Thema dieser Arbeit war die klinische sowie molekulargenetische Analyse einer Familie mit der Verdachtsdiagnose autosomal dominante lamelläre Ichthyose (ADLI). Mit direkter Sequenzierung des Loricrin-Gens (LOR) wurde die Mutation 730insG identifiziert und die Diagnose Loricrin-Keratoderma gestellt. Durch Analyse weiterer Patienten wurde gezeigt, dass ADLI keine Loricrin-Keratoderma darstellt. Nach eingehender klinischer Untersuchung und Literaturanalyse konnten für die hier beschriebene Entität folgende Merkmale definiert werden: Als Hauptmerkmale eine honigwabenförmige Palmoplantarkeratose sowie eine leichte Ichthyose, als Nebenmerkmale Pseudoainhums, Autoamputationen, Kollodiumbaby, prominente Fingerknöchel sowie Hyperkeratosen an Knien und Ellenbögen. Die genetisch als Loricrin-Keratoderma charakterisierte Verhornungsstörung in der beschriebenen Familie sollte nunmehr klinisch als honigwabenförmige Palmoplantarkeratose mit Ichthyose bezeichnet werden. Zur Standarddiagnostik von Loricrin-Keratoderma wurde die direkte Sequenzierung von LOR auf DNA-Basis etabliert. Die Mutation 730insG resultiert in einer neuen argininreichen Domäne und einer Verlängerung des Proteins um 22 Aminosäuren. Eine Expressionsanalyse mittels Pyrosequenzierung zeigte eine gleichwertige Expression des mutierten und des Wildtyp-Allels. Dies unterstützt die „gain-of-function“-Theorie für das veränderte Loricrin und stützt die Aussage des für Loricrin-Keratoderma existierenden transgenen Mausmodells. / The main focus of this thesis was the clinical and genetic analysis of a family referred to us with the diagnosis of autosomal dominant lamellar ichthyosis (ADLI). Through direct sequencing of the loricrin gene (LOR) the mutation 730insG was identified and the family was diagnosed as having loricrin keratoderma. By sequencing further patients it was shown that ADLI is not a loricrin keratoderma. Based on refined clinical examination and analysis of the literature the following criteria could be defined for the entity seen: Compulsory features are honeycomb-like palmoplantar keratoderma and ichthyosis, optional features are pseudoainhums, autoamputations, collodion baby, prominent knuckle pads as well as hyperkeratotic lesions on knees and elbows. Therefore the disorder of keratinisation of the family described here genetically characterised as loricrin keratoderma should be clinically termed “honeycomb-like palmoplantar keradoderma with ichthyosis”. To molecularly diagnose loricrin keratoderma direct sequencing of LOR with DNA samples was established. The mutation 730insG results in a new arginine rich domain and an elongation of the protein by 22 residues. Expression analysis showed an equal expression of mutant and wild-type allele. This underlined the “gain-of-function” theory of the modified loricrin and supported the findings in the transgenic mouse model for loricrin keratoderma.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, ein Vektorsystem zu entwickeln, dass den simultanen Transfer verschiedener Transgene in CD8+ und CD4+ T-Zellen und dadurch die Herstellung eines immunotherapeutischen T-Zell-Produkts ermöglicht, welches aus zwei unterschiedlich modifizierten T-Zell-Subtypen besteht. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Targeting-Technologie von lentiviralen auf γ-retrovirale Vektoren übertragen. Anschließend wird die Herstellung von Vektoren beschrieben, die spezifisch für murines CD4 oder CD8 sind. Deren Spezifität wurde zum einen durch die exklusive Expression von GFP in CD4+ oder CD8+ Zellen und zum anderen durch den Dosis-abhängigen Verlust des GFP-Signals nach Inkubation dieser Zellen mit CD4- und CD8-blockierenden Antikörpern nachgewiesen. Im dritten Teil der Arbeit wird gezeigt, dass MVm8 und MVm4 primäre T-Zellen spezifisch transduzieren. MVm8-vermittelter Transfer des Ovalbumin (OVA)-reaktiven TZRs OT-I führte zu T-Zellen, die OVA+ Tumor-Zelllinien erkannten und Interferon-γ sezernierten. Der vierte Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der in vivo Transduktion primärer T-Zellen mithilfe von MVm8, welches den OT-I-TZR und eine Luciferase transferiert (MVm8/OT-I-luc). Durch systemische Applikation von MVm8/OT-I-luc wurden T-Zellen in vivo transduziert. Durch Immunisierungen konnten antigen-spezifisches Homing, Expansion und eine anschließende Kontraktion in vivo transduzierter T-Zellen gezeigt werden. Mäuse mit starker OT-I-luc-Expression waren gegenüber einer Infektion durch OVA-transgene listeria monocytogenes geschützt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das in dieser Arbeit entwickelte Vektorsystem in der Lage ist zwischen Subtypen von T-Zellen zu unterscheiden und sie simultan mit unterschiedlichen Transgenen auszustatten. Für MVm8 konnte gezeigt werden, dass es T-Zellen direkt in vivo transduzieren kann. / The aim of this thesis was to generate a vector system that allows the simultaneous transfer of different transgenes into CD8+ and CD4+ T cells, allowing the generation of a immunotherapeutic T cell product comprised of two differently engineered T cell subsets. The first part of the thesis describes the transfer of the measles virus (MV) envelope-based targeting technology from lentiviral (LV) to γ-retroviral (gRV) vectors. The second part reports the generation of two targeting vectors specific for murine CD4 or CD8. The exclusive specificity of MVm4 and MVm8 was proven by expression of GFP in CD4+ and CD8+ reporter cells, respectively, but not in CD4-CD8- cells after transduction, and by a dose-dependent loss of GFP signal after incubation of reporter cells with CD4 or CD8 blocking antibodies before transduction. The third part shows that MVm8 but not MVm4 transduced primary T cells. MVm8-mediated transfer of the ovalbumin (OVA)-reactive TCR OT-I resulted in T cells secreting interferon-γ (IFNγ) upon recognition of OVA+ tumor cell lines. The final part of this thesis describes the in vivo transduction of primary T cells using MVm8 transferring OT-I and a luciferase (MVm8/OT-I-luc). To this end, B6 mice deficient for Rag2 have been repopulated with either polyclonal (B6) or monoclonal T cells derived from P14-TCR transgenic mice (P14). One day later the transferred T cells were transduced in vivo by systemic application of MVm8/OT-I-luc. Upon immunization in vivo-transduced T cells homed, expanded and contracted repeatedly in an antigen-dependent manner. Finally, mice exhibiting strong luc-signals showed improved protection against infections by OVA-transgenic listeria monocytogenes (LM-OVA). In conclusion, the viral vector system developed within this thesis is able to discriminate between the two main T cell subsets and to equip them with distinct transgenes simultaneously.

Das Induzieren und Aufrechterhalten einer tumor-protektiven Immunität sind wesentliche Ziele in der Immuntherapie des Neuroblastoms. Eine Erhöhung der Anzahl von tumor-infiltrierenden Leukozyten könnte ein Weg sein, um dieses Ziel zu erreichen. Fractalkine ist ein besonderes TH1 CX3C Chemokin, welches sowohl Adhäsion und Migration von Leukozyten vermittelt. Gerichtetes IL-2 (ch14.18-IL-2) wurde durch eine genetische Fusion von anti-GD2 Antikörper mit IL-2 hergestellt, damit IL-2 spezifisch in das Mikromilieu von Neuroblastomen gebracht werden kann. In dieser Arbeit habe ich die Hypothese getestet, dass Gentherapie mit dem Chemokin Fractalkine (FKN) eine wirksame Antineuroblastom-Immunantwort induziert, welche durch gerichtetes IL-2 amplifiziert wird. Zu diesem Zweck wurden NXS2-Zellen genetisch verändert, damit sie murines FKN produzieren (NXS2-FKN). Transkription und Expression des mFKN Gens konnte in NXS2-FKN Zellen und Tumorgewebe gezeigt werden. Die chemotaktische Eigenschaft von FKN wurde sowohl in vitro als auch in vivo gezeigt. FKN zeigte eine Reduktion des Primärtumorwachstums, welches durch gerichtetes IL-2 mit nicht-kurativen Dosen von ch14.18-IL-2 deutlich verbessert wurde. Ferner wurden experimentelle Lebermetastasen nur in den Mäusen komplett eradiziert, welche die Kombinationstherapie erhalten haben. Die Mechanismen, welche an dieser Antitumorantwort beteiligt sind, schließen eine wirksame T-Zell-Aktivierung (Hochregulation von CD69, CD25, und von TNF-alpha und INF-gamma), sowie eine Erhöhung der tumorspezifischen CTL-Aktivität mitein. Die Depletion von CD4+ und CD8+ T-Zellen in vivo hat diesen therapeutischen Effekt aufgehoben, was die essentielle Rolle von T-Zellen in diesem immuntherapeutischen Ansatz unterstreicht. Zusammenfassend konnte ich zum ersten Mal zeigen, dass Chemokin-Gentherapie mit FKN durch gerichtetes IL-2 amplifiziert wird, was eine Kombination dieser beiden Strategien zur adjuvanten Therapie beim Neuroblastom nahe legt. / Induction and maintenance of tumor-protective immunity are the major goals of neuroblastoma immunotherapy. Enhancing the amount of tumor infiltrating leukocytes might be a way to achieve these goals since they may be associated with residual evidence of the ineffective immune response. Fractalkine is a unique TH1 CX3C chemokine known to induce both adhesion and migration of leukocytes mediated by a membrane-bound and a soluble form, respectively. Targeted IL-2 (ch14.18-IL-2) was constructed by anti-GD2 antibody fused with IL-2 so that IL-2 can be directed into the microenvironment of neuroblastoma tumor. Here, I tested the hypothesis that chemokine gene therapy with fractalkine (FKN) induces an effective anti-neuroblastoma immune response amplified by targeted IL-2. NXS2 cells were engineered to stably produce murine FKN (NXS2-FKN). Transcrip- tion and expression of the mFKN gene in NXS2-FKN cells and tumor tissue were demonstrated. The chemotactic activity of FKN expressed by NXS2 cells was determined both in vitro and in vivo. Importantly, NXS2-FKN exhibited a reduction in primary tumor growth, which was boosted by targeted IL-2 using non-curative doses of ch14.18-IL-2. Furthermore, experimental liver metastases were completely eradicated in mice receiving the combination therapy, demonstrating the induction of a long-lived tumor protective response. The mechanisms involved in antitumor response included effective T cell activation as indicated by the up-regulation of T-cell activation markers (CD69, CD25) and proinflammatory cytokines (TNF-alpha, INF-gamma) as well as the enhancement of tumor specific CTL activity. The depletion of CD4+ and CD8+ T cells in vivo abrogated the therapeutic effect supporting the crucial role of T cells in this immunotherapeutic approach. In summary, I demonstrated for the first time that chemokine gene therapy with FKN is amplified by targeted IL-2 suggesting a combination of both strategies as an adjuvant therapy for neuroblastoma.

Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung von Tumor-assozierten T-Zellepitopen (TATE) in kutanen T-Zelllymphomen (CTCL) und die Charakterisierung der Tumour-spezifischen zytotoxischen Immunabwehr. Zwei Tumor-spezifische T-Zellklone wurden aus den Tumor-infiltrierenden Lymphozyten (TIL) eines CTCL-Patienten etabliert. Die potentiellen natürlichen T-Zellepitope und Mimotope (synthetische Epitope ohne natürliche Korrelate aber mit meist hohen T-Zellaktivitäten) für diese Klone wurden mit einer kombinatorischen Peptidbibliothek identifiziert. Die Qualität und Quantität der T-Zellaktivitäten waren bei den jeweiligen Peptiden unterschiedlich. Die funktionellen Aviditäten varierten dabei um 3 Größenordnungen. Bei den einzelnen Peptiden korrelierte die Zytolyse und Zytokinsekretion nicht immer. Mit einigen Mimotopen wurden CTCL-Patienten für therapeutische Zwecke vakziniert. Die Frequenzen der Mimotop-spezifischen T-Zellen erhöhten sich während der ersten Vakzinationszyklen und tumorizide Aktivitäten konnten nachgewiesen werden. Diese ersten klinischen Anwendungen der Mimotope zeigen die Möglichkeit solcher Mimotope die sonst unzureichende Immunabwehr zu modulieren. Die Identifizierung neuer TATE ermöglichte die weitere Untersuchung der Tumor-spezifischen T-Zellen in der Peripherie und im Tumor des Patienten. Diese Analysen zeigten, dass diese Zellen im peripheren Blut aktiv aber im Tumor inaktiv waren. Die TILs waren vom effektor-memory Phänotyp expremierten aber nur schwach oder z. T. keine der Moleküle mit Effektorfunktion. Das immunsuppressive Zytokin TGF-beta könnte eine wichtige Rolle bei dieser unzureichenden Immunabwehr bei CTCL spielen. / The major goals of this work was the identification of tumour-associated T cell epitopes (TATE) in cutaneous T cell lymphoma (CTCL) and the characterisation of the tumour-specific cytolytic immune response. Two tumour-specific cytolytic T cell clones were established from the tumour-infiltrating lymphocytes (TIL) of one CTCL-patient. The potential natural T cell epitopes and mimotopes (epitopes without natural correlates but with more T cell stimulating capacity) for these T cell clones were identified using a combinatorial peptide library. The quantity and quality of the T cell response was different. The functional avidity of the peptides differed more than 3 orders of magnitude. The cytolysis and cytokine release did not correlate for each peptide. Some of the mimotopes were injected into CTCL-patients for therapeutic purpose. The frequency of the mimotope-specific T cell increased during the first vaccination cycles and a tumouricidal capacity could be observed. This first clinical application of the mimotopes showed the capacity of the mimotopes for the modulation of weak anti-tumour immune response. The identification of the new TATE allowed further characterisation of the tumour-specific T cells in the periphery and in the tumour of the patient. High frequency of the tumour-specific T cells could be detected in the tumour but they failed to show effector functions in comparison to the tumour-specific T cells in the peripheral blood. The tumour-specific T cells had the effector memory phenotype but expressed none or less amount of the cytolytic effector molecules. The reason for the suboptimal anti-tumour response in CTCL could be the immunesuppressive cytokine TGF-beta.

Die spezifische adoptive Immuntherapie ist ein hoffnungsvoller Ansatz zur Behandlung von Tumoren. Die aufwendige individuelle Bereitstellung primärer Effektorlymphozyten könnte durch den Einsatz etablierter tumorantigenspezifischer Effektorzellinien vermieden werden. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob sich ein Tumortargeting der humanen Natürlichen Killer-(NK)-Zellinie YT durch den Gentransfer chimärer Immunglobulin-T-Zellrezeptoren (cIgTCRs) erreichen läßt. Die cIgTCR-Konstrukte wurden aus single-chain-Fv-Fragmenten (scFv), dem IgG1-Fc-Teil und der CD3-Zeta-Signalkette erzeugt. Die scFv-Fragmente wurden aus den humanisierten Antikörpern BW431/26 und HuM195, die spezifisch für das karzinoembryonale Antigen (CEA) bzw. CD33 sind, konstruiert und zeigten als scFv-hFc-Fusionsproteine eine spezifische Bindung an Tumorzellen. Die YT-Zellen wurden mit den cIgTCR-Genkonstrukten über Elektroporation transfiziert und über immunologische Verfahren angereichert. In-vitro-Studien ergaben eine spezifische Lyse von CEA+ Kolonkarzinomzellinien durch die scBW431/26-hFcZeta+ YT-Zellen. Die Zytotoxizität korrelierte mit der Expression des cIgTCR-Antigens auf den Tumorzellen und wurde durch zirkulierendes CEA nicht gehemmt. Die scHuM195-hFcZeta+ YT-Zellen zeigten eine spezifische Lyse der CD33+ myeloischen Leukämiezellinie KG1. Die Bestrahlung wurde zur Wachstumsbegrenzung der YT-Zellen eingesetzt. Die spezifische Zytotoxizität der scBW431/26-hFcZeta+ YT-Zellen gegenüber CEA+ Tumorzellen war einen Tag nach Bestrahlung unverändert. Die Koinjektion von CEA+ Tumorzellen mit bestrahlten scBW431/26-hFcZeta+ YT-Zellen führte zu einer signifikanten Hemmung des Tumorwachstums in NOD/SCID-Mäusen. Die cIgTCR+ YT-Zellen zeigten in vitro eine geringe Sensibilität gegenüber allogenen Blutlymphozyten. Die Ergebnisse zeigen, daß die Zytotoxizität der NK-Zellinie YT tumorantigenspezifisch durch cIgTCR-Gentransfer erweitert wird und ein Potential zur Behandlung minimaler Tumorerkrankungen besteht. / The specific adoptive immunotherapy is a promising strategy for cancer treatment. The utilization of established tumor antigen specific effector cell lines could bypass the expendable individual preparation and often limited specificity of primary effector lymphocytes. This study investigated the tumor targeting of the human Natural Killer (NK) cell line YT by gene transfer of chimeric immunoglobulin T cell receptors (cIgTCRs). The cIgTCR constructs were generated of single chain antibody fragments (scFv), the IgG1 Fc part and the CD3 Zeta chain. The scFv fragments were constructed of the humanized antibodies BW431/26 and HuM195 with specificity for the carcinoembryonic antigen (CEA) and CD33, respectively, and showed as scFv-Fc fusion proteins a specific binding to tumor cells. YT cells were transfected with the cIgTCR gene constructs by electroporation and enriched by immunological cell separation. In vitro studies revealed a specific lysis of CEA+ colon carcinoma cell lines by scBW431/26-hFcZeta+ YT cells. The cytotoxicity correlated with the expression of the cIgTCR antigen on the tumor cells and was not inhibited in the presence of soluble CEA. The scHuM195-hFcZeta+ YT cells mediated a specific lysis of the CD33+ myeloic leukemia cell line KG1. The irradiation was used to limit the growth of the YT cell line. The specific cytotoxicity of the scBW431/26-hFcZeta+ YT cells against CEA+ tumor cells was unaltered one day after irradiation. The coinjection of CEA+ tumor cells and irradiated scBW431/26-hFcZeta+ YT cells led to a significant growth inhibition in NOD/SCID mice. The cIgTCR+ YT cells showed a low susceptibility to the cytotoxicity of allogeneic blood lymphocytes in vitro. The results demonstrated that the cytotoxicity of the human NK cell line YT can be specifically extended to tumor antigens by cIgTCR gene transfer. The employment of receptor gene modified YT cells could be a useful tool for the adoptive immunotherapy of minimal tumor diseases.

H-REV107-1 wird in normalen Geweben ubiquitär exprimiert, während die Expression in humanen Mamma-, Ovarial-, und Lungentumoren unterdrückt ist. H-REV107-1 hemmt das Tumorwachstum in vitro und in vivo. Die Expression und Regulation des H-REV107-1 Gens wurde in verschiedenen, humanen Zelllinien untersucht. In Tumor Zelllinien wird die H-REV107-1 Expression durch IFNgamma induziert Eine Korrelation der H-REV107-1 und der IRF1 Expression nach Induktion mit IFNgamma wurde gezeigt. H-rev107-1 konnte nach konditionaler IRF1 Expression, Proteinsynthese-unabhängig, nachgewiesen werden und ist ein direktes Zielgen von IRF1. Die H-rev107-1 Expression ließ sich durch Unterdrückung des MEK/ERK Signalwegs mit dem MEK1 Inhibitor PD98059 aktivieren. Dies bedeutet, dass H-REV107-1 durch mindestens zwei verschiedene Signalwege, IFNgamma und MEK/ERK, reguliert wird. Der in vitro amplifizierte H-REV107-1 Promoter enthält keine TATA-Box, sondern ein Initiator Element sowie, in dem für eine TATA-Box definierten Abstand, eine ATF2 Bindungsstelle. Die Inkubation von transient transfizierten Zellen mit TNF alpha, cAMP und IFN gamma steigerte die Luciferase Aktivität. Mit Hilfe von Deletions- und Mutationskonstrukten wurden die regulatorischen Bereiche des Promoters bestimmt. Eine Mutation der cRel-Bindungsstelle, potentiell über NFkappaB reguliert, resultierte in einer Luciferase Aktivität von nur 9% des Wildtyp Promoters. Die Mutation der CREB/ATF2 Bindungsstelle reduzierte die Luciferase Aktivität auf 37%. Die Ko-Transfektion eines NFkappaB Suppressor reduzierte die Luciferase Aktivität um 53%. Diese Ergebnisse legen nahe, dass NFkappaB und ATF2 die H-REV107-1 Expression positiv regulieren. In einem EMSA wurde die Bindung von ATF2 an die CREB/ATF-2 Bindungsstelle gezeigt. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass H-REV107-1 durch eine IFNgamma induzierte, möglicherweise PKR vermittelte, Signalkette von den Faktoren IRF1 und ATF2 direkt, sowie von NFkappaB indirekt, reguliert wird. / The H-REV107-1 class II tumor suppressor gene is ubiquitously expressed in normal tissues and down regulated in human breast, ovarian and lung tumors. H-REV107-1 has the capacity to suppress growth of tumor cells in vitro and in vivo. H-REV107-1 is up regulated after treatment with IFN gamma. A NIH3T3 cell line harboring an estrogen inducible IRF.1/hER fusion protein showed a protein synthesis independent up regulation of H-rev107-1 expression after induction of IRF-1. H-rev107-1 is a direct target of IRF-1. Inhibition of the MEK/ERK pathway, using the MEK1 inhibitor PD 98059, leads to a restored expression of H-rev107-1. Therefore, H-REV107-1 can be a target of the MEK/ERK-pathway. Thus, H-REV107-1 is regulated by at least two different pathways. To understand the regulatory mechanisms of the expression of the H-REV107-1 gene, the putative promoter region was analyzed in silico. The sequence was amplified and cloned. Induction of the promoter constructs with TNF alpha, cAMP and IFN gamma increased the luciferase activity. Several deletions constructs and constructs with putative transcription factor binding sites mutated were used to narrow down the important regulatory elements of the promoter. The mutations of a cRel binding site and a CREB/ATF-2 binding site decreased the luciferase activity by 91% and 63%, respectively. Co transfection of the full length promoter construct with a repressor of NFkappaB activation, reduced the luciferase activity to 47%. As a result of the investigation H-REV107-1 is directly regulated by IRF-1 and probably indirectly regulated by NFkappaB and the MEK/ERK signaling pathway. In an Electro Mobility Shift Assay (EMSA), the binding of ATF-2 to the CREB oligonucleotid was demonstrated by the use of a specific antibody. The ATF.2 binding site in the posititon –30 bp - 23 bp of the human, TATA-less H-REV107-1 promoter replaces the TATA-like element, which can be found in the H-rev107-1 promoter of rat and mouse.