The respiratory system is amongst the most important compartments in the human body. Due to its connection to the external environment, it is one of the most common portals of pathogen entry. Airborne pathogens like measles virus (MV) carried in liquid droplets exhaled from the infected individuals via a cough or sneeze enter the body from the upper respiratory tract and travel down to the lower respiratory tract and reach the alveoli. There, pathogens are captured by the resident dendritic cells (DCs) or macrophages and brought to the lymph node where immune responses or, as in case of MV, dissemination via the hematopoietic cell compartment are initiated. Basic mechanisms governing MV exit from the respiratory tract, especially virus transmission from infected immune cells to the epithelial cells have not been fully addressed before. Considering the importance of these factors in the viral spread, a complex close-to-in-vivo 3D human respiratory tract model was generated. This model was established using de-cellularized porcine intestine tissue as a biological scaffold and H358 cells as targets for infection. The scaffold was embedded with fibroblast cells, and later on, an endothelial cell layer seeded at the basolateral side. This provided an environment resembling the respiratory tract where MV infected DCs had to transmigrate through the collagen scaffold and transmit the virus to epithelial cells in a Nectin-4 dependent manner. For viral transmission, the access of infected DCs to the recipient epithelial cells is an essential prerequisite and therefore, this important factor which is reflected by cell migration was analyzed in this 3D system. The enhanced motility of specifically MV-infected DCs in the 3D models was observed, which occurred independently of factors released from the other cell types in the models. Enhanced motility of infected DCs in 3D collagen matrices suggested infection-induced cytoskeletal remodeling, as also verified by detection of cytoskeletal polarization, uropod formation. This enforced migration was sensitive to ROCK inhibition revealing that MV infection induces an amoeboid migration mode in DCs. In support of this, the formation of podosome structures and filopodia, as well as their activity, were reduced in infected DCs and retained in their uninfected siblings. Differential migration modes of uninfected and infected DCs did not cause differential maturation, which was found to be identical for both populations. As an underlying mechanism driving this enforced migration, the role of sphingosine kinase (SphK) and sphingosine-1-phosphate (S1P) was studied in MV-exposed cultures. It was shown in this thesis that MV-infection increased S1P production, and this was identified as a contributing factor as inhibition sphingosine kinase activity abolished enforced migration of MV-infected DCs. These findings revealed that MV infection induces a fast push-and-squeeze amoeboid mode of migration, which is supported by SphK/S1P axis. However, this push-and-squeeze amoeboid migration mode did not prevent the transendothelial migration of MV-infected DCs. Altogether, this 3D system has been proven to be a suitable model to study specific parameters of mechanisms involved in infections in an in vivo-like conditions. / Die respiratorische System ist ein wesentlicher physiologischer Bestandteil. Durch die direkte und konstante Verbindung der Atemwege mit der äußeren Umgebung sind sie einer der häufigsten Pfade für den Eintritt von Krankheitserregern in den Körper. Luftübertragene Krankheitserreger wie das Masern-Virus (MV), das in Flüssigkeitströpfchen mitgeführt und von Patienten durch Husten oder Niesen ausgeatmet wird, können über die oberen Atemwege in den Körper gelangen und sich bis in die unteren Atemwege und bis zu den Alveolen ausbreiten. Dort werden diese Krankheitserreger von den dort residenten dendritischen Zellen (DC) oder Makrophagen erworben und zu sekundären lymphatischen Organen transportiert, in denen sowohl virus-spezifische Immunantworten, aber auch – wie im Falle von MV – die hämatogene Dissemination initiiert wird. Der Austrittsmechanismus des MV aus den Atemwegen, insbesondere dessen Übertragung von infizierten Immunzellen auf die Epithelzellen und die Faktoren, die diesen Ablauf bestimmen, wurden jedoch bisher unzureichend untersucht. In Anbetracht der Bedeutung dieser Faktoren für die Virusausbreitung wurde ein komplexes, realitätsnahes in-vivo 3D-Modell der menschlichen Atemwege erstellt. Dieses Modell wurde unter Verwendung von de-zellularisiertem Schweinedarmgewebe als biologischem Gerüst und H358 Epithelzellen als Empfänger etabliert. Dieses Grundgerüst wurde mit Fibroblastenzellen eingebettet. Später wurde auf der basolateralen Seite der Modelle eine Endothelzellschicht eingebracht, um eine Umgebung zu schaffen, die der der Atemwege ähnelt. Somit mussten die Virus-Donoren, MV-infizierte DC durch das Kollagengerüst wandern und das Virus auf Epithelzellen in einer Nektin-4 abhängigen Weise übertragen. Für die Virusübertragung ist der Zugang infizierter DC zu den Empfänger-Epithelzellen eine wesentliche Voraussetzung, weshalb dieser wichtige Faktor, der sich in der Zellmigration widerspiegelt, in diesem 3D-System analysiert wurde. Eine erhöhte Beweglichkeit spezifisch MV-infizierter DCs wurde in den 3D-Modellen beobachtet. Dies erwies sich als unabhängig von löslichen Faktoren der anderen Zelltypen in den Modellen. Erhöhte Beweglichkeit infizierten DCs wurde auch in 3D-Kollagenmatrizes gesehen, was auf einen infektionsvermittelten zytoskelettalen Umbau hindeutete, der auch anhand von Zytoskelettpolarisation und Uropodbildung bestätigt wurde. Die MV-Infektion induzierte einen schnellen amöboiden Migrationsmodus in den DCs, der sich als sensitiv gegenüber ROCK-Hemmung erwies. Im Gegensatz zu uninfizierten DCs gleichen Reifungsstadiums waren in infizierten DCs Podosomenstrukturen und Filopodien sowie deren Aktivität stark reduziert. Als potentiell zur verstärkten Motilität infizierter DCs beitragender Faktor wurde die Rolle der Sphingosinkinase (SphK) und des Sphingosin-1-phosphats (S1P) in MV-exponierten Kulturen untersucht. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die S1P-Produktion durch eine MV-Infektion erhöht wurde, und in der Tat zur für infizierte DCs beobachteten erhöhten Geschwindigkeit beitrug, da diese sensitiv gegenüber Hemmung der Sphingosinkinase-Aktivität war. Diese Ergebnisse zeigen, dass die MV-Infektion einen schnellen amöboid-artigen Migrationsmodus induziert, der von der SphK/S1P-Achse unterstützt wird. Dieser Push-and-Squeeze-Amoeboid-Migrationsmodus verhinderte jedoch nicht die transendotheliale Migration von MV-infizierten DCs. Insgesamt hat sich dieses 3D-System als geeignetes Modell erwiesen, um die spezifische Parameter von Mechanismen von Infektionen in einem in-vivo-ähnlichen Zustand zu untersuchen.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, ein Vektorsystem zu entwickeln, dass den simultanen Transfer verschiedener Transgene in CD8+ und CD4+ T-Zellen und dadurch die Herstellung eines immunotherapeutischen T-Zell-Produkts ermöglicht, welches aus zwei unterschiedlich modifizierten T-Zell-Subtypen besteht. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Targeting-Technologie von lentiviralen auf γ-retrovirale Vektoren übertragen. Anschließend wird die Herstellung von Vektoren beschrieben, die spezifisch für murines CD4 oder CD8 sind. Deren Spezifität wurde zum einen durch die exklusive Expression von GFP in CD4+ oder CD8+ Zellen und zum anderen durch den Dosis-abhängigen Verlust des GFP-Signals nach Inkubation dieser Zellen mit CD4- und CD8-blockierenden Antikörpern nachgewiesen. Im dritten Teil der Arbeit wird gezeigt, dass MVm8 und MVm4 primäre T-Zellen spezifisch transduzieren. MVm8-vermittelter Transfer des Ovalbumin (OVA)-reaktiven TZRs OT-I führte zu T-Zellen, die OVA+ Tumor-Zelllinien erkannten und Interferon-γ sezernierten. Der vierte Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der in vivo Transduktion primärer T-Zellen mithilfe von MVm8, welches den OT-I-TZR und eine Luciferase transferiert (MVm8/OT-I-luc). Durch systemische Applikation von MVm8/OT-I-luc wurden T-Zellen in vivo transduziert. Durch Immunisierungen konnten antigen-spezifisches Homing, Expansion und eine anschließende Kontraktion in vivo transduzierter T-Zellen gezeigt werden. Mäuse mit starker OT-I-luc-Expression waren gegenüber einer Infektion durch OVA-transgene listeria monocytogenes geschützt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das in dieser Arbeit entwickelte Vektorsystem in der Lage ist zwischen Subtypen von T-Zellen zu unterscheiden und sie simultan mit unterschiedlichen Transgenen auszustatten. Für MVm8 konnte gezeigt werden, dass es T-Zellen direkt in vivo transduzieren kann. / The aim of this thesis was to generate a vector system that allows the simultaneous transfer of different transgenes into CD8+ and CD4+ T cells, allowing the generation of a immunotherapeutic T cell product comprised of two differently engineered T cell subsets. The first part of the thesis describes the transfer of the measles virus (MV) envelope-based targeting technology from lentiviral (LV) to γ-retroviral (gRV) vectors. The second part reports the generation of two targeting vectors specific for murine CD4 or CD8. The exclusive specificity of MVm4 and MVm8 was proven by expression of GFP in CD4+ and CD8+ reporter cells, respectively, but not in CD4-CD8- cells after transduction, and by a dose-dependent loss of GFP signal after incubation of reporter cells with CD4 or CD8 blocking antibodies before transduction. The third part shows that MVm8 but not MVm4 transduced primary T cells. MVm8-mediated transfer of the ovalbumin (OVA)-reactive TCR OT-I resulted in T cells secreting interferon-γ (IFNγ) upon recognition of OVA+ tumor cell lines. The final part of this thesis describes the in vivo transduction of primary T cells using MVm8 transferring OT-I and a luciferase (MVm8/OT-I-luc). To this end, B6 mice deficient for Rag2 have been repopulated with either polyclonal (B6) or monoclonal T cells derived from P14-TCR transgenic mice (P14). One day later the transferred T cells were transduced in vivo by systemic application of MVm8/OT-I-luc. Upon immunization in vivo-transduced T cells homed, expanded and contracted repeatedly in an antigen-dependent manner. Finally, mice exhibiting strong luc-signals showed improved protection against infections by OVA-transgenic listeria monocytogenes (LM-OVA). In conclusion, the viral vector system developed within this thesis is able to discriminate between the two main T cell subsets and to equip them with distinct transgenes simultaneously.