Made available in DSpace on 2014-06-12T23:03:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo8792_1.pdf: 504398 bytes, checksum: 789e0e6068ce84eaf5a4483a830172cb (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2004 / Verificou-se in vitro o índice de aderência e a atividade fagocítica de macrófagos peritoniais de ratos Wistar machos com 60 a 90 dias de vida, nutridos (LABINA) e desnutridos e recuperados (DBR) após a exposição à diatermia de ondas curtas pulsadas (DOCP) nas técnicas convencional em paralelo e Schliephake nas freqüências de 30Hz, 50Hz e 430Hz e ao campo magnético alternado em ultra baixa freqüência (60Hz). A desnutrição ocorreu durante o período de aleitamento havendo recuperação nutricional dos animais a partir do 21º dia de vida com ração LABINA. Os macrófagos dos animais nutridos apresentaram aumento significativo no índice de aderência celular na técnica de Schliephake, na técnica convencional (30Hz, 50Hz e 430Hz) e ao campo magnético alternado. À atividade fagocítica diminuiu significativamente na técnica de Schliephake na freqüência de 50Hz e nas freqüências de 30Hz, 50Hz e 430Hz na técnica convencional em paralelo. O CM de 60Hz também reduziu a atividade fagocitica. Os macrófagos dos animais desnutridos e recuperados apresentaram aumento significativo no índice de aderência celular apenas na técnica de Schliephake nas freqüências de 30Hz e 50Hz e ao campo magnético alternado. À atividade fagocítica diminuiu significativamente apenas na técnica de Schliephake na freqüência de 30Hz e 50Hz e ao campo magnético alternado. A DOCP que aumenta o índice de aderência e reduz a atividade fagocitica pode ter aplicações diretas em processos traumáticos agudos. Esses achados auxiliarão na escolha da modulação da DOCP durante o procedimento terapêutico, tendo em vista que esta forma de irradiação é largamente utilizada na Fisioterapia. A preocupação com a poluição eletromagnética ambiental é relevante a partir da constatação que campos magnéticos de 60Hz interferem em parâmetros funcionais das células de defesa

Submitted by Ramon Santana (ramon.souza@ufpe.br) on 2015-03-11T19:21:36Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE Natália Gomes de Morais.pdf: 3697171 bytes, checksum: 7270910fb7622716567ee3d66510cabf (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-11T19:21:36Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE Natália Gomes de Morais.pdf: 3697171 bytes, checksum: 7270910fb7622716567ee3d66510cabf (MD5) Previous issue date: 2014-10-24 / CAPES e CNPq / Agressões nutricionais, no período neonatal, interferem com a programação de mecanismos funcionais dos macrófagos, provocando alterações duradouras, detectáveis no organismo adulto mesmo após reposição nutricional. Sabe-se que a desnutrição e infecção por Staphylococcus aureus (S. aureus) multirresistentes estão associadas a altas taxas de mortalidade, porém poucas são as pesquisas que avaliam a sua interação. Em virtude disto, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da desnutrição neonatal sobre sinalização intracelular, função microbicida e viabilidade de macrófagos alveolares infectados, in vitro, com S. aureus meticilina sensível (MSSA) e meticilina resistente (MRSA). Metodologia: Ratos machos Wistar (n=48) foram divididos em dois grupos distintos: Nutrido (dieta com 17% de caseína) e Desnutrido (à dieta com 8% de caseína), seguidos de reposição nutricional. Aos 90-120 dias de vida, os animais foram submetidos a um procedimento cirúrgico de traqueostomia para coleta de macrófagos (MØ). Após o isolamento dos MØ, foram padronizados 4 sistemas: controle negativo, composto apenas por MØ em cultura; controle positivo, MØ adicionados a 10μL Lipopolissacarídeo (LPS); e dois sistemas teste, MØ mais S. aureus sensível e resistente a meticilina. As células foram incubadas por 24h à 37ºC, com atmosfera úmida e 5% de CO2. Transcorrido este período, foram realizados ensaios para análise da expressão gênica dos receptores TLR-2, TLR-4, NLRP-3, das enzimas iNOS e caspase-1, produção de radicais livres e viabilidade dos macrófagos infectados in vitro. Na análise estatística, utilizou-se teste t Student e análise de variância (ANOVA), admitindo-se p<0,05. O modelo de desnutrição neonatal adotado promoveu redução do crescimento ponderal dos animais, da expressão dos receptores TLR-2, TLR-4, NLRP3, das enzimas iNOS e caspase -1, do estresse nitrosativo e da taxa de macrófagos viáveis. Entretanto, a interação Staphylococcus aureus versus macrófagos promoveu maior expressão dos receptores, das enzimas analisadas e do ânion superóxido. Pode-se concluir que a desnutrição neonatal comprometeu a expressão dos receptores de reconhecimento padrão, produção de óxido nítrico e o percentual de células viáveis. Entretanto, a exacerbação da resposta oxidativa, do receptor NLRP3 e da enzima caspase-1, após infecção por MRSA, pode favorecer o surgimento de lesões teciduais que permitam a permanência e a disseminação destas bactérias. Desta forma, há um maior risco para aquisição de quadros inflamatórios desregulados em infecções por S. aureus multirresistentes em indivíduos desnutridos no período neonatal.

Submitted by Leonardo Freitas (leonardo.hfreitas@ufpe.br) on 2015-04-15T13:09:26Z No. of bitstreams: 2 Dissertação João Ricardo Camaroti.pdf: 1001054 bytes, checksum: a7d1c8398c5b57b1aabd98518b8861d2 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-15T13:09:26Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação João Ricardo Camaroti.pdf: 1001054 bytes, checksum: a7d1c8398c5b57b1aabd98518b8861d2 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013-03-14 / No intuito de analisar o efeito da administração in vitro de substâncias serotoninérgicas (SS) sobre a produção de óxido nítrico (PNO) e a viabilidade celular em macrófagos, foi realizado um estudo experimental com cultura de células da linhagem RAW 264.7, adquiridas no Banco de Células do Rio de Janeiro. As células foram cultivadas em meio de cultura em placas de 24 poços a 37C com 5% de CO2 em ar umidificado. As células foram tratadas com lipopolissacarídeo (LPS de E. coli, sorotipo 055B5) na presença de várias concentrações de SS. As SS incluíram: inibidores seletivos da recaptação da serotonina-ISRS (Fluoxetina-FLX, paroxetina-PRX e escitalopran-ESC); facilitador seletivo da recaptação de serotonina (Tianeptina-TNP); aminoácido precursor da serotonina (Triptofano-TRP); agonista do receptor 5-HT1B (CP-93,129). Após 24 h, o sobrenadante de cultura foi removido para mensuração da concentração de nitrito, um metabólito estável do NO, pela reação de Griess. A seguir, as células foram incubadas por 2h com MTT, a fim de que aquelas viáveis o convertessem em formazam, cuja concentração foi quantificada espectrofotometricamente a 540 nm. As respostas das células estimuladas com LPS e tratadas com as SS foram sempre comparadas as das células não tratadas com SS. A coincubação das células com FLX e PRX a 10-4 M reduziu de maneira drástica a PNO (0% em ambos), acontecimento explicado pela citotoxicidade (98,2% para FLX e 99,2% para PRX). FLX aumentou a PNO a 10-6 (22,53%) e 10-7 M (21,71%). O mesmo foi observado para ESC apenas a 10-4 M (49,9%), apesar de ter havido redução na viabilidade celular nesta concentração (22,6%). PRX reduziu a PNO a 10-5 M (22,98%). Da mesma forma, CP diminuiu a PNO a 10-7 M (22,18%). A administração de TNP não interferiu na PNO. Um aumento na PNO foi observado nas células tratadas com TRF a 10-6 (40,03%) e 10-8 M (33,39%). Este resultado parece ter sido independente do aumento na viabilidade celular (observado a 10-7 M [10%]). A viabilidade das células tratadas com FLX e PRX entre 10-5 e 10-8 M variou de 81 a 92,5% (para FLX) e de 78,8 a 104,6% (para PRX). Este efeito foi inversamente proporcional à dose. Em conclusão, os resultados do presente trabalho indicam que ISRS interferem na PNO por macrófagos de maneira heterogênea, estimulando ou deprimindo dependendo da dose. A redução da PNO por macrófagos parece estar associada ao receptor 5-HT1B. Triptofano apresenta atividade promotora da PNO em macrófagos, contudo não se sabe se por via relacionado ao metabolismo da serotonina.

Made available in DSpace on 2014-06-12T23:04:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2012 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Manipulações nutricionais em períodos críticos de desenvolvimento, que levam à desnutrição, promovem consequências negativas em longo prazo no funcionamento do sistema imunológico. O macrófago atua em diferentes momentos da resposta imune, participando tanto da resposta inata quanto da resposta imune adaptativa, contudo, ainda são poucos os estudos que se dedicam a esclarecer o comportamento desta célula em situações onde houve privação de nutrientes em períodos precoces da vida. Tais informações poderiam ajudar a esclarecer o comportamento do sistema imune submetido à privação nutricional bem como as possíveis consequências destas mudanças na homeostase de um organismo. No artigo Desnutrição pós-natal imediata altera a viabilidade e função dos macrófagos em ratos , o impacto da manipulação nutricional no período pós-natal imediato em macrófagos alveolares de ratos foi avaliado quanto à função, quantidade e viabilidade em animais adultos. Ratos foram amamentados por mães alimentadas com uma dieta purificada deficiente em proteínas ou por uma dieta multideficiente semelhante a consumido durante a década de 1960 pelas populações desnutridas no nordeste do Brasil, chamada de Dieta Básica Regional (DBR). Quando adultos foram avaliados quanto aos parâmetros hematológicos e suas células broncoalveolares foram examinadas quanto a funcionalidade e viabilidade. O presente estudo mostrou que não ocorreram modificações nos valores hematológicos das séries vermelha e branca, bem como não alterou o numero de células totais no lavado broncoalveolar. O estudo da cultura celular revelou que ambas, as manipulações da dieta indicaram diminuição da viabilidade e da função da célula. Este último foi indicado pela redução da capacidade do macrófago em produzir NO. Em conclusão, as manipulações dietéticas ocorrida do período pós-natal imediato geram alterações permanentes nos macrófagos de ratos na vida adulta. Novos estudos ajudarão a desvendar os mecanismos pelos quais a desnutrição em períodos críticos de desenvolvimento prejudica o equilíbrio do sistema imune. O entendimento aprofundado destes mecanismos poderá, quem sabe, no futuro, permitir a prevenção dos efeitos deletérios da má nutrição no início da vida, quer seja por meio de intervenção medicamentosa, nutricional ou com mudanças dos hábitos de vida

Indivíduos diabéticos apresentam incidência elevada de doenças infecciosas. Isto pode estar relacionado às alterações na capacidade da resposta destes indivíduos aos agentes agressores. Em animais diabéticos, algumas destas alterações já foram descritas, assim como sua reversão pela administração de insulina. Este hormônio regula o metabolismo celular, modulando a atividade de proteínas e mediadores inflamatórios envolvidos neste processo. Sabemos que o lipopolissacarídeo (LPS) estimula, em macrófagos alveolares (MA) de animais não-diabéticos, a liberação do fator de necrose tumoral (TNF)-&#945; e do óxido nítrico (NO). O pré-tratamento deste MA com insulina inibiu todos estes efeitos. Assim, neste projeto, avaliamos o papel da insulina em MA e macrófagos peritoneais (MP) de camundongos, tornados diabéticos pela indução com aloxana (60 mg/kg, i.v.). Uma suspensão contendo 1x106 células foi estimulada com LPS (100 ng/mL) na presença ou não de insulina (1mU/mL). Realizamos a evolução temporal (0,5; 1; 3; 6; 24 horas) para a dosagem de NO, TNF-&#945; e interleucina (IL)-10. Nos tempos de maior produção destas citocinas (0,5 e 3 horas), também quantificamos IL-6, interferon (IFN)-&#947; e IL-4. Nossos resultados mostram que a produção/liberação dos mediadores imunes por MA e MP estimulados por LPS, quando tratados simultaneamente com insulina, tiveram uma redução. Assim, a produção/liberação de NO foi reduzida durante 0,5; 1; 3; 6, 24 horas, em MA e em MP; a liberação de TNF-&#945; foi reduzida durante 0,5 hora, em MP; a liberação de IL-6 foi reduzida durante 3 horas, em MA, e 0,5 hora, em MP. Estes dados mostram que a insulina reduziu a liberação destes mediadores inflamatórios, tanto para os MA quanto para os MP, durante o estímulo com LPS, de animais diabéticos já nos primeiros minutos de estímulo com LPS, com um pico de redução, na maioria das vezes, em 3 horas. / Diabetic patients exhibit high incidence of infectious diseases, at least in part, by due impaired immune response against aggressive agents. Lipopolysaccharide (LPS) triggers the releasing of tumor necrosis factor (TNF)-alpha and nitric oxide (NO) by alveolar macrophages (AM) of non-diabetic animals. The pretreatment using insulin inhibited of these cytokine release. The aim in the present study was to evaluate the insulin role on releasing of cytokines by MA and peritoneal macrophages (MP) of diabetic mouse. Resident AM and MP from diabetic (alloxan 60 mg/kg, i.v.) male C57BL/6 mice (CEUA/FCF/USP-339) stimulated by LPS (100 ng/mL). Insulin (1 mU/mL) insulin treatment was simultaneously with stimulus by LPS. Cytokines were measured by ELISA, and NO by Griess reaction. We performed a time course (0,5; 1; 3; 6; 24 hours), and measured NO, TNF-alpha and interleukin (IL)-10. We also measured IL-6, interferon (IFN)-&#947;, and IL-4 in 0.5 and 3 hours. Results were evaluated by analysis of variance (ANOVA) followed by multiple comparison Tukey-Kramer or the nonparametric Kruskal-Wallis test. P value were considered when <0.05. Before the induction of diabetes by alloxan injection in day 0 animals showed: weight (26±0,3 g) and blood glucose concentration (164±2,6 mg/dL) - and 10 days after the onset of the disease, diabetic mice presented a lower weight gain (24 ± 0,4 g*) and elevated blood glucose concentration (546±9,7 mg/dL*). An increase was seen NO release levels and TNF-alpha in the time course (Figure 1); an increase of IL-6 in 3 hours (Figure 3), and a decrease of IL-4 in 3 hours (Figure 5) after LPS stimulation of MA in diabetic animals. In MP, there was an increase of NO levels, and TNF-alpha in the time course (Figure 2); in 3 hours increased IL-6 levels (Figure 4) - under the same conditions. Insulin treatment under stimulation by LPS in MA reduced the levels of NO, IL-6, and TNF-alpha compared to the group stimulated by LPS. Regarding MP, insulin treatment also decreased NO levels, TNF-alpha, and IL-6. IL-4 levels produced by MP, and IFN-&#947; levels were not be detected in MA and MP under stimulation by LPS, or in the presence of hormone. These findings suggest that insulin reduce the release of these inflammatory mediators by both resident macrophages of diabetic animals concomitantly stimulation by LPS

A Mycobacterium abscessus subspécie abscessus é um pesadelo quando envolvida em infecção pulmonar que são incuráveis, a despeito do uso de antimicrobianos com atividade in vitro, caso o tratamento não inclua a ressecção cirúrgica da área afetada. É a micobactéria patogência de crescimento rápido mais frequentemente isolada de culturas de sítios pulmonares. Há um número reduzido de opções terapêuticas para o tratamento dessas infecções, e é ainda mais reduzido o número de antimicrobianos que atingem concentrações terapêuticas no compartimento intracelular, em particular no fagossomo. O número limitado de antimicrobianos disponíveis para tratamento apontam a necessidade de determinação do perfil de susceptibilidade frente a antimicrobianos isolados e em combinação, nos compartimentos intra e extracelular. Os objetivos deste estudo foram avaliar: a sensibilidade de M. abscessus estruturadas em biofilmes e presentes no interior dos macrófagos; a ocorrência de sinergismo quando da associação entre fármacos, inibidores de betalactamase e o anti-inflamatório. As combinações entre os antimicrobianos foram apenas indiferente quanto ao FIC e a atividade dos fármacos em biofilme e em macrófagos é bacteriostático. / Mycobacterium abscessus subspecies abscessus is a nightmare when involved in lung infection that is incurable, despite the use of antibiotics with in vitro activity, if the treatment does not include surgical resection of the affected area. It is a MCR - rapidly growing mycobacteria pathogenic most frequently isolated from cultures of lung sites. There are a small number of therapeutic options for the treatment of such infections is further reduced and the number of drugs that reach therapeutic concentrations in the intracellular compartment, particularly in the phagosome. The limited number of antimicrobials available for treatment indicate the need for determining the susceptibility profile against antimicrobials alone and in combination, in the intra and extracellular compartments. The objectives of this study were sensitivity of MCR structured biofilms and present in macrophages, the occurrence of synergism when the association between drugs, beta-lactamase inhibitors and anti-inflammatory. Combinations of antimicrobials were just indifferent and the activity of drugs on biofilms and macrophages was bacteriostatic.

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-10-01T21:53:22Z No. of bitstreams: 1 Carolina da Paz Zampier.pdf: 2134379 bytes, checksum: d822f378a88e2cf44b02c5ea60f52ea0 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-01T21:53:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carolina da Paz Zampier.pdf: 2134379 bytes, checksum: d822f378a88e2cf44b02c5ea60f52ea0 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A caveolina-1 (Cav-1), uma proteína essencial para a formação de cavéolas, apresenta atividade na modulação da sinalização intracelular. Cav-1 é capaz de interagir com diversas proteínas através de seu domínio CSD (caveolin scaffolding domain) e, em geral, essa interação leva à inibição das proteínas associadas. O peptídeo CSD tem sido utilizado como um mimético de Cav-1 em relação à sua capacidade modulatória sobre a atividade de outras proteínas. Recentemente, tem sido mostrado que Cav-1 é capaz de modular a resposta inflamatória em diversos aspectos. Neste trabalho, examinamos o papel de Cav-1 na regulação da síntese de mediadores inflamatórios por macrófagos. O lipopolissacarídeo (LPS) de E.coli, um protótipo de estímulo inflamatório, foi capaz de induzir a expressão de Cav-1 e Cox-2 em macrófagos peritoneais in vitro. Estas proteínas são induzidas em um curso temporal semelhante, sendo detectadas por Western blot a partir de 3h com níveis de expressão crescentes até 18h. Por imunofluorescência, observamos que Cav-1 e Cox-2 apresentam um padrão de expressão mutualmente exclusivo em macrófagos estimulados com LPS. Mostramos por Western blot que a expressão de Cox-2 é induzida por LPS e que o tratamento com CSD leva à inibição da expressão de Cox- 2, mas não de Cox-1. Observamos, também, a redução parcial dos níveis de PGE2 no sobrenadante de macrófagos estimulados com LPS e tratados com CSD. O tratamento com o peptídeo CSD também foi capaz de reduzir os níveis de IL-1, IL- 6, e IL-12 induzidos por LPS. O LPS induz o aumento da expressão e fosforilação de STAT-1. A fosforilação de STAT-1 foi diminuída após o tratamento com CSD, indicando que Cav-1 modula negativamente a ativação de STAT-1. Estudos posteriores são necessários para complementar os dados obtidos até o momento para esclarecer os mecanismos de modulação da síntese de mediadores inflamatórios por Cav-1. Em conclusão, Cav-1 apresenta uma atividade inibitória sobre a expressão de Cox-2 e produção dos mediadores inflamatórios PGE2, IL1, IL-6, e IL-12 em macrófagos estimulados com LPS in vitro. O mecanismo de inibição possivelmente envolve inibição da ativação de STAT-1. / Caveolin-1 (Cav-1), a protein essential for the formation of caveolae, shows activity in the modulation of intracellular signaling. Cav-1 can interact with several proteins by its caveolin scaffolding domain (CSD) and, in general, this interaction leads to inhibition of associated proteins. The peptide CSD has been used as a Cav- 1 mimetic in relation to its capacity on the modulatory activity of other proteins. Recently, it has been shown that Cav-1 can modulate the inflammatory response in several respects. We examined the role of Cav-1 in regulating the synthesis of inflammatory mediators by macrophages. Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli, a prototype of inflammatory stimulus, was able to induce the expression of Cav-1 and Cox-2 in peritoneal macrophages in vitro. These proteins are induced in a similar time course, being detected by Western blot at 3 hours with increasing levels of expression up to 18 hours. By immunofluorescence, we observed that Cav-1 and Cox-2 have a mutually exclusive pattern of expression in macrophages stimulated with LPS. Western blot analysis showed that the expression of Cox-2 is induced by LPS and that treatment with CSD leads to inhibition of Cox-2 but not Cox-1. We also observed the partial reduction of PGE2 levels in supernatants of macrophages stimulated with LPS and treated with CSD. Treatment with CSD peptide was also able to reduce the levels of IL1, IL-6 and IL-12 induced by LPS. LPS induces increased expression and phosphorylation of STAT-1. The phosphorylation of STAT- 1 was decreased after treatment with the CSD, indicating that a Cav-1 negatively modulates activation of STAT-1. Further studies are needed to supplement the data obtained so far to clarify the mechanisms of modulation of the synthesis of inflammatory mediators by Cav-1. In conclusion, Cav-1 shows an inhibitory activity on Cox-2 expression and production of the inflammatory mediators PGE2, IL1β, IL-6 and IL-12 in macrophages stimulated with LPS in vitro. The mechanism of inhibition possibly involves inhibition of STAT-1 activation.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:41Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-12-31 / A elucidação estrutural de glicoconjugados de superfície de Leishmania é um tema de grande relevância uma vez que estes componentes mostram-se envolvidos em diversos processos na interação do parasita com a célula hospedeira. Desse modo, seis frações glicolipídicas, denominadas de B1 a B6, foram purificadas de promastigotas de L. (V.) braziliensis por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC). Todas as frações foram lábeis à hidrólise alcalina suave e as análises por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (GC/MS) demonstraram a presença de manose, galactose, glucose, glucosamina e myo-inositol, sugerindo que os glicolipídeos sejam glicoinositolfosfolipídeos (GIPLs). A análise dos alditóis acetato parcialmente metilados (PMAAs) mostrou a presença de 2,4-di-O-metil-manitol tetracetato, sugerindo uma estrutura glicana ramificada contendo resíduo de galactose terminal, decorrente da presença de 2,3,4,6-tetra-O-metilgalactitol diacetato entre os PMAAs. A reatividade com o anticorpo monoclonal (mAb) ST-3 também sugere a presença de resíduos de Galβ1→3Galα na porção glicana dos GIPLs. Estes resultados indicam que promastigotas de L. (V.) braziliensis expressam GIPLs, os quais possivelmente possam ser incluídos nos GIPLs tipo híbrido apresentando, entretanto, novas estruturas glicanas. As células de mamíferos apresentam microdomínios de membranas resistentes a detergente (DRMs), enriquecidos em colesterol e esfingolipídeos e que mostram-se envolvidos em processos de adesão, sinalização celular, processos de endocitose e tráfego polarizado de proteínas. Estudos recentes também têm demonstrado a presença destes microdomínios em T. brucei e L. (L.) major, sugerindo uma ampla distribuição na ordem Kinetoplastida. Para os estudos dos microdomínios de membrana em promastigotas de L. (V.) braziliensis foram utilizados basicamente dois protocolos, um baseado na insolubilidade em detergente não-iônico a 4ºC e outro baseado na baixa densidade dessas regiões, onde as DRMs podem ser purificadas por ultracentrifugação em gradiente de sacarose. Cerca de 85% dos GIPLs e dos esteróis foram detectados na fração insolúvel ao Triton X-100 1% a 4ºC. A presença de GIPLs, IPC e esteróis também foi verificada nas frações contendo as DRMs obtidas após ultracentrifugação. Análises por GC/MS mostraram que GIPLs e IPC apresentam alta proporção de ácidos graxos saturados. Por outro lado, a fração solúvel ao Triton X-100 1% a 4ºC apresentou 65% dos fosfolipídeos, os quais contêm, preferencialmente, ácidos graxos insaturados. As análises dos componentes protéicos por PAGE-SDS demonstraram a presença de uma proteína de aproximadamente 46 kDa, enriquecida nas DRMs, e que pode corresponder à glicoproteína de 46 kDa (gp46) que é ancorada à membrana via GPI e está relacionada com a imunidade protetiva em camundongos previamente imunizados com a glicoproteína purificada. Parasitas tratados com cetoconazol ou metil-β- ciclodextrina (MβCD) foram utilizados em ensaios de infectividade em macrófagos, uma vez que a depleção do conteúdo de esteróis poderia resultar na desestruturação dos microdomínios de membrana. A análise dos índices de infectividade demonstraram que MβCD 20 mM e 40 mM inibiu, respectivamente, 53% e 50% da infectividade. Parasitas tratados com 40 mM de MβCD apresentaram uma depleção de 70% no conteúdo de esteróis e um alto grau de desestruturação dos microdomínios de membrana, uma vez que a análise da distribuição dos GIPLs mostrou um deslocamento deste componente da região de membranas de baixa densidade para as frações solúveis. Parasitas tratados com cetoconazol apresentaram uma redução de 92% da infectividade. No entanto, parte desta inibição pode ser devido ao pequeno grau de desestruturação dos microdomínios de membrana, e parte resultante das alterações morfológicas observadas nos promastigotas, principalmente em nível de estrutura flagelar, sugerindo o envolvimento do flagelo na infecção em macrófago por este espécie de Leishmania. Os resultados apresentados nesta tese confirmam um importante papel para os microdomínios de membrana de promastigotas de L. (V.) braziliensis na infectividade em macrófago. / Glycoconjugates present in Leishmania surface are an important class of molecules involved in parasite-macrophage interaction. The structural elucidation of Leishmania (Viannia) braziliensis promastigote glycolipids is very relevant because in this specie the glycolipids represent the major promastigote surface glycoconjugate. Six glycolipid fractions, termed B1 to B6, were purified from L. (V.) braziliensis promastigotes by high performance liquid chromatography. All fractions were sensitive to mild alkaline hydrolysis and gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) analysis showed the presence of mannose, galactose, glucose, glucosamine and myo-inositol suggesting that glycolipids are glycoinositolphospholipids (GIPLs). The partially methylated alditol acetates analysis showed the presence of 2,4-di-O-methyl-mannitol tetracetate and 2,3,4,6- tetra-O-methyl-galactitol diacetate suggesting a branched oligosaccharide structure containing terminal galactose residue. These results indicate that L. (V.) braziliensis promastigotes express GIPLs which could be included in the hybrid GIPLs class, although present new glycan structures. The concept of lipid rafts, and membrane microdomains, which are non-ionic detergent-resistant at 4°C, enriched by cholesterol and sphingolipid, have being developed in the last years and have being involved in many processes such as adhesion, signal transduction, endocytosis and polarized traffic of proteins. Recently it was demonstrated the presence of these microdomains in T. brucei and L. (L.) major, suggesting a broad distribution throughout the Kinetoplastida. Membrane microdomains present in L. (V.) braziliensis promastigotes were analyzed using two protocols. The first was based on insolubility in non-ionic detergent at 4°C and the second was based on the low density of these membranes. Detergent-resistant membranes (DRMs) were purified by ultracentrifugation on sucrose gradient. About 85% of GIPLs, 85% of sterols, 65% of inositol phosphorylceramide and 35% of phospholipids were detected in detergent-insoluble fraction at 4°C. The presence of GIPLs, sterols and IPC were also verified on DRMs fractions obtained after ultracentrifugation. By GC-MS it was verified that GIPLs and IPC are composed mainly by saturated fatty acids. On the other hand, the detergentsoluble fraction present 65% of phospholipids, which contain higher percentage of unsaturated fatty acids. Analysis by SDS-PAGE demonstrated the presence of 46 kDa (glyco)protein that could correspond to the gp46 anchored in membrane by GPI, and related with protective immunity in mice immunized with this purified glycoprotein. Parasites depleted of sterols after treatment with ketoconazole and methyl-β-cyclodextrin (MβCD) were used in macrophage infectivity. Analysis of infectivity index showed that MβCD at 20 mM and 40 mM inhibited 53% and 50% of L. (V.) braziliensis infectivity, respectively. Parasites treated with MβCD at 40 mM showed a 70% sterol depletion and their GIPLs were present mainly in the fractions containing detergentsoluble components, indicating the this drug disrupted the membrane microdomains. Parasites treated with ketoconazole presented an inhibition of 92% of macrophage infectivity. The high inhibition of macrophage infectivity by parasites treated with ketoconazole could be related with low membrane microdomains disruption and with morphological changes observed in promastigotes mainly in their flagellar structure, suggesting the involvement of flagella in macrophage infectivity by L. (V.) braziliensis promastigotes. The results presented in these work demonstrate that the intact membrane microdomains are essential for L. (V.) braziliensis infectivity. / TEDE

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-11-30T20:45:01Z No. of bitstreams: 1 José Geraldo Bomfim Lima Efeito da autofagia... 2009.pdf: 32365208 bytes, checksum: 34504be1e8f6483c263480600d8e1880 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-30T20:45:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 José Geraldo Bomfim Lima Efeito da autofagia... 2009.pdf: 32365208 bytes, checksum: 34504be1e8f6483c263480600d8e1880 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / A autofagia vem sendo alvo de estudos que demonstram sua participação em infecções por diversos patógenos intracelulares. A depender do patógeno, a autofagia pode facilitar a sobrevivência intracelular do patógeno ou pode funcionar como controle da infecção pela célula hospedeira. Pouco se sabe sobre a participação da autofagia na infecção por Leishmania. Foi demonstrado que o vacúolo parasitóforo induzido por L mexicana adquire nutrientes citosólicos por microautofagia. Além disso, recentemente foi demonstrado que a indução de autofagia promove aumento da carga parasitária de L. amazonensis em macrófagos infectados. Esses dados sugerem a participação do processo autofágico no estabelecimento da infecção por Leishmania, como um mecanismo que favorece a sobrevivência intracelular do parasito. Assim, o objetivo desse estudo foi determinar a influência da autofagia na infecção, in vitro, de macrófagos de camundongos CBA/J por L. amazonensis. Macrófagos foram induzidos à autofagia por duas formas, fisiológica ou farmacológica, após ou antes da infecção por L. amazonensis ou exposição a partículas de levedo ou zimosan. O percentual de infecção e de fagocitose foi estimado. Os resultados mostram que a indução de autofagia, após a infecção, não altera o percentual de macrófagos infectados, mas promove o aumento na carga parasitária de macrófagos infectados por L. amazonensis. Além disso, a prévia indução de autofagia promove a inibição da capacidade fagocítica do macrófago murino. Estudos adicionais serão realizados no intuito de esclarecer os mecanismos pelos quais a indução de autofagia favorece a infecção por L. amazonensis e altera a capacidade fagocítica do macrófago murino / Recently, studies to delineate the participation of autophagy in intracellular pathogen infections have been performed. Dependent on pathogen infection, autophagy can facilitate microorganism intracellular survival or can control pathogen infection by host cell. Few works evaluated the role of autophagy in Leishmania infection. Recently, it was demonstrated that L mexicana-'mduced parasitophorous vacuoles acquire cytosolic nutrients by microautophagy. Additionally, it was also demonstrated that autophagy promotes enhancement of L. amazonensis burden on infected cells. Taken together, these data suggest the involvement of autophagic process on Leishmania infection, as a mechanism that favors parasite survival. The present work intent to determine the influence of autophagy in L. amazonensis infection of CBA/J macrophages in vitro. Autophagy was induced after and before L. amazonensis infection or particle addition to macrophage cultures. The percentage of infection and particle phagocytosis was estimated. The results show that autophagy induction after infection does not influence the percentage of L. a/rjazonens/s-infected cells, but enhances L. amazonensis burden on infected cells. In addition, previous autophagy induction inhibited macrophage phagocytic capacity. Further studies will be performed to understand the mechanisms involved in autophagy effect on L. amazonensis infection and on macrophage phagocytic capacity.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2014-10-29T14:03:53Z No. of bitstreams: 1 Niara de Jesus Almeida.Avaliação...2014.pdf: 2142198 bytes, checksum: c0f1caa073f88305a34bffb0a94263ff (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-29T14:03:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Niara de Jesus Almeida.Avaliação...2014.pdf: 2142198 bytes, checksum: c0f1caa073f88305a34bffb0a94263ff (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Camundongos CBA são resistentes à infecção por Leishmania major e permissivos à infecção por L. amazonensis. Adicionalmente, macrófagos de camundongos CBA controlam à infecção por L. major, mas não por L. mazonensis in vitro. Em estudo comparativo realizado por nosso grupo foi demonstrado que o receptor scavenger MARCO teve expressão aumentada em resposta à infecção por L. major, mas não na infecção por L. amazonensis. Ainda, o bloqueio do receptor com o anticorpo específico reduziu a infecção por L. major em 30%, indicando que esta proteína tem participação no reconhecimento de promastigotas de L. major em macrófagos de CBA. Assim, nossa hipótese é que o receptor MARCO participa do reconhecimento e fagocitose de L. major por macrófagos, direcionando o curso da infecção. O objetivo do presente estudo consistiu em evidenciar o papel do receptor MARCO na infecção de macrófagos por L. major. Inicialmente, células J774 foram transfectadas com os vetores pcDNA3.1-MARCO (J774-MARCO) ou pcDNA3.1 (J774-MOCK). Foi observado que a expressão do gene do MARCO foi cinco vezes maior nas células J774-MARCO em comparação às células J774-MOCK. Ao avaliarmos o efeito da superexpressão sobre o metabolismo de células J774-MARCO foi observado que a atividade metabólica mitocondrial foi maior nos clones J774-MARCO e J774-MOCK, 14% e 39% respectivamente, em comparação com as células J774 controle não transfectadas. Entretanto, a diferença no metabolismo não alterou a viabilidade celular dos clones transfectados. A superexpressão de MARCO não aumentou a ligação de L. major em células J774, mas favoreceu tanto o aumento no percentual de infecção de L. major como o número de parasitos/célula nos tempos iniciais até 24 h após a infecção (p ≤ 0,05). Adicionalmente, foi investigado se MARCO estaria induzindo modificações na membrana celular que favorecessem a entrada de L. major. Foi demonstrado que as células superexpressando MARCO (67%) apresentaram um maior espraiamento da membrana celular, com a formação de lamelipódios e estruturas semelhantes a filopódios, eventos observados em um número reduzido de células J774-MOCK (24%). Ao avaliarmos o efeito da superexpressão de MARCO na produção de quimiocinas e citocinas durante a infecção por L. major foi observado que a adição de L. major induziu níveis significativamente maiores de MCP-1 e TNF-α nos tempos de 24 e 48 h após a infecção em comparação com as células J774-MOCK (p < 0,01). Níveis maiores de IL-6 foram observados após 48 h de infecção por L. major nas células J774-MARCO em comparação às células controle (p < 0,05). Similarmente, em resposta à infecção por L. major, células J774-MARCO produziram maior quantidade de NO nos tempos de 24 (p < 0,001) e 48 h (p < 0,01) após a infecção. Todavia, a superexpressão de MARCO não teve efeito sobre a sobrevivência intracelular do parasito. Em suma, nossos achados sugerem que a superexpressão do receptor scavenger MARCO favorece a entrada de L. major em células J774, além de desencadear uma resposta imune efetora direcionando o curso da infecção por Leishmania. / CBA mice are resistant to Leishmania major yet permissive to L. amazonensis infection. In addition, CBA macrophages control L. major, but not L. amazonensis infection in vitro. In a comparative study performed by our group increase in expression of the scavenger receptor MARCO has been detected in response to L. major, but not to L. amazonensis infection. Moreover, ED31 monoclonal antibody against MARCO reduced by 30% L. major infection in CBA macrophages. These findings indicate that MARCO plays a role in L. major recognition by CBA macrophages. We hypothesized that MARCO receptor participates in the recognition and phagocytosis of L. major by macrophages, directing the outcome of infection. In the present study, we aimed to further disclose the role MARCO plays in L. major infection of murine macrophages. First J774 cells were transfected with pcDNA3.1-MARCO vector (MARCO-J774) or pcDNA3.1 vector (MOCK-J774). Expression of MARCO gene shown to be five times higher in MARCO-J774 cells compared to MOCK-J774 cells. Overexpression of MARCO enhanced mitochondrial metabolic activity in 14% and 39% of both MARCO-J774 and MOCK-J774, respectively, when compared to the control non-transfected J774 cells. However, enhancement in mitochondrial metabolic activity did not alter the cell viability of transfected clones. MARCO overexpression did not increase the binding of L. major in J774 cells, but increased both the percentage of infection of L. major and the number of parasites / cell until 24 h after infection (p ≤ 0,05). Additionally, we investigated whether MARCO be inducing changes in cell membrane that would favor L. major uptake by macrophages. We observed that MARCO-J774 cells (67%) showed a pronounced spread of cell membranes, with short microvilli and lamellipodia, events observed in a reduced number of MOCK-J774 (24%). Then, we evaluated production of pro-inflammatory chemokine and cytokine induced by L. major in MARCO-J774 cells. L. major addition to MARCO-J774 cells induced higher significantly levels of MCP-1 and TNF-α compared to MOCK-J774 cells at 24 and 48 h post infection (p < 0,01). Higher levels of IL-6 were also observed at 48 h of L. major infection in MARCO-J774 cells compared to control (p < 0,05). Similarly, NO production induced by L. major was much more higher in MARCO-J774 cells compared to MOCK-J774 at 24 and 48 h post infection (p ≤ 0,01). Although in MARCO-overexpressing cells, enhancement in pro-inflammatory chemokines and cytokines in response to L. major has been observed, no effect on parasite intracellular survival has been detected. In summary, our findings suggest that the scavenger receptor MARCO overexpression favors the entry of L. major in J774 cells, and trigger an effector immune response that directs outcome of Leishmania infection.