Titre de l'écran-titre (visionné le 5 juin 2023) / Les AAV constituent des vecteurs viraux très utilisés en thérapie génique. Cependant une limite à leur utilisation est leur large tropisme, soit leur capacité à infecter plusieurs types de cellules. Pour y remédier, il a été question dans ce projet de produire des AAV2 recombinants dont la capside a été modifiée par l'insertion d'un anticorps à domaine unique (single domain antibody, sdAb) pour permettre une transduction spécifique de cellules du cancer de l'ovaire : les SKOV3. Ces cellules expriment à leur surface le récepteur tyrosine kinase Axl et l'anticorps inséré dans la protéine VP1 de la capside virale, lui est spécifique. Les AAV contenant l'anticorps (AAV-sdAb) ont été produits par transfection transitoire de cellules HEK293SF-3F6, puis purifiés par ultracentrifugation avec différents gradients d'Iodixanol et concentrés par filtration tangentielle avec des membranes à fibres creuses (Hollow fibers). L'insertion de l'anticorps dans la capside de l'AAV2 a été faite en utilisant 2 types de séquences de liaison : une courte et une longue. La production des AAV-sdAb avec courte séquence de liaison et exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) comme gène rapporteur s'est avéré difficile alors que celle avec la plus longue séquence a permis d'obtenir des titres vingt fois plus élevés. Pour démontrer une transduction spécifique des cellules cibles SKOV3, les plasmides permettant de produire les AAV-sdAb ont été mutés pour inhiber le site d'attachement des AAV2 au sulfate d'héparine, principal récepteur auquel il se lie à la surface des cellules hôtes. Les résultats obtenus ont permis de démontrer que le tropisme des AAV2 a été altéré par les mutations et que les AAV-sdAb infectent de façon spécifique les cellules SKOV3 qui expriment le récepteur Axl auquel l'anticorps inséré est spécifique. Ce projet a ainsi démontré qu'il est possible de modifier le tropisme des AAV à l'aide d'anticorps à domaine unique. / The use of adeno-associated viruses (AAV) as vectors for gene therapy has increased in recent years. However, a major drawback to their use is the large tropism, allowing the infection of many types of cells. To overcome that issue, we incorporated in this project a single-domain antibody (sdAb) into the capsid of AAV serotype 2 (AAV2) to enable it to specifically bind to a receptor tyrosine kinase Axl expressed on the surface of ovarian cancer cells SKOV3. The sdAb against Axl was inserted into the VP1 capsid subunit of AAV2. In order to investigate their targeting efficacy, AAV with the modified capsid (AAV-sdAb) were produced by transient transfection of HEK293SF-3F6 cells, purified by ultracentrifugation using Iodixanol step-gradients and concentrated by tangential-flow filtration using Hollow fiber membranes. In this study, two types of linker sequences, short and long were used for the insertion of the sdAb into VP1. Production of infectious AAV particles expressing GFP as a reporter proved to be difficult when using the short linker sequence, while production using the longer linker led to titers twenty times higher. To prove a specific transduction of Axl-expressing cells (SKOV3), plasmids required for AAV-sdAb production were mutated to inhibit the binding of AAV2 to its main receptor on cell surface: heparan sulfate. Characterization of those AAV-sdAb showed that the mutations led to an altered tropism for AAV2's natural receptor and more importantly, the viral vectors infect specifically the Axl-expressing cells SKOV3 as a result of the inserted anti-Axl antibody. Therefore, this study proved that it is possible to modify the tropism of AAV by using a single-domain antibody.

L'alpha-foetoprotéine (AFP) est une protéine hépatique feotale souvent réexprimée dans les hépatomes. L'utilisation de son promoteur en thérapie génique pourrait donc augmenter la spécificité du traitement. Nous avons tenté de mettre au point un système de thérapie génique utilisant des mutants plus puissants du promoteur de l'AFP associés au gène suicide de la thymidine kinase (TK). La comparaison de l'efficacité du gène TK sauvage et du mutant TK30 à induire la mort cellulaire en présence de la prodrogue ganciclovir (GCV) dans notre lignée cellulaire d'hépatome de rat v7.6 nous a révélé que le mutant n'était pas supérieur au gène sauvage. Nous avons comparé l'efficacité de mutants plus actifs du promoteur de l'AFP, MO1 et M11, à induire l'expression du gène TK placé sous leur contrôle ainsi que leur effet bystander respectif. Le mutant MO1 s'est révélé être le meilleur choix pour la thérapie. Un effet bystander a pu être observé in vivo chez des rats Buffalo injectés avec des v7.6 contenant le plasmide MO1-TK. Nous avons démontré la capacité de l'adénovirus Ad-CMV-LacZ ainsi que nos constructions Ad-MO1-EGFP et Ad-MO1-TK à transduire les hépatomes en culture et chez l'animal (sauf pour Ad-MO1-TK). Finalement, nous avons testé l'efficacité de notre système de thérapie génique in vivo. L'Ad-MO1-TK n'a pas réussi à éliminer les tumeurs. Notre système n'est donc pas encore fonctionnel tel qu'utilisé.

Wild-type viruses with intrinsic oncolytic capacity in human includes DNA viruses like some autonomous parvoviruses and many RNA viruses. Recent advances in molecular biology have allowed the design of several genetically modified viruses, such as adenovirus and herpes simplex virus that specifically replicate in, and kill tumor cells. However, still several hurdles regarding clinical limitations and safety issues should be overcome before this mode of therapy can become of clinical relevance. It includes limited virus spread in tumor masses, stability of virus in the blood, trapping within the liver sinusoids, transendothelial transfer, and/or vector diffusion of viral particles to tumor cells, limited tumor transduction, immune-mediated inactivation or destruction of the virus. For replication-competent vectors without approved antiviral agents, suicide genes might be used as fail-safe mechanism. Cancer stem cells are a minor population of tumor cells that possess the stem cell property of self-renewal. Therefore, viruses that target the defective self-renewal pathways in cancer cells might lead to improved outcomes.<p>In this thesis, data we generated in the field of oncolytic autonomous parvoviruses are presented.<p>We replaced capsid genes by reporter genes and assessed expression in different types of human cancer cells and their normal counterparts, either at the level of whole cell population, (CAT ELISA) or at the single cell level, (FACS analysis of Green Fluorescent Protein). Cat expression was substantial (up to 10000 times background) in all infected tumor cells, despite variations according to the cell types. In contrast, no gene expression was detected in similarly infected normal cells, (with the exception of an expression slightly above background in fibroblasts.). FACS analysis of GFP expression revealed that most tumor cells expressed high level of GFP while no GFP positive normal cells could be detected with the exception of very few (less than 0.1%) human fibroblast cells expressing high level of GFP. We also replace capsid genes by genes coding for the costimulatory molecules B7-1 and B7-2 and show that, upon infection with B7 recombinant virions, only tumor cells display the costimulatory molecules and their immunogenicity was increased without any effect on normal cells. Using a recombinant MVM containig the Herpes Simplex thymidine kinase gene, we could get efficient killing of most tumor cell types in the presence of ganciclovir, whithout affecting normal proliferating cells. We also produced tetracycline inducible packaging cell lines in order to improve recombinant vectors yields. The prospects and limitations of these different strategies will be discussed.<p>An overview is given of the general mechanisms and genetic modifications by which oncolytic viruses achieve tumor cell-specific replication and antitumor efficacy. However, as their therapeutic efficacy in clinical trials is still not optimal, strategies are evaluated that could further enhance the oncolytic potential of conditionally replicating viruses in conjunction with other standard therapies. <p>Another exciting new area of research has been the harnessing of naturally tumor-homing cells as carrier cells to deliver oncolytic viruses to tumors. The trafficking of these tumor-homing cells (stem cells, immune cells and cancer cells), which support proliferation of the viruses, is mediated by specific chemokines and cell adhesion molecules and we are just beginning to understand the roles of these molecules. Finally, we will explore some ways deserving further study in order to be able to utilize various oncolytic viruses for effective cancer treatment. <p><p> / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’immunothérapie anticancéreuse est basée sur la capacité du système immunitaire à reconnaître les cellules tumorales comme étrangères et à les éliminer. Les stratégies immunothérapeutiques abordées dans ce travail, incluent l’activation du système immunitaire par l’expression de facteurs immunomodulateurs (l’interleukine-2) via l’utilisation d’un vecteur dérivé du parvovirus MVM, ou par présentation des antigènes tumoraux par la machinerie des cellules dendritiques (DC), via la génération d’hybrides entre DC et cellules tumorales (TC).<p>L’intérêt majeur du parvovirus autonome MVM en tant que vecteur pour la thérapie génique du cancer vient de son expression préférentielle dans les cellules transformées (oncotropisme) et de son aptitude à lyser celles-ci (oncolyse). Les vecteurs générés au laboratoire conservent l’unité de transcription NS et expriment l’IL2 humaine sous contrôle du promoteur P38, à la place des protéines de capside. Malgré les améliorations apportées à la production de vecteurs recombinants, la faible concentration des stocks reste un problème. Il a été montré que, de nombreux virus sont mieux produits en conditions de faible tension en oxygène (hypoxie). Nous avons tenté d’améliorer les titres des vecteurs en les produisant sous faible tension d’oxygène mais sans y parvenir (annexe 1). Dans un modèle in vivo utilisant la lignée de mélanome K-1735 dans des souris immunocompétentes, des cellules tumorales infectées in vitro avant leur implantation en sous-cutané ont montré un effet anti-tumoral du vecteur MVM/IL2 (annexe 2). Afin de mettre en évidence l’apport de l’oncolyse parvovirale dans l’activité anti-tumorale, nous avons mis au point des expériences, dans le même modèle de tumeur, visant à comparer l’efficacité du vecteur MVM/IL2 à celle d’autres vecteurs, Ad/IL2 et Rétrovirus/IL2, ne possédant pas d’activité oncolytique. Dans le but de mettre en évidence une éventuelle réponse immune in vivo, nous avons utilisé le modèle de tumeur TC-1 mais ce modèle s’est montré moins sensible à l’effet du vecteur MVM/IL2 et nous n’avons pas pu démontrer d’activation de cellules cytotoxiques spécifiques de la tumeur.<p>Il a été proposé d’utiliser des hybrides entre DC/TC pour la vaccination anti-tumorale pour optimaliser la présentation des antigènes tumoraux. Une lignée cellulaire exprimant la protéine fusogène du virus de la leucémie du Gibbon (GaLV-FMG, Gibbon ape leukemia virus) a été dérivée de la lignée cellulaire CHO (cellules ovariennes de hamster chinois) au laboratoire. Cette lignée CHO-FMG, utilisée comme partenaire intermédiaire, a permis la fusion entre cellules tumorales et dendritiques (annexe 3). Nous avons montré que l’expression transitoire après infection par un vecteur AAV-FMG ou après transfection transitoire ne génère pas un pourcentage significatif d’hybrides. En effet, le niveau d’expression ainsi que le pourcentage de cellules transduites exprimant FMG s’est révélé trop faible. Ceci a mis en valeur l’efficacité de la lignée stable CHO-FMG comme intermédiaire de la fusion. De plus, nous avons intégré dans la lignée fusogène, le gène de l’interleukine-2, qui devrait permettre d’augmenter l’efficacité de l’induction de la réponse immune. <p>\ / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished