Les cellules NK, membres de l’immunité innée, sont impliquées dans le contrôle des infections virales et notamment l’infection à cytomégalovirus (CMV). Généralement bien tolérée chez l’individu immunocompétent, l’infection à CMV demeure associée à une forte morbidité chez les individus dont le système immunitaire est compromis (patients transplantés, coinfectés par le VIH) ou immature (fœtus et nouveaux nés). Lors de l’infection par le CMV, une relation étroite s’établit entre le système immunitaire et le virus. Celle-ci génère en effet une forte mobilisation, associée à un profond remodelage, de différents compartiments immuns. Au cours de ce travail de thèse, nous nous sommes intéressées à l’équilibre qui s’instaure entre le virus et le système immunitaire. Dans une première approche menée in vitro, nous avons exploré le rôle de différentes sous-populations NK dont les cellules NK NKG2C+, caractéristiques de l’infection à CMV, en réponse à des cellules endothéliales, isolées à partir de donneurs de rein, infectées par le CMV. Ensuite, une cohorte rare d’adultes immunocompétents souffrant d’une primo-infection symptomatique à CMV nous a permis d’étudier la course naturelle de l’infection à CMV. Cette approche ex vivo a constitué d’une part en l’analyse du polymorphisme de la réponse de l’hôte au virus, par l’étude phénotypique et transcriptomique non seulement de la réponse NK mais aussi d’autres effecteurs lymphocytaires. D’autre part, nous avons exploré l’impact du polymorphisme génétique viral, par le séquençage par NGS d’isolats cliniques du CMV, sur le pouvoir pathogène du virus. L’ensemble de ces travaux devrait contribuer à la meilleure compréhension du rôle des cellules NK dans le contrôle de l’infection à CMV. / NK cells are innate lymphocyte effectors involved in the control of viral infections and particularly cytomegalovirus (CMV) infection. Usually well tolerated in immunocompetent individuals, CMV infection remains life life-threatening in immunosuppressed patients, as transplant recipients or HIV-infected patients, or for fetuses in case of congenital infection. Upon primary infection, CMV establishes a close relationship with the immune system. CMV infection is known to drive an important immune response and to deeply imprint several immune compartments. In this present work, we focused on the host-virus balance that takes place upon infection. Through a first in vitro approach, we investigated the role of different NK cell subpopulations, including NKG2C+ NK cells which represent one of the hallmarks of CMV infection, in response to CMVinfected endothelial cells isolated from kidney donors. Then, an ex vivo approach was conducted in a cohort of immunocompetent adults diagnosed with symptomatic primary CMV infection. On one hand, our aim was to explore the host immune response polymorphism, through phenotypic and transcriptomic analyses of lymphocyte responses. On the other hand, we investigated the viral genome polymorphism, through NGS sequencing of clinical CMV isolates, which could modulate the viral pathogenicity. Taken together, these findings should contribute to the better understanding of the role of NK cells during the course of CMV infection.

L'objectif de ce projet a été la production des anticorps monoclonaux dirigés contre le cytomegalovirus (CMV) pour fin d'utilisation potentielle en diagnostic et/ou l'utilisation comme outil pour etudier les aspects fondamentaux du CMV. Des anticorps monoclonaux ont été obtenus par fusion de lymphocytes de souris (immunisées par quatre injections intrapéritonéales de 500 mg à intervale de deux semaines) et des cellules de mylome de souris (NSO) maintenues en culture exponentielle. Le dépistage des clones sécréteurs a été effectué par ELISA et immunofluorescence (IF). Les hybridomes intéressants ont été clonés par dilution limite puis congelés dans l'azote liquide et injectés par voie intrapéritonéale chez des souris (BALB/c), traitées avec une injection intrapéritonéale de 0.7 ml de pristane (2,4,10,14-Tetramethylpentadecane) dix jours auparavant, pour la production de liquide ascitique. Parmi les clones sélectionnés, un seul s'est révélé d'un grand intérêt. Le clone CLB-1 s'est révélé d'une grande reactivité et d'une grande spécificité contre le CMV. Le liquide ascitique produit par les cellules monoclonales CLB-1 a été testé et les aspects suivants des réactions entre le CLB-1 et le CMV ont été vérifiés: (a) Reactivité et spécificité de l'anticorps contre le CMV. Pour étudier ce phénomène, l'anticorps monoclonal (CLB-1) a été testé par IF (en dilution de 1:100) contre des cellules fibroblastiques infectées par le CMV (AD169) ou par l'Herpès simplex type-1 ou type-2. Les résultats ont montré une réaction positive avec les cellules infectées par le CMV (AD169) et négative avec les cellules non-infectées ou infectées par l'Herpès sipmlex type-1 ou type-2. (b) La capacité de cet anticorps (CLB-1) pour la detection des isolées cliniques de CMV a été vérifié. L'anticorps monoclonal a détecté toutes les isolées cliniques trouvés positives au CMV. (c) Pour étudier la cinétique de la synthèse de la protéine contre lequel l'anticorps monoclonal est dirigé, le CLB-1 a été testé en IF avec des cellules fibroblastiques infectées avec le CMV à des temps différents après l'infection. Les résultats ont montré une réaction positive entre 72 et 96 heures après 11 infection prouvant ainsi que la protéine contre laquelle CLB-1 est dirigé est une protéine tardive. (d) La capacité neutralisante de 11 anticorps a été vérifiée et il a été prouvé que ce derniér neutralise le virus à une dilution de 1:100 comparativement au sérum humain ayant une capacité neutralisante à une dilution de 1:5. (e) Finalement le test d'immunodiffusion double sur gel d1 agarose a montré que 1'anticorps monoclonal CLB-1 est de type IgGl. Plusieurs essais ont été effectués afin de déterminer le poids moléculaire de la (les) protéine(s) contre laquelle 11 anticorps CLB-1 est dirigé. Par immunoblotting, il nous a été impossible d1 identifier cette (ces) protéine (s). La raison probable est la destruction ou la modification de 11 épitope dans le processus de préparation de 11 antigene. Il a été mentionné que la majorité des anticorps monoclonaux ne précipitent pas les antigene contre lesquels ils sont dirigés (Carter and Ter Meulen, In advances in virus research. 1984, 29: 95-130). En conclusion nous avons produit un anticorps monoclonal contre le CMV, cet anticorps peut nous aider pour les diagnostic et probablement pour le traitement de 1'infection virale de CMV. / Fusions of spleen cells obtained from mice immunized with human cytomegalovirus (CMV) and a mouse myeloma cell line were performed. One monoclonal antibody, CLB-1 was obtained from the four fusions performed. The following aspects of the reaction of the monocolona1 antibody CLB-1, with CMV were investigated: (a) The reactivity and specificity of CLB-1 with CMV; (b) the ability of the CLB-1 monoclonal antibody to detect clinical isolates of CMV; (c ) the kinetics of synthesis of the protein against which the CLB-1 monoclonal antibody reacts ; (d) the ability of the CLB-1 to neutralize CMV; and (e) some characteristics of this monoclonal antibody. The data obtained showed that the CLB-1 monoclonal antibody detected cells infected with CMV A D16 9 , the strain which was used as the immunizing antigen. The CLB-1 antibody showed a high degree cf specificity for the CMV as it did not react with the herpes simplex type-1, herpes simplex type-2 infected cells nor with uninfected human fibroblasts. From the kinetic experiments, the data obtained showed that this monoclonal antibody was directed against a late protein(s) that appeared between 72h and 96h post-infection. The CLB-1 antibody neutralized the virus completely at a dilution of 1:100 of an acitis fluid preparation. Using the double immunodiffusion method, the CLB-1 antibody was found to belong to the IgGl sub-class of immunoglobulins / Montréal Trigonix inc. 2018

Certaines mutations de rôle inconnu dans le gène UL97 du cytomégalovirus humain ont été retrouvées dans une étude clinique comparant l'efficacité du ganciclovir et du valganciclovir oral administrés chez des patients transplantés d'organe solide. Sans isolât clinique, il est difficile de distinguer les mutations associées à la résistance, les mutations associées au polymorphisme viral et les mutations compensatrices. L'objectif de ce projet de maîtrise consiste à caractériser les mutations détectées dans le gène UL97 à l'aide de la technologie des chromosomes bactériens artificiels. Pour évaluer le rôle de ces mutations, une méthode a été développée pour générer des virus recombinants mutants. Des cellules humaines permissives ont été transfectées avec l'ADN de virus recombinants mutants clones dans un chromosome bactérien artificiel. La sensibilité au ganciclovir des virus reconstitués a ensuite été évaluée. Les mutations de rôle inconnu retrouvées dans l'étude clinique semblent associées au polymorphisme viral.

Le cytomégalovirus humain (CMV) est un virus de la famille des Herpesviridae qui infecte la majorité de la population mondiale dès les premiers mois de la vie. Chez les patients immunocompétents, les infections sont généralement asymptomatiques car bien contrôlées par le système immunitaire de l’hôte. En revanche, chez les patients immunosupprimés, tel que les patients sidéens avec de faibles niveaux de cellules T CD4+ ou les patients transplantés, les infections à CMV sont associées à des taux élevés de morbidité et de mortalité. Quelques agents antiviraux (ganciclovir (GCV), foscarnet (FOS) et cidofovir (CDV)) sont approuvés pour la prévention et le traitement des maladies à CMV. Ils ciblent tous l’ADN polymérase virale pUL54. Une autre enzyme clé est la phosphotransférase pUL97 qui est impliquée dans l’activation (phosphorylation) du GCV. Deux inconvénients majeurs sont associés à ces antiviraux. D’une part, le virus peut développer une résistance suite à l’apparition de mutations dans les gènes codant pour les deux protéines impliquées dans leur mécanisme d’action, soit UL54 et UL97. La méthode la plus répandue pour détecter si un virus est résistant aux antiviraux consiste à amplifier et à séquencer ces deux gènes pour détecter des mutations impliquées dans la résistance. Cependant, cette méthode nécessite de connaitre au préalable le rôle des mutations dans la résistance. Mes travaux de doctorat avaient donc comme premier objectif de développer un système pour générer des virus recombinants avec gène rapporteur permettant d’introduire une ou plusieurs mutations dans le génome du CMV. Notre deuxième objectif était de caractériser le rôle de 5 mutations retrouvées au sein d’un spécimen clinique, dont 2 inconnues, dans la résistance aux antiviraux. A l’aide de ce système, nous avons également étudié l’impact de la combinaison de plusieurs mutations sur la résistance aux antiviraux et les capacités réplicatives virales. Nous avons démontré que la combinaison de mutations dans les gènes UL97 et UL54 augmentait la résistance au GCV de manière additive et que l’association de deux mutations dans UL54 engendrait une résistance au GCV supérieure à l’additivité des niveaux de résistance de chaque mutation seule. D’autre part, une toxicité importante est associée aux molécules antivirales actuelles. Afin d’améliorer leur efficacité et diminuer leur toxicité, nous avons étudié l’impact que pouvait avoir la combinaison d’artésunate (ART), un composé antiparasitaire ayant démontré une activité anti-CMV, sur l’efficacité antivirale in vitro de plusieurs antiviraux. Nous avons rapporté que l’ART avait un effet synergique avec le GCV, le CDV et le maribavir, un antiviral en phase de développement clinique ciblant la phosphotransférase pUL97. L’ART a également montré un synergisme modéré avec le FOS et le letermovir, un autre antiviral en phase de développement clinique ciblant la terminase virale. En conclusion, nos travaux ont permis de mieux caractériser les mécanismes de résistance du CMV et d’envisager une nouvelle stratégie pour améliorer les traitements antiviraux actuels.

Le cytomégalovirus humain (CMV) est un Herpèsvirus causant une infection latente chez 60% à 70% des nords-américains. Sa primo-infection chez les nouveaux-nés et sa réactivation chez les individus immunodéprimés sont associées à de nombreux cas de morbidité et de mortalité. Le traitement des infections au CMV est compliqué par l'absence de vaccin et le nombre restreint de drogues homologuées. Ces dernières sont malheureusement issues de vieilles générations de composés, et sont associées à une activité modérée, à une importante toxicité, et à l'apparition fréquente de résistance au traitement. Ces composés ciblent tous l'ADN polymérase virale, et inhibent ainsi la réplication du virus. Cependant, comparativement aux autres polymérases virales, cette enzyme est bien peu caractérisée, ce qui limite le développement de composés thérapeutiques de seconde génération plus efficaces, moins toxiques et moins sujets à l'apparition de résistance virale. Ayant entendu ce signal d'alarme, nous avons entrepris de caractériser la principale cible thérapeutique du cytomégalovirus humain, son ADN polymérase. Le gène UL54 du CMV code une protéine de 1242 acides aminés et qui est connue pour être la sous-unité catalytique de l'ADN polymérase virale. Malheureusement, sa grande taille a longtemps limité son expression et sa caractérisation. En nous concentrant sur les régions importantes pour son activité, nous avons généré une protéine un peu plus courte, mais toujours catalytiquement active. Nous avons ainsi pu exprimer, pour la première fois, une grande quantité de protéines UL54, ce qui nous a permis de caractériser en détails sa liaison avec ses deux substrats principaux, soit l'ADN et les dNTP. L'emploi de la spectroscopie à fluorescence nous a permis de suivre la liaison de UL54 à ses substrats, en quantifiant l'impact de la liaison de ces derniers sur la fluorescence intrinsèque du tryptophane de UL54. Nous avons ainsi pu établir que les constantes de dissociation de UL54 pour l'ADN et pour les dNTP étaient respectivement de 48[micro]M et de 15[micro]M. Notre étude révèle qu'un substrat d'ADN aussi petit que 6nt peut lier la protéine. Nous avons aussi démontré que UL54 lie aussi bien l'ADNsb que l'ADNdb, et que cette liaison semble séquence indépendante. De plus, la protéine est incapable de discriminer entre un substrat d'ADN et un d'ARN. Le profil thermodynamique de la liaison à l'ADN et aux dNTP a été établi et révèle deux modes de liaison distincts. La liaison de l'ADN est propulsée par l'enthalpie et est fort probablement associée à la relâche de molécules d'eau au solvant. Les interactions hydrophobes et d'empilement représentent les forces majeures stabilisant la liaison, alors que les interactions électrostatiques sont presque négligeables. À l'inverse, la liaison de UL54 au dNTP est propulsée par l'enthalpie, et la stabilisation de la liaison est associée davantage aux interactions électrostatiques, à des ponts hydrogènes et aux forces de van der Waal's. Des essais de dichroïsme circulaire, une seconde technique optique qui peut générer une représentation des structures secondaires et tertiaires d'une protéine, indique que, suite à la liaison de l'ADN, la protéine UL54 opère un changement de conformation, et qu'elle en subit un second suite à la liaison d'un dNTP, ce qui est cohérent avec les changements de conformation observés chez d'autres polymérases mieux caractérisées. Quelques expériences complémentaires sont aussi présentées. Enfin, comme les résistances aux traitements sont un enjeu majeur, et qu'elles sont créées par des erreurs de UL54, l'élaboration d'une démarche expérimentale visant à établir la fidélité de cette protéine est décrite en détail. Nous sommes confiants qu'une telle étude sur la caractérisation biochimique de la principale cible pharmacologique du CMV contribuera au développement rationnel de nouvelles générations de drogues anticytomégaloviriques efficaces.

Les infections par cytomégalovirus sont un problème majeur en transplantation rénale du fait de l’augmentation du risque de perte de greffon et de l’augmentation de la morbi-mortalité des patients. Toutefois la mise en place d’un traitement prophylactique par ganciclovir a significativement fait diminuer l’incidence de ces infections. Cette efficacité est toutefois limitée par une importante hématotoxicité notamment des neutropénies. La survenue de cet évènement indésirable conduit à une réduction des doses voire à un arrêt du traitement, favorisant ainsi l’émergence de résistances virales. Ces résistances sont un problème grandissant chez les personnes transplantées du fait du manque de protocole de prise en charge de celles-ci. Dans ce contexte notre objectif était de mieux comprendre la survenue et le mécanisme de cette toxicité. Dans un premier temps nous avons étudié le métabolisme intracellulaire du ganciclovir chez des patients. Nous avons remarqué qu’il y a une forte corrélation entre l’exposition à la forme active du ganciclovir et la diminution du nombre de neutrophiles au 3ème mois de traitement. Nous avons par la suite étudié l’impact de variations génétiques sur des transporteurs. Nous avons remarqué qu’un polymorphisme était fortement associé à une diminution du nombre de neutrophiles et qu’il entrainait également une augmentation de la concentration intracellulaire de ganciclovir à l’aide d’un modèle in vitro. Cette thèse fournit de nouveaux outils d’exploration du métabolisme et de l’accumulation intracellulaire du ganciclovir qui pourraient être utiles pour la prévention de la survenue de neutropénies sous ganciclovir. / Cytomegalovirus infection is a major issue in transplant patients as it affects the graft survival and contributes to patients’ morbi-mortality. The implementation of ganciclovir prophylaxis has significantly decreased its incidence, however GCV frequently induces neutropenia. This adverse effect leads to a decrease in the ganciclovir dose or to a discontinuation of the therapy, thereby favoring viral resistance. Resistance to ganciclovir is a growing problem in solid organ transplantion because of the lack of proper data to support treatment decisions when it is encountered. In this context we aim at better understanding the factors involved in this toxicity. First we explored the intracellular metabolism of ganciclovir in patients’ white blood cells. We found that the active form of ganciclovir is associated with neutrophil toxicity at month 3 of treatment. Then we explored the effect of targeted polymorphisms among transporter genes in two cohorts of renal transplant patients. We found that a single nucleotide polymorphism is strongly associated with a decrease in the neutrophil count and in ganciclovir intracellular accumulation. This thesis provides relevant tools for a deeper exploration of ganciclovir intracellular metabolism and accumulation which might be useful for the prevention of ganciclovir induced neutropenia.

Le cytomegalovirus humain (HCMV) est associé à des taux importants de morbidité et de mortalité chez les patients immunosupprimés, particulièrement chez les patients transplantés d'organe solide ou de moelle osseuse de même que chez les patients sidéens avec de faibles niveaux de cellules T CD4+. Seulement trois antiviraux (le ganciclovir, le cidofovir et le foscarnet) et un pro-médicament (le valganciclovir) sont approuvés pour la prévention et le traitement des maladies à HCMV. L'usage répandu de ces agents antiviraux suscite de l'inquiétude quant à l'émergence de souches HCMV résistantes chez les patients immunosupprimés. La résistance au ganciclovir est généralement associée à des changements dans la protéine kinase virale pUL97 et, occasionnellement, dans l'ADN polymerase du HCMV. La résistance au cidofovir et au foscarnet est uniquement associée à des changements dans l'ADN polymerase du HCMV. Les principaux objectifs de mes recherches doctorales étaient (i) de caractériser les mécanismes moléculaires et biochimiques de la résistance du HCMV aux agents antiviraux actuels et (ii) d'évaluer de nouveaux agents anti-herpétiques identifiés par notre équipe de recherche. Dans un premier temps, nous avons développé une méthode permettant de générer des HCMV recombinants possédant des mutations de rôle inconnu dans le gène UL97, qui code pour une protéine kinase responsable de l'activation du ganciclovir. À l'aide de cette méthode, nous avons caractérisé la résistance du HCMV au ganciclovir dans des populations de patients adultes et pédiatriques transplantés d'organe solide. De plus, la méthode utilisée pour générer des virus recombinants nous a également permis de caractériser le phénotype de résistance discordant de deux mutations au sein du même codon du gène UL97 retrouvées dans deux échantillons cliniques. Dans un deuxième temps, nous avons caractérisé l'impact de deux mutations retrouvées au sein du gène UL54, qui code pour l'ADN polymerase du HCMV, provenant d'un isolât clinique résistant au ganciclovir et au foscarnet. Dans un troisième temps, nous avons étudié de nouveaux agents anti-herpétiques sélectionnés à l'aide d'un modèle tridimensionnel de l'ADN polymerase du HCMV et de la structure de l'ADN polymerase cristallisée du virus herpès simplex de type 1. Les modèles expérimentaux développés pendant mes recherches doctorales ont permis d'approfondir nos connaissances sur les mécanismes de résistance du HCMV aux agents antiviraux et sur le développement de nouveaux agents anti-herpétiques.

La structure des ADN polymérases (pol) du cytomégalovirus humain (CMV) et du virus herpès simplex 1 (VHS-1), appartenant tous deux à la famille des Herpesviridae, est associée à la forme d'une main droite comportant entre autres les domaines de la paume, du pouce et des doigts. L'ADN pol adopte différentes conformations (ouverte et fermée) impliquant un mouvement du domaine des doigts dans le but de faciliter l'interaction entre le nucléotide et l'ADN en cours d'élongation. Il a été montré que l'antiviral foscarnet (FOS) qui cible l'ADN pol du CMV et du VHS-1 se lierait à l'enzyme quand elle est dans sa conformation fermée et que des mutations dans le domaine des doigts conférant la résistance à cet antiviral favoriseraient une conformation plus ouverte de l'enzyme pour laquelle le FOS a une affinité plus faible. Nous avons voulu analyser si cette hypothèse s'appliquait également à des mutations qui sont localisées dans des régions du domaine NH₂-terminal et de la paume qui interagissent avec le domaine des doigts lors des changements de conformation de l'enzyme au cours de la réaction de polymérisation. Notre hypothèse est que des mutations localisées dans l'hélice K (domaine NH₂-terminal) et la région II (domaine de la paume) qui participent aux changements de conformation de l'enzyme pourraient favoriser une conformation plus ouverte des ADN pol virales, et par conséquent, réduire la sensibilité des virus au FOS. Nous avons donc sélectionné des substitutions théoriques en utilisant une stratégie basée sur l'alignement des séquences en acides aminés des ADN pol du CMV et du VHS-1 (sensibles au FOS) avec celles des bactériophages RB69 et T4 (résistantes au FOS). Nous avons tenté de générer les virus recombinants CMV et VHS-1 possédant les différentes substitutions théoriques sélectionnées. Cependant, l'introduction de certaines substitutions [Q578P, R581T, L587F (hélice K), P712Y, F718L (région II) pour le CMV et Q617P, R620T, L626F (hélice K), F718L (région II) pour le VHS-1] étaient délétères pour les ADN pol, ce qui empêchait les virus recombinants de se répliquer en culture cellulaire. Parmi les substitutions sélectionnées dans l'hélice K, la substitution I619K confère une résistance du VHS-1 au FOS. Au sein de l'hélice K, nous avons également caractérisé la substitution théorique Q579I qui conférait une hypersensibilité du CMV au FOS. Nous avons caractérisé cette substitution en la comparant à la mutation K805Q localisée dans l'hélice P (domaine des doigts) déjà connue pour induire une hypersensibilité du CMV au FOS. Dans la région II, les substitutions V715S et A719T confèrent une résistance des deux virus au FOS. La substitution Q697P du CMV confère une résistance du CMV au FOS mais pas pour le VHS-1. Les profils de sensibilité des virus recombinants au FOS ont également été confirmés par des tests enzymatiques dans lesquels nous avons déterminé l'inhibition de l'activité des ADN pol recombinantes mutées par cet antiviral. Nous avons également constaté une diminution des capacités réplicatives des CMV et VHS-1 recombinants possédant ces substitutions par rapport à celle des virus sauvages correspondants. Des analyses tri-dimensionnelles ont été réalisées et ont suggéré que les substitutions conférant une résistance au FOS seraient associées à une déstabilisation de la conformation fermée des ADN pol et favoriseraient une conformation plus ouverte pour laquelle l'antiviral a une plus faible affinité. D'autre part, les modélisations tri-dimensionnelles des protéines possédant les substitutions conférant une hypersensibilité au FOS ont montré que les ADN pol favorisaient une conformation plus fermée pour laquelle le FOS a une plus grande affinité. La caractérisation de la substitution théorique V715S du CMV et du VHS-1 (FOSᴿ/GCVᴿ et FOSᴿ/ACVᴿ, respectivement) a été comparée aux substitutions V715G du VHS-1 (FOSᴿ/ACVᴿ), V715M du CMV et du VHS-1 (FOSᴿ/GCV[exposant S] et FOS[exposant S]/ACVᴿ, respectivement), déjà décrites dans la littérature. Brièvement, nous avons montré que l'introduction de ces différentes substitutions induisaient des changements au niveau de l'environnement hydrophobe de la valine à la position 715 influençant ainsi les phénotypes de sensibilité aux antiviraux observés. L'ensemble de ces résultats nous ont permis d'appuyer notre hypothèse selon laquelle les mutations localisées dans l'hélice K et la région II peuvent influencer la sensibilité des virus au FOS en modifiant la structure de la protéine et en interférant avec les changements de conformation de l'enzyme. / The structure of the human cytomegalovirus (HCMV) and herpes simplex virus 1 (HSV-1) DNA polymerase (pol), belonging to the Herpesviridae family, is associated to a right hand with palm, thumb and fingers domains. The viral DNA pol adopts different conformations (open and closed) that implies a move of the fingers domain to facilitate the interaction between the nucleotide and the elongating DNA. It has been shown that the antiviral foscarnet (FOS) which targets the HCMV and HSV-1 DNA pol binds to the enzyme in its closed conformation and mutations confering resistance to this antiviral and localised in the fingers domain would favor a more open conformation of the enzyme for which FOS has a lower affinity. The aim of this thesis was to analyse whether this hypothesis could be extended to mutations localised in the NH₂-terminal and the palm domains which interact with the fingers domain during the conformational changes of the enzyme during the polymerization process. Our hypothesis is that mutations localized in the helix K (NH₂-terminal domain) and region II (palm domain) that participate in the conformational changes of the enzyme could favor a more open conformation of the viral DNA pol, and thus, decrease the susceptibility of viruses to FOS. We selected theoretical substitutions using a strategy based on amino acid sequences alignement of the DNA pol of HCMV and HSV-1 (susceptible to FOS) with those of RB69 and T4 bacteriophages (naturally resistants to this antiviral). We tried to generate recombinant HCMV and HSV-1 containing the different theoretical substitutions that we selected. However, the introduction of some theoretical substitutions [Q578P, R581T, L587F (helix K), P712Y, F718L (region II) for HCMV and Q617P, R620T, L626F (helix K), F718L (region II) for HSV-1] was so detrimental for the DNA pol that recombinant viruses were not able to grow in cell culture. Among the substitutions selected in the helix K, the substitution I619K confers resistance of HSV-1 to FOS. In the helix K, we also characterized the theoretical Q579I substitution that confers hypersusceptibility of HCMV to FOS. We compared this substitution with the K805Q substitution located in the helix P (fingers domain), already known to induce hypersusceptibility of HCMV to FOS. In region II, substitutions V715S and A719T confer resistance of both viruses to FOS whereas the Q697P substitution was associated with resistance of HCMV to FOS but not for HSV-1. The susceptibility profiles of recombinant viruses to FOS were confirmed by enzymatic assays that allowed us to determine the inhibition of the recombinant mutated DNA pol activity by this antiviral compound. We observed a decrease of the replicative capacities of recombinant HCMV and HSV-1 harboring these mutations compared to their wild-type counterparts. Tri-dimensional modeling was also performed to better understand the impact of these substitutions on the DNA pol of HCMV and HSV-1. On the one hand, substitutions confering resistance to FOS were associated to a destabilization of the closed conformation of the DNA pol and would favor a more open conformation for which the antiviral has a lower affinity. On the other hand, substitutions associated to a hypersusceptibility profile would favor a more closed conformation of the DNA pol for which FOS has a higher affinity. The characterization of the theoretical substitution V715S of HCMV and HSV-1 (FOSᴿ/GCVᴿ and FOSᴿ/ACVᴿ, respectively) was compared to the substitutions V715G of HSV-1 (FOSᴿ/ACVᴿ), V715M of HCMV and HSV-1 (FOSᴿ/GCV[superscript S] and FOS[superscript S]/ACVᴿ, respectively), already described in the literature and that were, thus, associated with different antiviral susceptibility phenotypes compared to those of V715S. Briefly, we showed that the introduction of these different substitutions could induce varying changes of the hydrophobic environment of the valine at position 715 influencing the antiviral susceptibility profile. Altogether, these results support our hypothesis that substitutions in helix K and region II could influence the susceptibility of HCMV and HSV-1 to FOS by modifiying the protein structure and impacting the correct conformational changes of the enzyme.

Les nouveau-nés et les jeunes enfants ont une susceptibilité plus élevée aux infections par rapport aux enfants plus âgés et aux adultes. Cette caractéristique est en partie attribuée à l’immaturité de leur système immunitaire qui est associée à une capacité limitée à développer des réponses immunitaires à médiation cellulaire. L’infection par le cytomégalovirus (HCMV) est la cause la plus fréquente d’infection congénitale chez l’Homme et une cause majeure de surdité et de retard mental. En Belgique, le dépistage anténatal de l’infection primaire par le HCMV chez les femmes enceintes offre l’opportunité d’étudier les réponses immunitaires du foetus à ce virus et de les comparer à celles de leur maman.<p>Les lymphocytes T CD4+ Th1 et les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques jouent un rôle crucial dans le contrôle des pathogènes intracellulaires dont le HCMV fait partie. La littérature montre une capacité limitée des enfants congénitalement infectés par le HCMV à développer des réponses T CD4+ spécifiques du HCMV. En contraste, des réponses de lymphocytes T CD8+ spécifiques du HCMV ont été rapportées chez des enfants infectés in utero, mais ces réponses n’ont pas été comparées en détails à celles de l’adulte. De plus, notre connaissance des réponses T spécifiques du HCMV durant l’infection primaire par ce virus est limitée. Des études antérieures ont rapporté un défaut de prolifération et de production d’IL-2 des lymphocytes T spécifiques du HCMV chez des adultes avec durant la phase primaire de l’infection, mais les mécanismes restent non-élucidés.<p>Nous avons caractérisé les réponses de lymphocytes T CD4+ et CD8+ spécifiques du HCMV provenant du sang de cordon de nouveau-nés congénitalement infectés par le HCMV, et nous avons comparé ces réponses à celles de leurs mamans diagnostiquées avec une infection primaire par le HCMV durant la grossesse. En plus, nous avons comparé les réponses T CD4+ et CD8+ de ces mamans à celles d’adultes infectés chroniquement par le virus. Chez les nouveau-nés, nous avons démontré que des lymphocytes T CD4+ de sang de cordon exprimant un phénotype de différentiation spécifique du HCMV (CD27-CD28-) ainsi qu’un phénotype Th1 similaire à celui des cellules maternelles étaient induits in utero lors de l’infection congénitale par le HCMV. De plus, la détection d’expansions oligoclonales suggérait fortement une expansion antigène-spécifique de ces cellules. Cependant, les T CD4+ de nouveau-nés présentaient une capacité fortement réduite à produire des cytokines anti-virales (IFN-γ, TNF-α et MIP-1β) en réponse à une stimulation ex vivo avec les antigènes du HCMV, par rapport aux cellules maternelles. Les lymphocytes T (CD27-CD28-) CD4+ de nouveau-nés produisaient également des niveaux plus bas de cytokines antivirales en réponse à des stimulations polyclonales avec l’anti-CD3 et la PMA/ionomycine, suggérant des altérations en amont et en aval de la voie de signalisation du TCR. Nos résultats suggèrent que ces altérations pourraient impliquer la diminution de l’expression de molécules impliquées dans cette voie de signalisation. De la même manière, nous<p>avons montré que chez le nouveau-né, la fonction des T CD8+ spécifiques du HCMV était altérée par rapport à celle de l’adulte. Nous avons observé des proportions similaires de T CD8+ (CD27-CD28-) chez les nouveau-nés et les adultes. De plus, l’analyse du répertoire du TCR Vβ de ces cellules par séquençage haut-débit a révélé une capacité similaire à générer un répertoire T diversifié dans les deux groupes. Comme rapporté précédemment, nous avons détecté des fréquences similaires de lymphocytes T CD8+ spécifiques pour l’antigène immunodominant pp65. Cependant, lorsque les stimulations ont été étendues à d’autres antigènes du HCMV, nous avons observé que le répertoire antigénique reconnu par ces cellules était significativement réduit chez les nouveau-nés, en association avec une diminution de la polyfonctionalité et de la production de cytokines par cellule.<p>Nous avons également montré que, dans une moindre mesure, la fonction des lymphocytes T spécifiques du HCMV était diminuée durant l’infection primaire chez l’adulte. Comme reporté précédemment, les T CD4+ spécifiques du HCMV proliféraient moins et produisaient moins d’IL-2 par rapport à des individus dans la phase chronique de l’infection. Ce défaut de production d’IL-2 affectait à la fois les populations de cellules CD28+ et CD28-, montrant que l’accumulation de lymphocytes T CD4+ ayant perdu l’expression de la molécule CD28 (un signal de co-stimulation important pour la production d’IL-2) est seulement un des facteurs contribuant à la diminution de la production d’IL-2 par les cellules spécifiques du HCMV. En accord avec cette observation, nous avons montré une diminution de la production par cellule d’IFN-γ et de TNF-α touchant également à la fois les populations de T CD4+ CD28+ et CD28- durant la phase primaire de l’infection, un défaut associé avec une avidité fonctionnelle diminuée de ces cellules. De la même manière, la polyfonctionalité et la production de cytokines par cellule des lymphocytes T CD8+ spécifiques du HCMV étaient également diminuées chez les adultes durant la phase d’infection primaire.<p>En résumé, nos résultats montrent que la fonction des lymphocytes T spécifiques du HCMV de nouveau-nés et d’adultes est altérée durant l’infection primaire par rapport à des individus infectés chroniquement par le virus. Nous montrons que cette régulation fonctionnelle ressemble à l’exhaustion fonctionnelle des lymphocytes T observée durant les infections virales chroniques associées à des charges virales élevées. L’infection primaire par le HCMV est caractérisée par une réplication virale intense qui dure pendant plusieurs mois suivant l’infection. Nous émettons l’hypothèse que les hauts taux de réplication virale observés durant l’infection congénitale et chez l’adulte durant l’infection primaire par le HCMV pourraient interférer avec certaines fonctions des lymphocytes T./Neonates and young infants have a higher susceptibility to infections compared to older infants or adults. This feature is in part attributed to the immaturity of their immune system associated with a limited capacity to mount cellular-mediated immune responses. Congenital human cytomegalovirus (HCMV) infection is the most common cause of congenital infection worldwide and a major cause of hearing loss and mental retardation. In Belgium, antenatal screening of pregnant women for primary HCMV infection offers an opportunity to study neonatal immune responses to the virus and to compare them to those of their mother.<p>T lymphocytes are major players of the immune system. In particular, Th1 CD4+ T cells and CD8+ cytotoxic T cells play a crucial role in the control of intracellular pathogens, including HCMV infection. Previous literature has reported a limited capacity of infants born with congenital HCMV infection to mount HCMV-specific CD4+ T cell responses. In contrast, fetal antigen-specific CD8+ T cell responses have been reported following in utero HCMV infection, but these responses have not been compared in detail to those of adults with primary infection. In addition, our knowledge regarding adult HCMV-specific T cell responses during primary HCMV infection is limited. Previous studies have reported defective T cell proliferation and IL-2 production in adults with primary HCMV infection, showing that some of the T cell functions are altered during primary infection.<p>In this study, we have characterized neonatal HCMV-specific CD4+ and CD8+ T cell responses from the cord blood of newborns with congenital HCMV infection, and we have compared these responses to that of their mothers diagnosed with primary HCMV infection during pregnancy. Also, we compared CD4+ and CD8+ T cell responses of adults with primary HCMV infection to that of adults with chronic infection.<p>In newborns, it was not known if the defective CD4+ T cell responses could be attributed to the absence of HCMV-specific cells or to the induction of dysfunctional cells. We demonstrate that neonatal CD4+ T cells with a differentiation phenotype typical of HCMV infection (CD27-CD28-) and expressing a Th1 phenotype similar to that of maternal cells can differentiate in utero following HCMV infection. In addition, the detection of oligoclonal expansions by spectratyping and flow cytometry analyses strongly suggests antigen-specific responses. However, neonatal CD4+ T cells were markedly less able to produce antiviral cytokines (IFN-γ, TNF-α and MIP-1β) following ex vivo stimulation with HCMV antigens, compared to maternal cells. Also, neonatal CD27-CD28- CD4+ T cells produce lower levels of antiviral cytokines in response to polyclonal stimulations with anti-CD3 and PMA/ionomycin, suggesting alterations up-stream and down-stream of the TCR signaling pathway. Our results suggest that these alterations could involve the down-regulation of the expression of molecules that are part of the TCR signaling pathway. Similarly, we show that the function of<p>neonatal HCMV-specific CD8+ T cells is impaired compared to adults. Similar proportions of (CD27-CD28-) CD8+ T cells, typical of HCMV infection, were detected in newborns and adults. Analysis of the TCR Vβ repertoire of neonatal and maternal (CD27-CD28-) CD8+ T cells by high-throughput sequencing revealed a similar capacity to generate a diverse clonal repertoire. As previously reported, we detected similar frequencies of HCMV-specific CD8+ T cells specific for the immunodominant viral antigen pp65. However, when extending ex vivo stimulations to other HCMV antigens, we observed that the antigenic repertoire recognized by these cells was significantly reduced in newborns. In addition, neonatal CD8+ T cells had a reduced polyfunctionality and per cell cytokine production.<p>To a lower extent, the function of adult HCMV-specific T cells was also impaired during primary infection. As previously reported, maternal HCMV-specific CD4+ T cells were markedly less able to produce IL-2 and to proliferate compared to individuals in the chronic stage of the disease. Both CD28+ and CD28- T cell subsets produced decreased levels of IL-2. This observation shows that the accumulation of HCMV-specific CD4+ T cells having lost the expression of the CD28 molecule (an important co-stimulatory signal for IL-2 production) during primary infection is only one of the factors contributing to the decreased IL-2 production. Accordingly, both CD28+ and CD28- CD4+ T cell subsets had a decreased per cell production of IFN-γ and TNF-α during primary HCMV infection. This defect was associated with a lower functional avidity of these cells. Similarly, the polyfunctionality and per cell cytokine production of adult HCMV-specific CD8+ T cells was also impaired compared to adults with chronic infection.<p>Altogether, our results show that adult and neonatal HCMV-specific T cell responses are impaired during primary infection, compared to individuals with chronic infection. We show that this functional regulation resembles that of functional T cell exhaustion observed during chronic viral infections that are associated with high levels of viral replication. Primary HCMV infection is characterized by an intense viral replication lasting for several months post-infection. We hypothesize that the high levels of viral replication observed during congenital and adult primary HCMV infection could interfere with some of the T cell functions. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’infection congénitale à cytomégalovirus (CMV) représente l’infection congénitale la plus fréquente et est la cause principale de retard mental acquis et de déficience auditive neurosensorielle d’origine infectieuse chez le nouveau-né. Le risque de transmission au fœtus en cas de primo-infection maternelle est de 30 à 40%, et d’environ 1.4% chez les femmes séropositives pour le CMV avant la grossesse. L’analyse de la littérature montre que de nombreuses questions subsistent dans le domaine du CMV congénital. Le screening sérologique des femmes enceintes n’est pas systématique, entre autres à cause des difficultés fréquentes d’interprétation sérologique et des possibilités limitées de prévention et de traitement de l’infection fœtale. L’amélioration du diagnostic sérologique de l’infection à CMV est donc une étape importante dans la prise en charge des femmes enceintes. Dans la première partie de notre travail, nous avons montré les bonnes performances des tests automatisés LIAISON®CMV IgG II, LIAISON®CMV IgM II and LIAISON®CMV IgG Avidity II tant en prospectif sur des échantillons de routine que sur des sérums sélectionnés avec date de primo-infection connue. Ces nouveaux tests sont donc utiles pour le diagnostic de la primo-infection à CMV et la détermination du statut immunitaire, avec l’avantage d’une automatisation complète. Cependant, dans 18% des cas, la mesure de l’avidité des IgG se situe dans une zone intermédiaire ne permettant pas de dater l’infection. Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons évalué les capacités des immunoblots Mikrogen recomLine CMV IgG and IgG Avidity à dater une infection primaire en utilisant des sérums pour lesquels la date de primo-infection à CMV est précisément connue, et montré que ces tests donnent une interprétation correcte dans 83.1%, un résultat incorrect dans 4.5% et un résultat non concluant dans 12.4% des cas. En particulier, la combinaison des tests Mikrogen montre une meilleure sensibilité à diagnostiquer une infection <14 semaines comparé au test VIDAS IgG Avidity (85.96% vs 76.92%). Sur un second panel d’échantillons avec une avidité des IgG VIDAS intermédiaire, ces nouveaux tests ont apporté une information complémentaire quant à la datation de la primo-infection dans 79% (70/89) des cas. L’impact clinique direct est prometteur :une analyse préliminaire sur 10 femmes enceintes de moins de 14 semaines d’âge gestationnel avec une sérologie difficile à interpréter, montre que ces tests ont permis d’éviter une amniocentèse chez 5 d’entre elles.Enfin, lorsqu’un diagnostic de primo-infection maternelle à CMV est posé ou suspecté chez une femme enceinte, nous manquons de marqueurs prédictifs de transmission materno-fœtale non invasifs pour la grossesse. Dans la troisième partie de notre travail, sur une cohorte de 150 femmes enceintes présentant une primo-infection, nous avons montré que la présence de CMV dans le sang et les urines maternelles est corrélée avec la transmission verticale et que la charge virale urinaire est plus élevée chez les femmes transmetteuses. Ces marqueurs virologiques peuvent être utiles dans l’évaluation du risque de transmission en cas de primo-infection maternelle mais nécessitent des études sur de plus larges cohortes afin de confirmer ces résultats et d’établir un seuil quantitatif. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished