Thèse de doctorat : Médecine. Virologie : Université de Nantes : 2004. / Bibliogr. f. 144-172.

Thèse doctorat : Médecine. Virologie : Université de Nantes : 2005. / Bibliogr. 146-173 f.

Le cytomégalovirus humain (CMV) est un Herpèsvirus causant une infection latente chez 60% à 70% des nords-américains. Sa primo-infection chez les nouveaux-nés et sa réactivation chez les individus immunodéprimés sont associées à de nombreux cas de morbidité et de mortalité. Le traitement des infections au CMV est compliqué par l'absence de vaccin et le nombre restreint de drogues homologuées. Ces dernières sont malheureusement issues de vieilles générations de composés, et sont associées à une activité modérée, à une importante toxicité, et à l'apparition fréquente de résistance au traitement. Ces composés ciblent tous l'ADN polymérase virale, et inhibent ainsi la réplication du virus. Cependant, comparativement aux autres polymérases virales, cette enzyme est bien peu caractérisée, ce qui limite le développement de composés thérapeutiques de seconde génération plus efficaces, moins toxiques et moins sujets à l'apparition de résistance virale. Ayant entendu ce signal d'alarme, nous avons entrepris de caractériser la principale cible thérapeutique du cytomégalovirus humain, son ADN polymérase. Le gène UL54 du CMV code une protéine de 1242 acides aminés et qui est connue pour être la sous-unité catalytique de l'ADN polymérase virale. Malheureusement, sa grande taille a longtemps limité son expression et sa caractérisation. En nous concentrant sur les régions importantes pour son activité, nous avons généré une protéine un peu plus courte, mais toujours catalytiquement active. Nous avons ainsi pu exprimer, pour la première fois, une grande quantité de protéines UL54, ce qui nous a permis de caractériser en détails sa liaison avec ses deux substrats principaux, soit l'ADN et les dNTP. L'emploi de la spectroscopie à fluorescence nous a permis de suivre la liaison de UL54 à ses substrats, en quantifiant l'impact de la liaison de ces derniers sur la fluorescence intrinsèque du tryptophane de UL54. Nous avons ainsi pu établir que les constantes de dissociation de UL54 pour l'ADN et pour les dNTP étaient respectivement de 48[micro]M et de 15[micro]M. Notre étude révèle qu'un substrat d'ADN aussi petit que 6nt peut lier la protéine. Nous avons aussi démontré que UL54 lie aussi bien l'ADNsb que l'ADNdb, et que cette liaison semble séquence indépendante. De plus, la protéine est incapable de discriminer entre un substrat d'ADN et un d'ARN. Le profil thermodynamique de la liaison à l'ADN et aux dNTP a été établi et révèle deux modes de liaison distincts. La liaison de l'ADN est propulsée par l'enthalpie et est fort probablement associée à la relâche de molécules d'eau au solvant. Les interactions hydrophobes et d'empilement représentent les forces majeures stabilisant la liaison, alors que les interactions électrostatiques sont presque négligeables. À l'inverse, la liaison de UL54 au dNTP est propulsée par l'enthalpie, et la stabilisation de la liaison est associée davantage aux interactions électrostatiques, à des ponts hydrogènes et aux forces de van der Waal's. Des essais de dichroïsme circulaire, une seconde technique optique qui peut générer une représentation des structures secondaires et tertiaires d'une protéine, indique que, suite à la liaison de l'ADN, la protéine UL54 opère un changement de conformation, et qu'elle en subit un second suite à la liaison d'un dNTP, ce qui est cohérent avec les changements de conformation observés chez d'autres polymérases mieux caractérisées. Quelques expériences complémentaires sont aussi présentées. Enfin, comme les résistances aux traitements sont un enjeu majeur, et qu'elles sont créées par des erreurs de UL54, l'élaboration d'une démarche expérimentale visant à établir la fidélité de cette protéine est décrite en détail. Nous sommes confiants qu'une telle étude sur la caractérisation biochimique de la principale cible pharmacologique du CMV contribuera au développement rationnel de nouvelles générations de drogues anticytomégaloviriques efficaces.

Le néocortex déclenche des activités paroxystiques suite aux lésions cérébrales traumatiques. Avec des blessures cérébrales pénétrantes, la déafférentation s'accompagne d'une longue période silencieuse du cortex atteint, et d'une augmentation des périodes d'hyperpolarisation du néocortex entourant la lésion. L'activité synchrone du réseau neuronal après une période de latence conduirait à l'épileptogenèse. Des tentatives de modifier la nature des crises ont été effectuées à l'aide de modèles animaux. L'une des plus prometteuse étant la chimiogenèse par l'injection des vecteurs viraux afin d'anéantir la réponse de certains récepteurs couplés aux protéines G aux ligands habituels, alors qu'ils réagissent aux médicaments désirés, comme N-oxyde de clozapine. Ces récepteurs appelés « DREADDs » exclusivement activés par ces médicaments ont été étudiés pour réduire le nombre et la sévérité des crises. Selon les résultats non-publiés de notre laboratoire, l'utilisation d'un DREADD excitateur près de «undercut» serait antiépileptogène. Nous pensons qu'une excitation ciblée pourrait optimiser l'effet antiépileptogène. L'excitation est directement liée aux neurones transduits. Nous postulons qu'une transduction optimale des neurones pourrait être atteinte par un dosage optimisé du virus injecté, tant au titre viral qu'au volume injecté. Pour prouver notre hypothèse nous avons utilisé trois différentes titrations de AAV2/8 et injecté différents volumes de ces titrations aux souris. Le volume de transfection corticale et le nombre des neurones transduits ont été quantifiés. Avec la titration E11gc/ml aucune transfection n'a été observée. Avec la titration E12gc/ml une corrélation quasi-linéaire a été observée entre le volume viral injecté, et le volume cortical transfecté, ainsi que le nombre de neurones transduits. Avec la titration E13gc/ml, une meilleure corrélation a été observée à la transduction neuronale qu'à la transfection corticale, par rapport au volume viral injecté. En conclusion, la titration E12gc/ml paraît être un meilleur choix pour nos futures études, la fiabilité de la titration E13gc/ml n'ayant pas été démontrée. / The neocortex is the origin of paroxysmal activities that occur after traumatic brain injuries. In penetrating brain injuries, deafferentation causes long silent periods in affected cortex and increased hyperpolarization period in neocortical tissue around the injury. The synchronous neural network activity after a latent period may lead to epileptogenesis. Some attempts to alter seizures were done using animal models. One of the most promising involves chemogenetic tools via AAV viral vector injection to make some G protein-coupled receptors unresponsive to their natural ligands, and activated by the desired drug, such as clozapine-N-oxide. These designer receptors exclusively activated by designer drugs (DREADDs) have been studied in reducing the numbers and severity of seizures. According to unpublished works in our lab, using excitatory DREADDs in the vicinity of undercut was antiepileptogenic. We believe there could be an optimal level of excitation for yielding an optimal antiepileptogenic response. This excitation is in direct relation with neurons transfected. We hypothesize that the optimal neuronal transduction might be achieved with optimal dosage of virus delivered, in terms of viral titration and the volume of virus injected. To test this, we used three different titrations of AAV2/8 and we injected different volumes of these titrations in adult mice. Cortical transfection volume and number of neuronal transductions were estimated. With E11gc/ml titration, no transfection was visible. With E12gc/ml titration, an almost linear correlation was observed between the volume of virus injected and the number of neurons transduced and the cortical volume of transfection. With E13gc/ml titration the correlation between the injected AAV volume and the number of neuronal transductions was still good but there was a poor correlation between AAV volume and transfection volume. We concluded that E12gc/ml titration was a more reliable option for our further studies. The reliability of E13gc/ml titration needs to be proven.

Wild-type viruses with intrinsic oncolytic capacity in human includes DNA viruses like some autonomous parvoviruses and many RNA viruses. Recent advances in molecular biology have allowed the design of several genetically modified viruses, such as adenovirus and herpes simplex virus that specifically replicate in, and kill tumor cells. However, still several hurdles regarding clinical limitations and safety issues should be overcome before this mode of therapy can become of clinical relevance. It includes limited virus spread in tumor masses, stability of virus in the blood, trapping within the liver sinusoids, transendothelial transfer, and/or vector diffusion of viral particles to tumor cells, limited tumor transduction, immune-mediated inactivation or destruction of the virus. For replication-competent vectors without approved antiviral agents, suicide genes might be used as fail-safe mechanism. Cancer stem cells are a minor population of tumor cells that possess the stem cell property of self-renewal. Therefore, viruses that target the defective self-renewal pathways in cancer cells might lead to improved outcomes.<p>In this thesis, data we generated in the field of oncolytic autonomous parvoviruses are presented.<p>We replaced capsid genes by reporter genes and assessed expression in different types of human cancer cells and their normal counterparts, either at the level of whole cell population, (CAT ELISA) or at the single cell level, (FACS analysis of Green Fluorescent Protein). Cat expression was substantial (up to 10000 times background) in all infected tumor cells, despite variations according to the cell types. In contrast, no gene expression was detected in similarly infected normal cells, (with the exception of an expression slightly above background in fibroblasts.). FACS analysis of GFP expression revealed that most tumor cells expressed high level of GFP while no GFP positive normal cells could be detected with the exception of very few (less than 0.1%) human fibroblast cells expressing high level of GFP. We also replace capsid genes by genes coding for the costimulatory molecules B7-1 and B7-2 and show that, upon infection with B7 recombinant virions, only tumor cells display the costimulatory molecules and their immunogenicity was increased without any effect on normal cells. Using a recombinant MVM containig the Herpes Simplex thymidine kinase gene, we could get efficient killing of most tumor cell types in the presence of ganciclovir, whithout affecting normal proliferating cells. We also produced tetracycline inducible packaging cell lines in order to improve recombinant vectors yields. The prospects and limitations of these different strategies will be discussed.<p>An overview is given of the general mechanisms and genetic modifications by which oncolytic viruses achieve tumor cell-specific replication and antitumor efficacy. However, as their therapeutic efficacy in clinical trials is still not optimal, strategies are evaluated that could further enhance the oncolytic potential of conditionally replicating viruses in conjunction with other standard therapies. <p>Another exciting new area of research has been the harnessing of naturally tumor-homing cells as carrier cells to deliver oncolytic viruses to tumors. The trafficking of these tumor-homing cells (stem cells, immune cells and cancer cells), which support proliferation of the viruses, is mediated by specific chemokines and cell adhesion molecules and we are just beginning to understand the roles of these molecules. Finally, we will explore some ways deserving further study in order to be able to utilize various oncolytic viruses for effective cancer treatment. <p><p> / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished