les expériences réalisées s’intéressent aux rôles de la signalisation via les récepteurs de chimiokines CCR2 et CX3CR1, exprimés à la surface des monocytes sanguins et des microglies, dans la protection ainsi que dans le recrutement des deux sous-types de monocytes sanguins, soient les monocytes «inflammatoires» et «patrouilleurs», au cours de l’encéphalite herpétique. Nos résultats ont montré pour la première fois que les monocytes sanguins infiltraient le SNC pour donner naissance à des macrophages ayant le même profil que les microglies résidentes et que ces cellules participaient à la réponse immunitaire suite à l’infection par le VHS-1. Nous avons également démontré, en utilisant des souris chimériques ayant des déficiences compartimentées en récepteurs CX3CR1 et CCR2 au niveau du SNC au niveau du système hématopoïétique, que les voies de signalisation via CX3CR1 au niveau des cellules résidentes du cerveau et de CCR2 au niveau des cellules hématopoïétiques étaient importantes pour la survie des souris, pour le contrôle de la réplication virale ainsi que pour contenir la réponse inflammatoire cérébrale durant l’encéphalite herpétique expérimentale. / Herpes simplex virus 1 (HSV-1) is the main cause of sporadic viral encephalitis in developed countries with an annual incidence of 1/250 000 individuals per year. Despite the use of acyclovir that aimed at blocking virus replication, the mortality rate associated with HSV encephalitis (HSE) is still high (i.e., 30%), with the majority of surviving patients developing severe neurological sequelae. It is believed that the high mortality rate and neurological disorders attributable to HSE could involve both virally- and immune-induced damages of the central nervous system (CNS). The inflammatory response is initiated by the resident macrophages of the brain, namely microglia. In addition, blood leukocytes, particularly monocytes, are thought to infiltrate the CNS and contribute to the control of viral infection together with microglia. However, it is also argued that these cells may also amplify the inflammatory response, thereby contributing to brain damages. Knowledge concerning the recruitment of peripheral monocytes to the CNS and their role in the immune response during HSE is limited. A better understanding of the mechanisms involved in their dynamic of recruitment might lead to the identification of new therapeutic targets and the development of new strategies combining antiviral agents and immunomodulatory molecules to better control both HSV replication as well as the inflammatory environment in the CNS. The studies presented in this thesis are intended to better evaluate the involvement of monocytes-derived macrophages, together with microglia, in the cerebral innate immune response during experimental HSE. To achieve our goals, we first used chimeric mice in which bone marrow progenitor cells and blood leukocytes express the green fluorescent protein (GFP). This model allowed us to better characterize the kinetics of infiltration of blood monocytes into the CNS, their distribution in different anatomical areas of the brain and their involvement in the immune response during experimental HSE. The second part of the work focuses on the mechanisms involved in the recruitment of monocytes into the CNS and in the control of the inflammatory state in mouse brain following HSV-1 infection. More precisely, experiments aimed at characterizing the role of signaling pathways through chemokine receptors CCR2 and CX3CR1, expressed on the surface of blood monocytes and microglia, in protecting and modulating the recruitment of the two blood monocytes subtypes, namely the "inflammatory" and "patrolling" monocytes, during HSE. To achieve this aim, we used chimeric mouse models of CCR2- and CX3CR1-deficient animals, in which the lack of either receptor was restricted to the hematopoietic system (blood monocytes) or the CNS (microglia). Our results showed that blood monocytes are recruited to the CNS following HSV-1 infection and give rise to microglia-like macrophages. These cells are involved in the immune response together with microglia by performing immunological functions including phagocytosis and antigen presentation. Furthermore, we showed that CX3CR1 and CCR2 expressed on cells of the CNS and in the hematopoietic system, respectively, are important for mouse survival, viral replication control and in maintaining an appropriate inflammatory response during experimental HSE.

La résistance du virus de l’herpès simplex (VHS) aux antiviraux est un problème courant chez les individus immunosupprimés. Des mutations au sein du gène de la thymidine kinase (TK) virale sont principalement à l’origine de la résistance au traitement de première ligne, i.e. les analogues des nucléosides. La cible ultime de tous les antiviraux anti-herpétique demeure cependant l’ADN polymérase (pol) virale. Ces deux gènes viraux (TK et ADN pol) démontrent un certain degré de polymorphisme génétique et il peut devenir difficile d’identifier avec certitude les mutations responsables de la résistance aux antiviraux. Les travaux présentés dans cette thèse de Doctorat démontrent le développement de nouvelles méthodes afin d’établir un lien entre l’apparition de mutations au niveau de gênes viraux et un phénotype de résistance particulier. Un système d’expression du gène de la TK virale chez le parasite Leishmania et un ensemble de cosmides et de plasmides recombinants permettant de générer des virus ADN pol mutants ont été mis au point. Ces nouvelles stratégies nous ont permis de caractériser les mutations virales impliquées dans la résistance aux antiviraux. / Drug resistant HSV isolates are responsible form substantial morbidity among immunocompromised subjects. The genetic basis for resistance to nucleoside analogs such as acyclovir (ACV) have been mapped to point mutations in the viral thymidine kinase (TK) gene while mutations within the viral DNA pol gene, the main target for all anti-herpetic drug actually available, could lead to a multidrug resistance phenotype. However, the distinction between viral mutations (TK and DNA pol) involved in antiviral resistance or part of viral polymorphism can be difficult to evaluate with current methodologies. OBJECTIVE: The aim of this research project is thus to evaluate the role of particular mutations within the HSV TK and DNA pol gene with regard to drug-resistance patterns and viral fitness, by designing new gene expression systems. METHODS: The protozoan parasite Leishmania stably transfected with a TK expression vector (pSP72αNEOα) was used as an heterologous system to evaluate the role of several different point mutations within the coding region of the TK gene in conferring resistance to nucleoside analogs. Susceptibility of TK-expressing parasites to nucleoside analogs can thus be tested very easily by a simple measurement of the optic density of cultures grown in the presence or in the absence of the drug. Finally, a set of overlapping viral cosmids and plasmids for the rapid generation of recombinant HSV-1 DNA pol mutants have been developed. RESULTS: Expression of the TK gene from ACV-susceptible clinical isolates resulted in Leishmania susceptibility to the antiviral, whereas expression of a TK gene with frameshift mutations or nucleotide substitutions from ACV-resistant isolates gave rise to parasites with high levels of antiviral resistance. Twenty HSV-1 recombinants with single or dual mutations within the DNA pol gene were successfully generated with the cosmid/plasmid based approach. Mutations within the central part of the enzyme’s catalytic domain (regions II and VI) were associated with resistance to ACV, FOS, and ADV, whereas mutations inserted within extremities (δ-region C, I, V, and VII) were mostly related to the replicative activity of the enzyme. CONCLUSION: Such new strategies provide an easy, reliable, and sensitive means of evaluating the functional role of viral mutations which should translate in improved management of drug-resistant HSV infections.