Introdução: Dentre as diversas formas modificadas da lipoproteína de baixa densidade (LDL), a LDL eletronegativa, LDL (-), contribui para o processo aterosclerótico, promovendo o recrutamento leucocitário para a intima arterial e modulando a resposta inflamatória. Mimotopos são moléculas que podem se ligar à porção variável de um anticorpo, a enzimas ou a receptores. Os peptídeos mimotopos da LDL (-) são moléculas capazes de mimetizar a conformação de epítopos expostos apenas quando a LDL sofre modificações in vivo. Objetivo: Avaliar os efeitos de peptídeos mimotopos da LDL(-), previamente selecionados pela técnica de phage display e denominados p1A3 e p2C7, em células endoteliais e macrófagos. Metodologia: Avaliou-se a atividade dos peptídeos mimotopos sobre a expressão de RNAm de genes relacionados tanto à ativação quanto à disfunção endotelial, assim como a atividade citotóxica e a captação dos peptídeos por células endoteliais (HUVEC, HAEC e EA.Hy 926). Verificou-se também a atividade pró-inflamatória dos peptídeos em cultura primária de macrófagos murinos derivados da medula óssea (BMDM), investigando-se a ativação do complexo proteico inflamassoma, assim como a internalização dos peptídeos por essas células, utilizando citometria de fluxo e microscopia confocal. Resultados: As células endoteliais e os macrófagos internalizaram os peptídeos mimotopos p1A3 e p2C7. Nos macrófagos houve inibição (50%) da internalização dos peptídeos p1A3 e p2C7 na presença de brefeldina A, indicando que esses peptídeos são majoritariamente captados por endocitose independente de clatrina. Nas células HAEC, observou-se 25% de inibição da captação de ambos os peptídeos se bloqueando o receptor scavenger LOX-1 com anticorpo anti-LOX-1. Quanto à atividade citotóxica, observou-se acentuada redução na atividade mitocondrial das células endoteliais EA.Hy 926 e HAEC apenas com o peptídeo p1A3, não sendo observada citotoxicidade para os macrófagos tanto para p1A3 quanto p2C7 nas concentrações estudadas (12,5 a 200 ug/mL). Nos macrófagos, o peptídeo p2C7 induziu o aumento da expressão de RNAm de genes relacionados com a polarização para o fenótipo M1 (iNOS, TNF-α, IL-1α) e da produção de •NO, assim como, a ativação do sinal 1 (transcricional) do complexo proteico inflamassoma, o que também se observou para a LDL (-). O peptídeo p1A3 modulou a expressão gênica da linhagem HAEC, diminuindo a expressão de RNAm dos genes relacionados à proliferação celular (VEGFr1 e 2, TGFβ, PDGFβ e eNOS). Conclusão: Os peptídeos mimotopos p1A3 e p2C7 interagem com as células endoteliais e macrófagos de maneiras distintas. O p2C7 induz uma resposta pró-inflamatória em macrófagos, mimetizando a LDL (-), sugerindo assim, que esse peptídeo possa atuar como um DAMP (padrão molecular associado ao perigo) importante para o processo inflamatório da placa aterosclerótica. / Introduction: Among the different subtypes of modified low-density lipoprotein (LDL), the electronegative LDL [LDL (-)] contributes to the progression of atherosclerosis, promoting leukocyte recruitment into the arterial intima and modulating the inflammatory response. Mimotopes are molecules capable of binding to the variable portion of an antibody, to enzymes or receptors. The mimotope peptides of LDL (-) are molecules mimicking the conformation of epitopes exposed only when LDL undergoes in vivo changes. Objective: To evaluate the effects of two mimotope peptides of LDL (-), previously selected the by phage display and called p1A3 and p2C7, on endothelial cells and macrophages. Methodology: We evaluated the activity of the mimotope peptides on gene mRNA expression related to both the activation and endothelial dysfunction as well as the cytotoxic activity and uptake of peptides by endothelial cells (HUVEC, HAEC and EA.Hy 926). It was also investigated the pro-inflammatory activity of the peptides on murine primary macrophage derived from bone marrow (BMDM), evaluating the activation of the protein complex inflammasome, as well as the internalization of peptides by these cells by flow cytometry and confocal microscopy. Results: The endothelial cells and macrophages internalized both peptides. In macrophages, brefeldin A inhibited the internalization of p1A3 and p2C7 around 50%, indicating that these peptides are mostly taken up by clathrin-independent bulk endocytosis. In HAEC it was observed a 25 % inhibition of the uptake of both peptides by blocking the LOX scavenger receptor with an anti-LOX-1 antibody. In relation to cytotoxicity, a reduction on mitochondrial activity was induced by p1A3 peptide only in endothelial cells (EA.Hy 926 and HAEC). No cytotoxic activity was observed for p2C7 peptide in macrophages or endothelial cells at the studied concentration range (12.5 to 200 µg/mL). In macrophages, the p2C7 peptide increased mRNA expression of genes related to the polarization to M1 phenotype (iNOS, TNF-α and IL-1α) and of •NO production, as well as, protein complex signal 1 activation (transcriptional) what was also observed for LDL (-). The p1A3 peptide modulated the expression of genes related with cell proliferation (VEGFr1 e 2, TGF?β, PDGFβ and eNOS) in HAEC. Conclusion: The mimotope peptides p2C7 and p1A3 interact with the endothelial cells and macrophages by different ways. The p2C7 induces a pro-inflammatory response in macrophages, mimicking LDL (-), thus suggesting that this peptide can act as a DAMP (Damage-associated molecular pattern) important in the inflammatory process of atherosclerotic plaque.

abstract: The advent of new high throughput technology allows for increasingly detailed characterization of the immune system in healthy, disease, and age states. The immune system is composed of two main branches: the innate and adaptive immune system, though the border between these two states is appearing less distinct. The adaptive immune system is further split into two main categories: humoral and cellular immunity. The humoral immune response produces antibodies against specific targets, and these antibodies can be used to learn about disease and normal states. In this document, I use antibodies to characterize the immune system in two ways: 1. I determine the Antibody Status (AbStat) from the data collected from applying sera to an array of non-natural sequence peptides, and demonstrate that this AbStat measure can distinguish between disease, normal, and aged samples as well as produce a single AbStat number for each sample; 2. I search for antigens for use in a cancer vaccine, and this search results in several candidates as well as a new hypothesis. Antibodies provide us with a powerful tool for characterizing the immune system, and this natural tool combined with emerging technologies allows us to learn more about healthy and disease states. / Dissertation/Thesis / Ph.D. Biological Design 2014

Introdução: Dentre as diversas formas modificadas da lipoproteína de baixa densidade (LDL), a LDL eletronegativa, LDL (-), contribui para o processo aterosclerótico, promovendo o recrutamento leucocitário para a intima arterial e modulando a resposta inflamatória. Mimotopos são moléculas que podem se ligar à porção variável de um anticorpo, a enzimas ou a receptores. Os peptídeos mimotopos da LDL (-) são moléculas capazes de mimetizar a conformação de epítopos expostos apenas quando a LDL sofre modificações in vivo. Objetivo: Avaliar os efeitos de peptídeos mimotopos da LDL(-), previamente selecionados pela técnica de phage display e denominados p1A3 e p2C7, em células endoteliais e macrófagos. Metodologia: Avaliou-se a atividade dos peptídeos mimotopos sobre a expressão de RNAm de genes relacionados tanto à ativação quanto à disfunção endotelial, assim como a atividade citotóxica e a captação dos peptídeos por células endoteliais (HUVEC, HAEC e EA.Hy 926). Verificou-se também a atividade pró-inflamatória dos peptídeos em cultura primária de macrófagos murinos derivados da medula óssea (BMDM), investigando-se a ativação do complexo proteico inflamassoma, assim como a internalização dos peptídeos por essas células, utilizando citometria de fluxo e microscopia confocal. Resultados: As células endoteliais e os macrófagos internalizaram os peptídeos mimotopos p1A3 e p2C7. Nos macrófagos houve inibição (50%) da internalização dos peptídeos p1A3 e p2C7 na presença de brefeldina A, indicando que esses peptídeos são majoritariamente captados por endocitose independente de clatrina. Nas células HAEC, observou-se 25% de inibição da captação de ambos os peptídeos se bloqueando o receptor scavenger LOX-1 com anticorpo anti-LOX-1. Quanto à atividade citotóxica, observou-se acentuada redução na atividade mitocondrial das células endoteliais EA.Hy 926 e HAEC apenas com o peptídeo p1A3, não sendo observada citotoxicidade para os macrófagos tanto para p1A3 quanto p2C7 nas concentrações estudadas (12,5 a 200 ug/mL). Nos macrófagos, o peptídeo p2C7 induziu o aumento da expressão de RNAm de genes relacionados com a polarização para o fenótipo M1 (iNOS, TNF-α, IL-1α) e da produção de •NO, assim como, a ativação do sinal 1 (transcricional) do complexo proteico inflamassoma, o que também se observou para a LDL (-). O peptídeo p1A3 modulou a expressão gênica da linhagem HAEC, diminuindo a expressão de RNAm dos genes relacionados à proliferação celular (VEGFr1 e 2, TGFβ, PDGFβ e eNOS). Conclusão: Os peptídeos mimotopos p1A3 e p2C7 interagem com as células endoteliais e macrófagos de maneiras distintas. O p2C7 induz uma resposta pró-inflamatória em macrófagos, mimetizando a LDL (-), sugerindo assim, que esse peptídeo possa atuar como um DAMP (padrão molecular associado ao perigo) importante para o processo inflamatório da placa aterosclerótica. / Introduction: Among the different subtypes of modified low-density lipoprotein (LDL), the electronegative LDL [LDL (-)] contributes to the progression of atherosclerosis, promoting leukocyte recruitment into the arterial intima and modulating the inflammatory response. Mimotopes are molecules capable of binding to the variable portion of an antibody, to enzymes or receptors. The mimotope peptides of LDL (-) are molecules mimicking the conformation of epitopes exposed only when LDL undergoes in vivo changes. Objective: To evaluate the effects of two mimotope peptides of LDL (-), previously selected the by phage display and called p1A3 and p2C7, on endothelial cells and macrophages. Methodology: We evaluated the activity of the mimotope peptides on gene mRNA expression related to both the activation and endothelial dysfunction as well as the cytotoxic activity and uptake of peptides by endothelial cells (HUVEC, HAEC and EA.Hy 926). It was also investigated the pro-inflammatory activity of the peptides on murine primary macrophage derived from bone marrow (BMDM), evaluating the activation of the protein complex inflammasome, as well as the internalization of peptides by these cells by flow cytometry and confocal microscopy. Results: The endothelial cells and macrophages internalized both peptides. In macrophages, brefeldin A inhibited the internalization of p1A3 and p2C7 around 50%, indicating that these peptides are mostly taken up by clathrin-independent bulk endocytosis. In HAEC it was observed a 25 % inhibition of the uptake of both peptides by blocking the LOX scavenger receptor with an anti-LOX-1 antibody. In relation to cytotoxicity, a reduction on mitochondrial activity was induced by p1A3 peptide only in endothelial cells (EA.Hy 926 and HAEC). No cytotoxic activity was observed for p2C7 peptide in macrophages or endothelial cells at the studied concentration range (12.5 to 200 µg/mL). In macrophages, the p2C7 peptide increased mRNA expression of genes related to the polarization to M1 phenotype (iNOS, TNF-α and IL-1α) and of •NO production, as well as, protein complex signal 1 activation (transcriptional) what was also observed for LDL (-). The p1A3 peptide modulated the expression of genes related with cell proliferation (VEGFr1 e 2, TGF?β, PDGFβ and eNOS) in HAEC. Conclusion: The mimotope peptides p2C7 and p1A3 interact with the endothelial cells and macrophages by different ways. The p2C7 induces a pro-inflammatory response in macrophages, mimicking LDL (-), thus suggesting that this peptide can act as a DAMP (Damage-associated molecular pattern) important in the inflammatory process of atherosclerotic plaque.

Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung von Tumor-assozierten T-Zellepitopen (TATE) in kutanen T-Zelllymphomen (CTCL) und die Charakterisierung der Tumour-spezifischen zytotoxischen Immunabwehr. Zwei Tumor-spezifische T-Zellklone wurden aus den Tumor-infiltrierenden Lymphozyten (TIL) eines CTCL-Patienten etabliert. Die potentiellen natürlichen T-Zellepitope und Mimotope (synthetische Epitope ohne natürliche Korrelate aber mit meist hohen T-Zellaktivitäten) für diese Klone wurden mit einer kombinatorischen Peptidbibliothek identifiziert. Die Qualität und Quantität der T-Zellaktivitäten waren bei den jeweiligen Peptiden unterschiedlich. Die funktionellen Aviditäten varierten dabei um 3 Größenordnungen. Bei den einzelnen Peptiden korrelierte die Zytolyse und Zytokinsekretion nicht immer. Mit einigen Mimotopen wurden CTCL-Patienten für therapeutische Zwecke vakziniert. Die Frequenzen der Mimotop-spezifischen T-Zellen erhöhten sich während der ersten Vakzinationszyklen und tumorizide Aktivitäten konnten nachgewiesen werden. Diese ersten klinischen Anwendungen der Mimotope zeigen die Möglichkeit solcher Mimotope die sonst unzureichende Immunabwehr zu modulieren. Die Identifizierung neuer TATE ermöglichte die weitere Untersuchung der Tumor-spezifischen T-Zellen in der Peripherie und im Tumor des Patienten. Diese Analysen zeigten, dass diese Zellen im peripheren Blut aktiv aber im Tumor inaktiv waren. Die TILs waren vom effektor-memory Phänotyp expremierten aber nur schwach oder z. T. keine der Moleküle mit Effektorfunktion. Das immunsuppressive Zytokin TGF-beta könnte eine wichtige Rolle bei dieser unzureichenden Immunabwehr bei CTCL spielen. / The major goals of this work was the identification of tumour-associated T cell epitopes (TATE) in cutaneous T cell lymphoma (CTCL) and the characterisation of the tumour-specific cytolytic immune response. Two tumour-specific cytolytic T cell clones were established from the tumour-infiltrating lymphocytes (TIL) of one CTCL-patient. The potential natural T cell epitopes and mimotopes (epitopes without natural correlates but with more T cell stimulating capacity) for these T cell clones were identified using a combinatorial peptide library. The quantity and quality of the T cell response was different. The functional avidity of the peptides differed more than 3 orders of magnitude. The cytolysis and cytokine release did not correlate for each peptide. Some of the mimotopes were injected into CTCL-patients for therapeutic purpose. The frequency of the mimotope-specific T cell increased during the first vaccination cycles and a tumouricidal capacity could be observed. This first clinical application of the mimotopes showed the capacity of the mimotopes for the modulation of weak anti-tumour immune response. The identification of the new TATE allowed further characterisation of the tumour-specific T cells in the periphery and in the tumour of the patient. High frequency of the tumour-specific T cells could be detected in the tumour but they failed to show effector functions in comparison to the tumour-specific T cells in the peripheral blood. The tumour-specific T cells had the effector memory phenotype but expressed none or less amount of the cytolytic effector molecules. The reason for the suboptimal anti-tumour response in CTCL could be the immunesuppressive cytokine TGF-beta.

A aterosclerose é caracterizada como uma doença imune-inflamatória crônica das artérias devido ao grande acúmulo de lipídios na íntima. Um dos fatores envolvidos na progressão da aterosclerose é a presença de uma subfração de partículas de lipoproteína de baixa densidade (LDL) com um grau mínimo de modificação, denominada LDL eletronegativa [LDL(-)], que possui propriedades pró-inflamatórias, apresenta maior retenção na íntima das artérias e maior tempo de permanência na circulação sanguínea, gerando respostas imuno-inflamatórias. Epítopos de anticorpos monoclonais importantes no reconhecimento das partículas de LDL(-) foram mapeados por phage display, gerando peptídeos mimotopos (P1A3 e P2C7) com potencial para acompanhamento da progressão da aterosclerose, sendo excelentes candidatos como radiotraçadores marcados com emissores de pósitrons para obtenção de imagens moleculares por tomografia por emissão de pósitrons (PET) associada à tomografia computadorizada (PET/CT). O peptídeo P1A3 foi radiomarcado com 64Cu através da complexação com o quelante DOTA, obtendo-se imagens por PET/CT da captação do peptídeo na região do arco aórtico de camundongos knockout para a apolipoproteína E (Apoe-/-) comparados com animais controle sem lesões ateroscleróticas. Antes da obtenção das imagens PET/CT, os peptídeos radiomarcados foram validados através de estudos de estabilidade e biodistribuição, acumulando-se rapidamente nos rins. Também foi sintetizado um nanocluster de ouro, marcado com 64Cu e funcionalizado com P1A3 em sua superfície, observando-se o maior direcionamento dos nanoclusters de ouro ligados ao P1A3 para a região das lesões ateroscleróticas do arco aórtico de camundongos Apoe-/-, comparado ao nanocluster controle. Os peptídeos P1A3 e P2C7 radiomarcados com 68Ga, foram também avaliados por imagens PET/CT em camundongos knockout para o gene do receptor da LDL (LDLr-/-) tratados ou não com dieta hipercolesterolêmica. As imagens PET/CT mostraram que os peptídeos marcados com 68Ga tiveram um aumento de captação na região do arco aórtico de camundongos LDLr-/- hipercolesterolêmicos em relação ao controle. Além disso, P2C7 foi radiomarcado com 99mTc e sua biodistribuição demonstrou uma relação maior de % atividade injetada (AI)/órgão da aorta/coração nos camundongos hipercolesterolêmicos, em concordância com a imagem obtida por SPECT (tomografia computadorizada por emissão de fóton único) que revelou maior captação no arco aórtico. / Atherosclerosis is characterized as a chronic immune-inflammatory disease of the large arteries due to the accumulation of lipids in the intima. One of the factors involved in the progression of atherosclerosis is the presence of a subfraction of low-density lipoprotein (LDL) particles with a minimum degree of modification, called electronegative LDL [LDL (-)], which has proinflammatory properties, retention in the intima of the arteries and longer residence time in the blood circulation, generating immune-inflammatory responses. Epitopes of monoclonal antibodies important for the recognition of LDL(-) particles were mapped by phage display, generating mimotope peptides (P1A3 and P2C7) with potential to monitor the progression of atherosclerosis. These peptides are excellent candidates as radiotracers labeled with positron emitters to obtain molecular images by positron emission tomography (PET) associated with computed tomography (PET/CT). The P1A3 peptide was radiolabeled with 64Cu by complexation with the DOTA chelator to obtain PET/CT images of the peptide uptake in the aortic arch of apoliprotein E knockout mice (Apoe-/-) compared to control animals without atherosclerotic lesions. Prior to PET/CT imaging, radiolabeled peptides were validated by stability and biodistribution studies that indicated rapid accumulation in the kidneys. It was also synthesized a gold nanocluster, labeled with 64Cu and functionalized with P1A3 on its surface, observing the greater targeting of gold nanoclusters bound to P1A3 in the region of the atherosclerotic lesions of the aortic arch of Apoe-/- mice, compared to control nanocluster. The P1A3 and P2C7 peptides radiolabeled with 68Ga were also evaluated by PET imaging in LDL receptor gene knockout mice (LDLr-/-) treated or not with a hypercholesterolemic diet. PET/CT images showed that the 68Ga-labeled peptides had increased uptake in aortic arch of LDLr-/- hypercholesterolemic mice in relation to the control. Furthermore, the biodistribution of 99mTc-radiolabeled P2C7 showed a higher %ID (injected dose)/organ ratio of aorta/heart in hypercholesterolemic mice that was in accordance to SPECT (single photon emission computed tomography) imaging showing its higher uptake in the aortic arch.