Proefschrift Universiteit van Amsterdam. / Met lit. opg. - Met samenvatting in het Nederlands.

Proefschrift Universiteit Maastricht. / Auteursnaam op omslag: Rob Roovers. Met lit. opg. - Met een samenvatting in het Nederlands.

Les anticorps bloquant les points de contrôle immunitaires modifient profondément la gestion des patients atteints de cancer. À la pointe de cette nouvelle classe d'agents anticancéreux, les anticorps anti-PD-1 / PD-L1 peuvent ainsi restaurer une réponse efficace des cellules T antitumorales. En conséquence, ces agents sont maintenant approuvés dans divers types de tumeurs, tels que le mélanome, le cancer bronchique non à petites cellules, le cancer du rein, les tumeurs ORL ou le cancer de la vessie. Ces nouvelles immunothérapies entraînent également de nouveaux profils de réponse tumorale tels que des réponses tumorales retardées ou des pseudoprogressions. Au fil de l’expérience acquise avec ces traitements, il a été observé chez certains patients un état de progression rapide de la maladie, ce qui pourrait suggérer que le blocage de points de contrôle immunitaire pourrait avoir un effet délétère en accélérant la maladie chez un sous-groupe de patients. Ce travail de thèse a permis de caractériser sur le plan clinique et biologique ce phénomène d’accélération de la croissance tumorale sous immunothérapie anti-checkpoint que nous avons définit “maladie hyperprogressive” (HPD). L’analyse transcriptomique d’échantillons tumoraux de ces patients a permis d’orienter vers un rôle spécifique de l’environnement myeloide. / Immune checkpoint blocking antibodies are profoundly changing the management of patients with cancer. At the forefront of this novel anticancer agent class, anti-PD-1/PD-L1 antibodies can exhibit a significant activity by restoring an efficient antitumor T-cell response. As a result, these agents are now approved in various tumor types such as melanoma, squamous, and nonsquamous non–small cell lung cancer (NSCLC), renal cell carcinoma (RCC), head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) or bladder cancer. Interestingly, these new immunotherapies also result in novel tumor response patterns such as delayed tumor responses or pseudoprogressions. As experience grows with these therapeutics, anecdotal reports are relating rapid disease progressions, which could suggest that immune checkpoint blockade may have a deleterious effect by accelerating the disease in a subset of patients. This thesis work has made it possible to characterize clinically and biologically this phenomenon of accelerated tumor growth under anti-checkpoint immunotherapy, which we have defined as “hyperprogressive disease” (HPD). Transcriptomic analysis of tumour samples from these patients suggested a specific role for the myeloid environment.

L’immunothérapie anticancéreuse est basée sur la capacité du système immunitaire à reconnaître les cellules tumorales comme étrangères et à les éliminer. Les stratégies immunothérapeutiques abordées dans ce travail, incluent l’activation du système immunitaire par l’expression de facteurs immunomodulateurs (l’interleukine-2) via l’utilisation d’un vecteur dérivé du parvovirus MVM, ou par présentation des antigènes tumoraux par la machinerie des cellules dendritiques (DC), via la génération d’hybrides entre DC et cellules tumorales (TC). L’intérêt majeur du parvovirus autonome MVM en tant que vecteur pour la thérapie génique du cancer vient de son expression préférentielle dans les cellules transformées (oncotropisme) et de son aptitude à lyser celles-ci (oncolyse). Les vecteurs générés au laboratoire conservent l’unité de transcription NS et expriment l’IL2 humaine sous contrôle du promoteur P38, à la place des protéines de capside. Malgré les améliorations apportées à la production de vecteurs recombinants, la faible concentration des stocks reste un problème. Il a été montré que, de nombreux virus sont mieux produits en conditions de faible tension en oxygène (hypoxie). Nous avons tenté d’améliorer les titres des vecteurs en les produisant sous faible tension d’oxygène mais sans y parvenir (annexe 1). Dans un modèle in vivo utilisant la lignée de mélanome K-1735 dans des souris immunocompétentes, des cellules tumorales infectées in vitro avant leur implantation en sous-cutané ont montré un effet anti-tumoral du vecteur MVM/IL2 (annexe 2). Afin de mettre en évidence l’apport de l’oncolyse parvovirale dans l’activité anti-tumorale, nous avons mis au point des expériences, dans le même modèle de tumeur, visant à comparer l’efficacité du vecteur MVM/IL2 à celle d’autres vecteurs, Ad/IL2 et Rétrovirus/IL2, ne possédant pas d’activité oncolytique. Dans le but de mettre en évidence une éventuelle réponse immune in vivo, nous avons utilisé le modèle de tumeur TC-1 mais ce modèle s’est montré moins sensible à l’effet du vecteur MVM/IL2 et nous n’avons pas pu démontrer d’activation de cellules cytotoxiques spécifiques de la tumeur. Il a été proposé d’utiliser des hybrides entre DC/TC pour la vaccination anti-tumorale pour optimaliser la présentation des antigènes tumoraux. Une lignée cellulaire exprimant la protéine fusogène du virus de la leucémie du Gibbon (GaLV-FMG, Gibbon ape leukemia virus) a été dérivée de la lignée cellulaire CHO (cellules ovariennes de hamster chinois) au laboratoire. Cette lignée CHO-FMG, utilisée comme partenaire intermédiaire, a permis la fusion entre cellules tumorales et dendritiques (annexe 3). Nous avons montré que l’expression transitoire après infection par un vecteur AAV-FMG ou après transfection transitoire ne génère pas un pourcentage significatif d’hybrides. En effet, le niveau d’expression ainsi que le pourcentage de cellules transduites exprimant FMG s’est révélé trop faible. Ceci a mis en valeur l’efficacité de la lignée stable CHO-FMG comme intermédiaire de la fusion. De plus, nous avons intégré dans la lignée fusogène, le gène de l’interleukine-2, qui devrait permettre d’augmenter l’efficacité de l’induction de la réponse immune. L’activation des cellules effectrices de l’immunité anti-tumorale via la présentation antigénique et/ou par des cytokines est au centre de ce travail. Une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents devrait permettre d’améliorer ces systèmes de vaccination non-conventionnels.

Des molécules sont présentées aux T Vγ9Vδ2 par une protéine de co-stimulation immune BTN3A.Le membre BTN3A2 est surexprimé dans 4 cancers, et pourrait agir comme récepteur leurre.Récemment, l’isoforme BTN3A2 a été décrite comme régulant la localisation membranaire du BTN3A1 grâce à une hétérodimérisation.L’objectif de mon projet était d’identifier le ligand de BTN3A2 pour une immunothérapie.Ainsi, nous avons tout d’abord sélectionné, par des études de liaison utilisant la cytométrie en flux, quelques lignées cellulaires T exprimant le ligand de BTN3A2. Puis basé sur notre sélection, la comparaison du profil d’expression génique a été effectuée, nous permettant d’établir une liste de protéines membranaires candidats du ligand de BTN3A2,les molécules HLA de classe II. Après génération de lignées cellulaires surexprimant les candidats potentiels de la méthode transcriptomique, ces cellules ont été utilisées pour des tests de liaison avec le BTN3A2-Fc qui se sont révélés négatifs dans les différentes conditions.De plus, la technologie de transfections transitoires puis tests de liaison, a été utilisée pour identifier les récepteurs partenaires potentiels de BTN3A2.Les quatre produits géniques restants ont été sélectionnés, PLPP3, SEMA6A, SEMA6C et MSR1 mais non validés.Finalement, nous avons utilisé un agent de capture avec trois bras, permettant une liaison covalente, qui a montré que BTN3A1 était le candidat potentiel. Dans notre projet, nous avons confirmé l’hétérodimérisation de BTN3A1/A2 et nous avons démontré la forme existante d’hétérodimérisation pour former une voie de signalisation activant les cellules T Vγ9Vδ2. / Molecules are presented to Vγ9Vδ2 T cells by immune costimulatory protein BTN3A.BTN3A2 which is devoid of a functional intracellular domain, is overexpressed in 4 cancers. Recently, BTN3A2 was described as regulator of subcellular localization of BTN3A1 thanks to heterodimerization. The aim of our project, was to identify the ligand of BTN3A2 for immunotherapy. Therefore, we have first selected by binding studies using flow cytometry, few T cell lines expressing BTN3A2 ligand.Based on the selection, a gene expression profile comparison was performed and allowed us to establish a list of membrane proteins expressed only in positive cell lines, BTN3A2 ligand candidates. The highest FC were found for HLA class II molecules. Cell lines overexpressing potential candidates of transcriptomic method were used for binding assays using BTN3A2-Fc, but were negative in all conditions. Then cell microarray technology was used to identify potential receptor partners of BTN3A2. 4 remaining gene products were selected, PLPP3, SEMA6A, SEMA6C and MSR1. The validation of these candidates was not done after transient transfection and binding test with BTN3A2-Fc (using flow cytrometry). Moreover, chemoproteomic experiments were performed to isolate and identify by mass spectrometry (MS) BTN3A2 ligand. Therefore, we used an original capture reagent (TFR) with three moieties, allowing covalent binding, which showed clearly BTN3A1 as a potential candidate. In our project, we have confirmed the heterodimerization of BTN3A1/A2 and we have demonstrated an existing form of heterodimerization that could interact with other proteins, to form a signaling pathway activating Vγ9Vδ2 T cells.

Das Immunsystem zu aktivieren, um eine körpereigene Immunantwort gegen Tumorzellen hervorzurufen, ist ein innovativer Therapieansatz. Eine vielversprechende Zielstruktur hierfür ist CD40, ein Mitglied der TNFRSF- Familie und starker Stimulator Antigen-präsentierender Zellen. Die TNFRSF-Rezeptor Aktivierung ist abhängig von der Bildung oligomerer (TNFSF3-TNFRSF3)2 Komplexe, was insbesondere durch entsprechende räumliche Ausrichtung membranständiger Liganden und deren hohe lokale Konzentration im Zell-Zell-Kontakt gewährleistet wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die (TNFSF3-TNFRSF3)2 Komplexbildung mittels membranständiger Liganden durch die Generierung von CD40-spezifischen Antikörper-Fusions- proteinen imitiert, die über zusätzliche Bindedomänen, single chain fragment variable (scFvs), für zellständige Zielstrukturen (CD70, BCMA, PDL1) verfügen. Dazu wurden die schweren und/oder leichten anti-CD40 Antikörperketten C-terminal mit einem scFv-Fragment verknüpft und dadurch verschiedene CD40-spezifische Antikörper-Fusionsproteine mit scFv-Fragmenten generiert. Die Funktionalität dieser besonderen Antikörper-Fusionsproteine wurde hinsichtlich ihrer Bindungsfähigkeit mittels Gaussia princeps Luciferaseassay und hinsichtlich ihres Agonismus über den Nachweis der Interleukin-8 Induktion per ELISA analysiert. Dabei zeigte sich, dass die CD40-Aktivierung durch die an den Antikörper-Fusionsproteinen verankerten scFv-Domänen bei einem Großteil potenziert werden konnte, wenn diese die entsprechenden Zielantigene CD70, BCMA, PDL1 binden. Des Weiteren waren hinsichtlich ihres Agonimsus die Antikörper-Fusionsproteine mit einer scFv-Domäne an der schweren oder an der leichten Antikörperkette den Antikörper-Fusionsproteinen überlegen, die scFv-Domänen an beiden Antikörperketten aufwiesen. Dennoch stellen auch letztere eine vielversprechende Therapievariante dar, da sie aufgrund ihrer breiteren Spezifität verschiedene Tumorantigene binden können. Die in dieser Arbeit produzierten und charakterisierten CD40-spezifischen Antikörper-Fusionsproteine aktivieren das Immunsystem gezielter in dem Gewebe, in dem vermehrt spezifische Tumorantigene exprimiert werden. Dadurch eröffnen sie neue Möglichkeiten in der Tumortherapie. / Activating the immune system to induce an endogenous immune response against tumor cells is an innovative therapeutic approach. A promising target structure for this is CD40, a member of the TNFRSF family and potent stimulator of antigen-presenting cells. TNFRSF receptor activation is dependent on the formation of oligomeric (TNFSF3-TNFRSF3)2 complexes, which is particularly ensured by appropriate spatial targeting of membrane-bound ligands and their high local concentration in cell-cell interaction. In this work, (TNFSF3-TNFRSF3)2 complex formation using membrane-bound ligands was mimicked by the generation of CD40-specific antibody fusion proteins possessing additional binding domains, single chain fragment variables (scFvs), for cell-bound targets (CD70, BCMA, PDL1). For this purpose, anti-CD40 antibody heavy and/or light chains were C-terminally linked to a scFv fragment, thereby generating different CD40-specific antibody fusion proteins with scFv fragments. The functionality of these particular antibody fusion proteins was analyzed with respect to their binding ability by Gaussia princeps luciferase assay and to their agonism via detection of interleukin-8 induction by ELISA. This showed that CD40 activation could be potentiated by the scFv domains anchored to the antibody fusion proteins in a large proportion when these bind the corresponding target antigens CD70, BCMA, PDL1. Furthermore, in terms of agonimus, antibody fusion proteins with an scFv domain on the heavy or on the light antibody chain were superior to antibody fusion proteins that had scFv domains on both antibody chains. Nevertheless, the latter also represent a promising therapeutic option, as they can bind various tumor antigens due to their broader specificity. The CD40-specific antibody fusion proteins produced and characterized in this work activate the immune system in a more targeted manner in the tissue where specific tumor antigens are increasingly expressed. Thus, they open up new possibilities in tumor therapy.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, ein Vektorsystem zu entwickeln, dass den simultanen Transfer verschiedener Transgene in CD8+ und CD4+ T-Zellen und dadurch die Herstellung eines immunotherapeutischen T-Zell-Produkts ermöglicht, welches aus zwei unterschiedlich modifizierten T-Zell-Subtypen besteht. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Targeting-Technologie von lentiviralen auf γ-retrovirale Vektoren übertragen. Anschließend wird die Herstellung von Vektoren beschrieben, die spezifisch für murines CD4 oder CD8 sind. Deren Spezifität wurde zum einen durch die exklusive Expression von GFP in CD4+ oder CD8+ Zellen und zum anderen durch den Dosis-abhängigen Verlust des GFP-Signals nach Inkubation dieser Zellen mit CD4- und CD8-blockierenden Antikörpern nachgewiesen. Im dritten Teil der Arbeit wird gezeigt, dass MVm8 und MVm4 primäre T-Zellen spezifisch transduzieren. MVm8-vermittelter Transfer des Ovalbumin (OVA)-reaktiven TZRs OT-I führte zu T-Zellen, die OVA+ Tumor-Zelllinien erkannten und Interferon-γ sezernierten. Der vierte Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der in vivo Transduktion primärer T-Zellen mithilfe von MVm8, welches den OT-I-TZR und eine Luciferase transferiert (MVm8/OT-I-luc). Durch systemische Applikation von MVm8/OT-I-luc wurden T-Zellen in vivo transduziert. Durch Immunisierungen konnten antigen-spezifisches Homing, Expansion und eine anschließende Kontraktion in vivo transduzierter T-Zellen gezeigt werden. Mäuse mit starker OT-I-luc-Expression waren gegenüber einer Infektion durch OVA-transgene listeria monocytogenes geschützt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das in dieser Arbeit entwickelte Vektorsystem in der Lage ist zwischen Subtypen von T-Zellen zu unterscheiden und sie simultan mit unterschiedlichen Transgenen auszustatten. Für MVm8 konnte gezeigt werden, dass es T-Zellen direkt in vivo transduzieren kann. / The aim of this thesis was to generate a vector system that allows the simultaneous transfer of different transgenes into CD8+ and CD4+ T cells, allowing the generation of a immunotherapeutic T cell product comprised of two differently engineered T cell subsets. The first part of the thesis describes the transfer of the measles virus (MV) envelope-based targeting technology from lentiviral (LV) to γ-retroviral (gRV) vectors. The second part reports the generation of two targeting vectors specific for murine CD4 or CD8. The exclusive specificity of MVm4 and MVm8 was proven by expression of GFP in CD4+ and CD8+ reporter cells, respectively, but not in CD4-CD8- cells after transduction, and by a dose-dependent loss of GFP signal after incubation of reporter cells with CD4 or CD8 blocking antibodies before transduction. The third part shows that MVm8 but not MVm4 transduced primary T cells. MVm8-mediated transfer of the ovalbumin (OVA)-reactive TCR OT-I resulted in T cells secreting interferon-γ (IFNγ) upon recognition of OVA+ tumor cell lines. The final part of this thesis describes the in vivo transduction of primary T cells using MVm8 transferring OT-I and a luciferase (MVm8/OT-I-luc). To this end, B6 mice deficient for Rag2 have been repopulated with either polyclonal (B6) or monoclonal T cells derived from P14-TCR transgenic mice (P14). One day later the transferred T cells were transduced in vivo by systemic application of MVm8/OT-I-luc. Upon immunization in vivo-transduced T cells homed, expanded and contracted repeatedly in an antigen-dependent manner. Finally, mice exhibiting strong luc-signals showed improved protection against infections by OVA-transgenic listeria monocytogenes (LM-OVA). In conclusion, the viral vector system developed within this thesis is able to discriminate between the two main T cell subsets and to equip them with distinct transgenes simultaneously.

La réponse immune lors d'une infection par le VHB est essentielle pour éliminer le virus. Le virus module le système immunitaire pour échapper à son contrôle. Le mécanisme par lequel le virus module l'immunité est encore mal connu. Les cellules dendritiques plasmocytoides (pDC) jouent un rôle crucial dans l'immunité antivirale de part leur capacité à capturer et apprêter les antigènes viraux afin d'induire une réponse immune adaptative. Les pDCs représentent un bon potentiel pour restaurer une immunité anti-VHB fonctionnelle, mais le VHB pourrait moduler les pDCs pour échapper au contrôle immunitaire. Dans une première partie, nous avons évalué le potentiel des pDCs à restaurer l'immunité anti-VHB en contexte d'hépatite B chronique. Nous avons utilisé une lignée de pDCs HLA-A*0201+ chargée avec des peptides HLA-A*0201 restreints dérivés des antigènes HBc et HBs du virus afin d'amplifier des lymphocytes T spécifiques ex vivo à partir de cellules de patients atteints d'hépatite B chronique. Nous avons ensuite établi un modèle de souris humanisées (Hepato-HuPBL) afin d'évaluer le potentiel thérapeutique de la stratégie in vivo. La stimulation de PBMC ou de lymphocytes infiltrant le foie (LIL) issus de patients HLA-A*0201+ par la lignée de pDC chargée avec le peptide HBc a permis d'amplifier des lymphocytes T spécifiques de HBc et fonctionnels dans 45,8% des cas. Le groupe de non répondeurs était caractérisé par la présence d'Ag HBe ou un plus fort niveau de lymphocytes T régulateurs. L'efficacité thérapeutique du vaccin de pDC a été évaluée dans un modèle de souris NOD-SCID β2m-/- reconstituées avec des PBMC issus de patient VHB et xenotransplantées avec des hépatocytes humains transfectés avec le VHB. La vaccination de ces souris avec la lignée de pDC chargée avec les peptides HBc et HBs a permis l'amplification de lymphocytes T CD8 spécifiques du VHB capables de lyser spécifiquement les hépatocytes infectés in vivo. Ainsi, la lignée de pDC chargée avec des peptides dérivés du VHB est capable d'amplifier des lymphocytes T CD8 spécifiques du VHB et fonctionnels in vitro et in vivo. Cette nouvelle stratégie d'immunothérapie pourrait donc restaurer une immunité antivirale et permettre l'élimination du virus chez les patients atteints d'hépatite B chronique. Dans une deuxième partie, nous avons évalué le rôle physiopathologique des pDCs au cours de l'infection chronique par le VHB et les conséquences fonctionnelles sur le cross-talk pDC/NK. Des défauts fonctionnels des pDCs et des cellules NK ont été observé chez les patients atteints d'hépatite B chronique. Cependant le cross-talk pDC/NK ainsi que les mécanismes en jeu n'ont pas encore été élucidé. Nous avons étudié le phénotype et la capacité de répondre à une stimulation TLR-L des pDCs de patients comparé aux pDCs de donneurs sains puis nous avons étudié les conséquences sur le cross-talk entre pDCs de patients (virémiques ou avirémiques) et cellules NK hétérologues. Les pDCs de patients montrent un phénotype plus activé que les pDCs de donneurs sains mais ne sont pas capables de répondre à une stimulation TLR9-L. De plus, les pDCs de patients virémiques ne sont pas capables d'activer les fonctions cytotoxiques des cellules NK. Cette perturbation du cross-talk pDC/NK semble liée à un défaut de production d'IFNα et d'expression d'OX40L par les pDCs de patients virémiques, ainsi qu'à la présence d'une quantité importante d'IP-10 dans le plasma des patients. Ainsi, le VHB pourrait échapper à l'immunité en altérant la fonction des pDCs et perturbant le cross-talk pDC/NK par un mécanisme dépendant de IP-10, OX40L et IFNα.

La réponse immune lors d'une infection par le VHB est essentielle pour éliminer le virus. Le virus module le système immunitaire pour échapper à son contrôle. Le mécanisme par lequel le virus module l'immunité est encore mal connu. Les cellules dendritiques plasmocytoides (pDC) jouent un rôle crucial dans l'immunité antivirale de part leur capacité à capturer et apprêter les antigènes viraux afin d'induire une réponse immune adaptative. Les pDCs représentent un bon potentiel pour restaurer une immunité anti-VHB fonctionnelle, mais le VHB pourrait moduler les pDCs pour échapper au contrôle immunitaire. Dans une première partie, nous avons évalué le potentiel des pDCs à restaurer l'immunité anti-VHB en contexte d'hépatite B chronique. Nous avons utilisé une lignée de pDCs HLA-A*0201+ chargée avec des peptides HLA-A*0201 restreints dérivés des antigènes HBc et HBs du virus afin d'amplifier des lymphocytes T spécifiques ex vivo à partir de cellules de patients atteints d'hépatite B chronique. Nous avons ensuite établi un modèle de souris humanisées (Hepato-HuPBL) afin d'évaluer le potentiel thérapeutique de la stratégie in vivo. La stimulation de PBMC ou de lymphocytes infiltrant le foie (LIL) issus de patients HLA-A*0201+ par la lignée de pDC chargée avec le peptide HBc a permis d'amplifier des lymphocytes T spécifiques de HBc et fonctionnels dans 45,8% des cas. Le groupe de non répondeurs était caractérisé par la présence d'Ag HBe ou un plus fort niveau de lymphocytes T régulateurs. L'efficacité thérapeutique du vaccin de pDC a été évaluée dans un modèle de souris NOD-SCID β2m-/- reconstituées avec des PBMC issus de patient VHB et xenotransplantées avec des hépatocytes humains transfectés avec le VHB. La vaccination de ces souris avec la lignée de pDC chargée avec les peptides HBc et HBs a permis l'amplification de lymphocytes T CD8 spécifiques du VHB capables de lyser spécifiquement les hépatocytes infectés in vivo. Ainsi, la lignée de pDC chargée avec des peptides dérivés du VHB est capable d'amplifier des lymphocytes T CD8 spécifiques du VHB et fonctionnels in vitro et in vivo. Cette nouvelle stratégie d'immunothérapie pourrait donc restaurer une immunité antivirale et permettre l'élimination du virus chez les patients atteints d'hépatite B chronique. Dans une deuxième partie, nous avons évalué le rôle physiopathologique des pDCs au cours de l'infection chronique par le VHB et les conséquences fonctionnelles sur le cross-talk pDC/NK. Des défauts fonctionnels des pDCs et des cellules NK ont été observé chez les patients atteints d'hépatite B chronique. Cependant le cross-talk pDC/NK ainsi que les mécanismes en jeu n'ont pas encore été élucidé. Nous avons étudié le phénotype et la capacité de répondre à une stimulation TLR-L des pDCs de patients comparé aux pDCs de donneurs sains puis nous avons étudié les conséquences sur le cross-talk entre pDCs de patients (virémiques ou avirémiques) et cellules NK hétérologues. Les pDCs de patients montrent un phénotype plus activé que les pDCs de donneurs sains mais ne sont pas capables de répondre à une stimulation TLR9-L. De plus, les pDCs de patients virémiques ne sont pas capables d'activer les fonctions cytotoxiques des cellules NK. Cette perturbation du cross-talk pDC/NK semble liée à un défaut de production d'IFNα et d'expression d'OX40L par les pDCs de patients virémiques, ainsi qu'à la présence d'une quantité importante d'IP-10 dans le plasma des patients. Ainsi, le VHB pourrait échapper à l'immunité en altérant la fonction des pDCs et perturbant le cross-talk pDC/NK par un mécanisme dépendant de IP-10, OX40L et IFNα. / The immune control of HBV infection is essential for viral clearance. The virus is able to modulate the immune system to escape this control. The mechanisms involved remain largely unknown. Plasmacytoid dendritic cells (pDC) play a crucial role in anti‐viral immunity due to their ability to capture and process viral antigens and subsequently induce adaptive immune responses. PDCs are therefore promising to restore functional anti‐HBV immunity, but HBV could modulate the pDCs to escape the immune control. First, we investigated the potential of pDCs in triggering anti‐viral immunity against HBV during chronic infection. We used a HLA‐A*0201+ pDC line loaded with HLA‐A*0201-restricted peptides derived from HBc/HBs antigens to amplify specific T cells ex vivo from chronic HBV patients. Then we established an Hepato-HuPBL humanized mouse model to address the therapeutic potential of the strategy in vivo. Stimulation of PBMC or liver-infiltrated lymphocytes from HLA‐A*0201+ chronic HBV patients by the HBc peptide-loaded pDC line elicited functional HBV-specific CD8 T cells in 45.8% of cases. The “non-responder” group of patients was characterised by the presence of HBe Ag or higher level of regulatory T cells. The therapeutic efficacy of the pDC-based vaccine was evaluated in NOD-SCID β2m-/- mice reconstituted with HBV patients' PBMC and xenotransplanted with human HBV-transfected hepatocytes. Vaccination of these mice with the HBc/HBs peptide‐loaded pDC line elicited HBV-specific T cells in vivo able to specifically lyses infected hepatocytes. Thus pDCs loaded with HBV‐derived peptides can elicit functional virus-specific T cells in vitro and in vivo. This new cell-based immunotherapeutic strategy could restore functional anti‐viral immunity and clear the virus in chronic HBV patients. In the second part, we investigated the pathophysiological role of pDCs from chronic HBV patients and the functional consequences on pDC-NK cross-talk. Functional impairment have been observed in both pDC and NK cells in chronic HBV patients. However, the cross-talk pDC/NK and the mechanisms involved have not been elucidated. We studied the phenotype and the ability to respond to a TLR-L stimulation of the pDCs from HBV patients compared to healthy donors, and we investigated the consequences on the cross-talk between patients' (viremic or aviremic) pDCs and heterologous NK cells. PDCs show higher levels of activation in patients compared to healthy donors but were not able to respond to TLR9-L stimulation. In addition, pDCs from viremic chronic HBV patients failed to trigger a normal NK cytolytic function after TLR9-L stimulation. This pDC-dependant NK dysfunction was related to impaired IFNα secretion and OX40L expression by pDCs from viremic patients, and related to high plasma IP-10 levels found in patients. In conclusion HBV could escape the immune system by impairing pDC function and subsequent pDC/NK cross-talk by a mechanism involving IP10, OX40L and IFNα.

Du fait de leurs propriétés immunostimulantes, les entérotoxines de Staphylococcus aureus (SEs) sont aussi considérées comme des outils thérapeutiques anticancéreux potentiels. Cependant, leurs implications dans de nombreuses pathologies humaines limitent leurs utilisations. Récemment, un opéron dénommé enterotoxin gene cluster (egc) codant pour cinq entérotoxines (SEG, SEI, SElM, SElN et SElO) supposées être de moindre virulence pour l’organisme, a été mis en évidence. En 2004, des patients atteints de carcinome broncho-pulmonaire ont été traités par l’administration d’un surnageant de culture d’une souche de S. aureus, contenant l’opéron egc. Ce traitement a permis d’allonger la durée de survie, et n’a eu aucun effet secondaire. Dans ce cadre, l’objectif de cette thèse a été d’étudier l’activité anti-tumorale des toxines de l’egc. Nos travaux ont mis en évidence l’activité tumoricide de ces toxines, induite par l’activation du système immunitaire. Cette toxicité est médiée par la sécrétion de nombreux médiateurs solubles comme le TNF-α et le NO. Nous avons confirmé le caractère pro-inflammatoire de type Th1 des toxines de l’egc. Nos travaux ont également montré qu’hormis SEI, les toxines de l’egc induisent des sécrétions de cytokines, chimiokines, protéases matricielles (MMPs) et facteurs de croissances nettement inférieures à celle induites par le reste des SEs. Ces résultats pourraient expliquer la faible toxicité associée aux toxines de l’egc. Enfin, nous avons montré que SElO possèdent une toxicité intrinsèque vis-à-vis des lignées tumorales. Cette étude plaide en faveur de l'intérêt des toxines de l’egc dans le développement de nouvelles approches en thérapie anti-tumorale / The use of classical superantigens (e.g. SEA, SEB and SEC) for treatment of cancer has resulted in a low response rates due to serious toxicity in humans. However, in a recent clinical study, remarkable results in treating lung cancer were obtained using superantigens encoded by the enterotoxin gene cluster (egc) without causing any significant toxicity. The current study was performed to investigate how egc superantigens (i.e. SEG, SEI, SElM, SElN and SElO) have tumoricidal activity with low toxicity. Indeed, we first demonstrated that tumoricidal activity of egc-SEs is mediated by immune cell activation, in particular, by secretion of soluble mediators such as nitric oxide and TNF-α. Thus, the proteomic analysis of the PBMC supernatants, showed that SEs-egc enhance the expression of pro-inflammatory cytokines, chimokines and many other biomarkers. Interestingly, levels were significantly higher in supernatants of SEA-stimulated PBMC than those with egc superantigens suggesting that staphylococcal superantigens differs in their inflammatory proprerties. Our results suggest that the relative lower pro-inflammatory activity of egc toxins may explain the low toxicity of these toxins observed during the clinical trial. Finally, we showed that SElO have a direct cytostatic activity against tumor cells. These findings suggest that egc-SEs seems to be good candidates for the development of new drugs in cancer therapy