Entre as estratégias que os protozoários do gênero Leishmania apresentam para o escape da resposta imune do hospedeiro vertebrado, há a ocorrência de um tipo de morte celular programada, conhecida como apoptose. Quando em contato com o macrófago, a Leishmania é fagocitada de forma silenciosa, evitando a resposta inflamatória do hospedeiro vertebrado. Alguns autores defendem que a Leishmania mimetiza a apoptose, expondo entre outras moléculas um fosfolipídio que sinalizaria para o macrófago que está em apoptose, e esse mecanismo é denominado na literatura como mimetismo apoptótico. O objetivo desta tese foi elucidar como ocorre esse escape com o enfoque nos fosfolipídios presentes e expostos em parasitas mutantes de L. (L.) amazonensis com características fenotípicas distintas, utilizando diferentes estratégias: transfecção com cosmídeos contendo frações do genoma de L. (L.) amazonensis; identificação e clonagem do gene pi4k contido no cosmídeo em vetor de expressão em Leishmania; seleção de parasitas resistentes a miltefosina, mantidos ou não sob pressão do antibiótico, seleção de parasitas na 28a passagem em cultura; seleção de parasitas purificados de macrófagos de linhagem RAW. A caracterização desses mutantes foi realizada em relação à ligação de anexina V-FITC, infectividade em macrófagos da linhagem RAW, tomada de fosfolipídios fluorescentes (NBD), IC50 de células tratadas com os antibióticos duramicina, miltefosina e anfotericina B. De acordo com os ensaios de ligação à anexina V-FITC, identificamos que os mutantes pi4k-pSNBR e os mutantes resistentes à miltefosina apresentaram maior ligação à anexina V-FITC. O gene que codifica a fosfatidilinositol (PI) 4-kinase, fez com que os parasitas que continham tanto o cosmídeo como o superexpressor pi4k, apresentassem menor infectividade em relação ao controle selvagem. O mesmo ocorreu para os parasitas resistentes à miltefosina. Em contrapartida, os parasitas derivados desses resistentes, mas mantidos sem pressão do antibiótico, recuperaram os valores de infectividade comparáveis ao grupo controle. Interessante é que os parasitas resistentes à miltefosina, mantidos ou não sob pressão, assim como o parasita superexpressor do gene pi4k apresentaram maior ligação à anexina V-FITC em relação ao controle selvagem, indicando que a ligação à anexina V-FITC não se correlaciona com infectividade. Parasitas resistentes à miltefosina, mantidos ou não sob pressão apresentaram maior sensibilidade à duramicina, e quando tratados com anfotericina B, esses parasitas apresentaram maior resistência. Uma outra abordagem analisada nessa tese foi elucidar qual o fosfolipídio é reconhecido pelo macrófago durante a infecção por L. (L.) amazonensis. Como resultado, observamos que os lipossomas contendo PC levam à diminuição dose-dependente da infecção, o que não foi visto em PS ou PC:PE. Esse resultado sugere a importância de PC para o estabelecimento da infectividade. / Among the strategies that Leishmania protozoans present to escape the immune response of the vertebrate host, there is a type of programmed cell death, known as apoptosis. When in contact with the macrophage, Leishmania is phagocytized in a silent manner, avoiding the inflammatory response of the vertebrate host. Some authors argue that Leishmania mimics apoptosis, exposing among other molecules a phospholipid that would signal to the macrophage that is in apoptosis, and this mechanism is denominated in the literature as apoptotic mimicry. The objective of this thesis was to elucidate how this escape occurs with the focus on the phospholipids present and exposed in mutant parasites of L. (L.) amazonensis, with distinct phenotypic characteristics, using different strategies, such as selection of parasites showing higher attachment to annexin V-FITC. After transfection with cosmids containing the genome of L. (L.) amazonensis; identification and cloning of the pi4k gene contained in the cosmid in Leishmania expression vector; selection of parasites resistant to miltefosine, whether or not under antibiotic pressure, selection of parasites at the 28th passage in culture; selection of purified strains of RAW lineage macrophages. The characterization of these mutants was performed in relation to the annexin V-FITC binding, infectivity in RAW lineage macrophages, fluorescent phospholipid (NBD) uptake, IC50 of cells treated with the antibiotics duramycin, miltefosine and amphotericin B. According to the binding assays to Annexin V-FITC, we have identified that pi4k-pSNBR mutants and miltefosin-resistant mutants showed higher attachment to annexin V-FITC. The gene coding for phosphatidylinositol (PI) 4-kinase caused the parasites containing both the cosmid and the pi4k superexpressor to have less infectivity than the wild-type control. The same occurred for parasites resistant to miltefosine. In contrast, the parasites derived from these resistant, but kept without antibiotic pressure, recovered infectivity values, comparable to the control group. Interestingly, miltefosine-resistant parasites, whether or not under pressure, as well as the overexpressing parasite of the pi4k gene showed greater attachment to annexin V-FITC over wild-type control, indicating that attachment to annexin V-FITC does not correlate with infectivity. Parasites resistant to miltefosine, whether or not under pressure, showed greater sensitivity to duramycin, and when treated with amphotericin B, these parasites showed greater resistance. Another approach analyzed in this thesis was to elucidate the phospholipid recognized by the macrophage during infection by L. (L.) amazonensis. As a result, we observed that PC-containing liposomes lead to dose-dependent decrease of infection, which has not been seen in PS or PC: PE. This result suggests the importance of PC for the establishment of infectivity.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:41Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-12-31 / A elucidação estrutural de glicoconjugados de superfície de Leishmania é um tema de grande relevância uma vez que estes componentes mostram-se envolvidos em diversos processos na interação do parasita com a célula hospedeira. Desse modo, seis frações glicolipídicas, denominadas de B1 a B6, foram purificadas de promastigotas de L. (V.) braziliensis por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC). Todas as frações foram lábeis à hidrólise alcalina suave e as análises por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (GC/MS) demonstraram a presença de manose, galactose, glucose, glucosamina e myo-inositol, sugerindo que os glicolipídeos sejam glicoinositolfosfolipídeos (GIPLs). A análise dos alditóis acetato parcialmente metilados (PMAAs) mostrou a presença de 2,4-di-O-metil-manitol tetracetato, sugerindo uma estrutura glicana ramificada contendo resíduo de galactose terminal, decorrente da presença de 2,3,4,6-tetra-O-metilgalactitol diacetato entre os PMAAs. A reatividade com o anticorpo monoclonal (mAb) ST-3 também sugere a presença de resíduos de Galβ1→3Galα na porção glicana dos GIPLs. Estes resultados indicam que promastigotas de L. (V.) braziliensis expressam GIPLs, os quais possivelmente possam ser incluídos nos GIPLs tipo híbrido apresentando, entretanto, novas estruturas glicanas. As células de mamíferos apresentam microdomínios de membranas resistentes a detergente (DRMs), enriquecidos em colesterol e esfingolipídeos e que mostram-se envolvidos em processos de adesão, sinalização celular, processos de endocitose e tráfego polarizado de proteínas. Estudos recentes também têm demonstrado a presença destes microdomínios em T. brucei e L. (L.) major, sugerindo uma ampla distribuição na ordem Kinetoplastida. Para os estudos dos microdomínios de membrana em promastigotas de L. (V.) braziliensis foram utilizados basicamente dois protocolos, um baseado na insolubilidade em detergente não-iônico a 4ºC e outro baseado na baixa densidade dessas regiões, onde as DRMs podem ser purificadas por ultracentrifugação em gradiente de sacarose. Cerca de 85% dos GIPLs e dos esteróis foram detectados na fração insolúvel ao Triton X-100 1% a 4ºC. A presença de GIPLs, IPC e esteróis também foi verificada nas frações contendo as DRMs obtidas após ultracentrifugação. Análises por GC/MS mostraram que GIPLs e IPC apresentam alta proporção de ácidos graxos saturados. Por outro lado, a fração solúvel ao Triton X-100 1% a 4ºC apresentou 65% dos fosfolipídeos, os quais contêm, preferencialmente, ácidos graxos insaturados. As análises dos componentes protéicos por PAGE-SDS demonstraram a presença de uma proteína de aproximadamente 46 kDa, enriquecida nas DRMs, e que pode corresponder à glicoproteína de 46 kDa (gp46) que é ancorada à membrana via GPI e está relacionada com a imunidade protetiva em camundongos previamente imunizados com a glicoproteína purificada. Parasitas tratados com cetoconazol ou metil-β- ciclodextrina (MβCD) foram utilizados em ensaios de infectividade em macrófagos, uma vez que a depleção do conteúdo de esteróis poderia resultar na desestruturação dos microdomínios de membrana. A análise dos índices de infectividade demonstraram que MβCD 20 mM e 40 mM inibiu, respectivamente, 53% e 50% da infectividade. Parasitas tratados com 40 mM de MβCD apresentaram uma depleção de 70% no conteúdo de esteróis e um alto grau de desestruturação dos microdomínios de membrana, uma vez que a análise da distribuição dos GIPLs mostrou um deslocamento deste componente da região de membranas de baixa densidade para as frações solúveis. Parasitas tratados com cetoconazol apresentaram uma redução de 92% da infectividade. No entanto, parte desta inibição pode ser devido ao pequeno grau de desestruturação dos microdomínios de membrana, e parte resultante das alterações morfológicas observadas nos promastigotas, principalmente em nível de estrutura flagelar, sugerindo o envolvimento do flagelo na infecção em macrófago por este espécie de Leishmania. Os resultados apresentados nesta tese confirmam um importante papel para os microdomínios de membrana de promastigotas de L. (V.) braziliensis na infectividade em macrófago. / Glycoconjugates present in Leishmania surface are an important class of molecules involved in parasite-macrophage interaction. The structural elucidation of Leishmania (Viannia) braziliensis promastigote glycolipids is very relevant because in this specie the glycolipids represent the major promastigote surface glycoconjugate. Six glycolipid fractions, termed B1 to B6, were purified from L. (V.) braziliensis promastigotes by high performance liquid chromatography. All fractions were sensitive to mild alkaline hydrolysis and gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) analysis showed the presence of mannose, galactose, glucose, glucosamine and myo-inositol suggesting that glycolipids are glycoinositolphospholipids (GIPLs). The partially methylated alditol acetates analysis showed the presence of 2,4-di-O-methyl-mannitol tetracetate and 2,3,4,6- tetra-O-methyl-galactitol diacetate suggesting a branched oligosaccharide structure containing terminal galactose residue. These results indicate that L. (V.) braziliensis promastigotes express GIPLs which could be included in the hybrid GIPLs class, although present new glycan structures. The concept of lipid rafts, and membrane microdomains, which are non-ionic detergent-resistant at 4°C, enriched by cholesterol and sphingolipid, have being developed in the last years and have being involved in many processes such as adhesion, signal transduction, endocytosis and polarized traffic of proteins. Recently it was demonstrated the presence of these microdomains in T. brucei and L. (L.) major, suggesting a broad distribution throughout the Kinetoplastida. Membrane microdomains present in L. (V.) braziliensis promastigotes were analyzed using two protocols. The first was based on insolubility in non-ionic detergent at 4°C and the second was based on the low density of these membranes. Detergent-resistant membranes (DRMs) were purified by ultracentrifugation on sucrose gradient. About 85% of GIPLs, 85% of sterols, 65% of inositol phosphorylceramide and 35% of phospholipids were detected in detergent-insoluble fraction at 4°C. The presence of GIPLs, sterols and IPC were also verified on DRMs fractions obtained after ultracentrifugation. By GC-MS it was verified that GIPLs and IPC are composed mainly by saturated fatty acids. On the other hand, the detergentsoluble fraction present 65% of phospholipids, which contain higher percentage of unsaturated fatty acids. Analysis by SDS-PAGE demonstrated the presence of 46 kDa (glyco)protein that could correspond to the gp46 anchored in membrane by GPI, and related with protective immunity in mice immunized with this purified glycoprotein. Parasites depleted of sterols after treatment with ketoconazole and methyl-β-cyclodextrin (MβCD) were used in macrophage infectivity. Analysis of infectivity index showed that MβCD at 20 mM and 40 mM inhibited 53% and 50% of L. (V.) braziliensis infectivity, respectively. Parasites treated with MβCD at 40 mM showed a 70% sterol depletion and their GIPLs were present mainly in the fractions containing detergentsoluble components, indicating the this drug disrupted the membrane microdomains. Parasites treated with ketoconazole presented an inhibition of 92% of macrophage infectivity. The high inhibition of macrophage infectivity by parasites treated with ketoconazole could be related with low membrane microdomains disruption and with morphological changes observed in promastigotes mainly in their flagellar structure, suggesting the involvement of flagella in macrophage infectivity by L. (V.) braziliensis promastigotes. The results presented in these work demonstrate that the intact membrane microdomains are essential for L. (V.) braziliensis infectivity. / TEDE

Entre as estratégias que os protozoários do gênero Leishmania apresentam para o escape da resposta imune do hospedeiro vertebrado, há a ocorrência de um tipo de morte celular programada, conhecida como apoptose. Quando em contato com o macrófago, a Leishmania é fagocitada de forma silenciosa, evitando a resposta inflamatória do hospedeiro vertebrado. Alguns autores defendem que a Leishmania mimetiza a apoptose, expondo entre outras moléculas um fosfolipídio que sinalizaria para o macrófago que está em apoptose, e esse mecanismo é denominado na literatura como mimetismo apoptótico. O objetivo desta tese foi elucidar como ocorre esse escape com o enfoque nos fosfolipídios presentes e expostos em parasitas mutantes de L. (L.) amazonensis com características fenotípicas distintas, utilizando diferentes estratégias: transfecção com cosmídeos contendo frações do genoma de L. (L.) amazonensis; identificação e clonagem do gene pi4k contido no cosmídeo em vetor de expressão em Leishmania; seleção de parasitas resistentes a miltefosina, mantidos ou não sob pressão do antibiótico, seleção de parasitas na 28a passagem em cultura; seleção de parasitas purificados de macrófagos de linhagem RAW. A caracterização desses mutantes foi realizada em relação à ligação de anexina V-FITC, infectividade em macrófagos da linhagem RAW, tomada de fosfolipídios fluorescentes (NBD), IC50 de células tratadas com os antibióticos duramicina, miltefosina e anfotericina B. De acordo com os ensaios de ligação à anexina V-FITC, identificamos que os mutantes pi4k-pSNBR e os mutantes resistentes à miltefosina apresentaram maior ligação à anexina V-FITC. O gene que codifica a fosfatidilinositol (PI) 4-kinase, fez com que os parasitas que continham tanto o cosmídeo como o superexpressor pi4k, apresentassem menor infectividade em relação ao controle selvagem. O mesmo ocorreu para os parasitas resistentes à miltefosina. Em contrapartida, os parasitas derivados desses resistentes, mas mantidos sem pressão do antibiótico, recuperaram os valores de infectividade comparáveis ao grupo controle. Interessante é que os parasitas resistentes à miltefosina, mantidos ou não sob pressão, assim como o parasita superexpressor do gene pi4k apresentaram maior ligação à anexina V-FITC em relação ao controle selvagem, indicando que a ligação à anexina V-FITC não se correlaciona com infectividade. Parasitas resistentes à miltefosina, mantidos ou não sob pressão apresentaram maior sensibilidade à duramicina, e quando tratados com anfotericina B, esses parasitas apresentaram maior resistência. Uma outra abordagem analisada nessa tese foi elucidar qual o fosfolipídio é reconhecido pelo macrófago durante a infecção por L. (L.) amazonensis. Como resultado, observamos que os lipossomas contendo PC levam à diminuição dose-dependente da infecção, o que não foi visto em PS ou PC:PE. Esse resultado sugere a importância de PC para o estabelecimento da infectividade. / Among the strategies that Leishmania protozoans present to escape the immune response of the vertebrate host, there is a type of programmed cell death, known as apoptosis. When in contact with the macrophage, Leishmania is phagocytized in a silent manner, avoiding the inflammatory response of the vertebrate host. Some authors argue that Leishmania mimics apoptosis, exposing among other molecules a phospholipid that would signal to the macrophage that is in apoptosis, and this mechanism is denominated in the literature as apoptotic mimicry. The objective of this thesis was to elucidate how this escape occurs with the focus on the phospholipids present and exposed in mutant parasites of L. (L.) amazonensis, with distinct phenotypic characteristics, using different strategies, such as selection of parasites showing higher attachment to annexin V-FITC. After transfection with cosmids containing the genome of L. (L.) amazonensis; identification and cloning of the pi4k gene contained in the cosmid in Leishmania expression vector; selection of parasites resistant to miltefosine, whether or not under antibiotic pressure, selection of parasites at the 28th passage in culture; selection of purified strains of RAW lineage macrophages. The characterization of these mutants was performed in relation to the annexin V-FITC binding, infectivity in RAW lineage macrophages, fluorescent phospholipid (NBD) uptake, IC50 of cells treated with the antibiotics duramycin, miltefosine and amphotericin B. According to the binding assays to Annexin V-FITC, we have identified that pi4k-pSNBR mutants and miltefosin-resistant mutants showed higher attachment to annexin V-FITC. The gene coding for phosphatidylinositol (PI) 4-kinase caused the parasites containing both the cosmid and the pi4k superexpressor to have less infectivity than the wild-type control. The same occurred for parasites resistant to miltefosine. In contrast, the parasites derived from these resistant, but kept without antibiotic pressure, recovered infectivity values, comparable to the control group. Interestingly, miltefosine-resistant parasites, whether or not under pressure, as well as the overexpressing parasite of the pi4k gene showed greater attachment to annexin V-FITC over wild-type control, indicating that attachment to annexin V-FITC does not correlate with infectivity. Parasites resistant to miltefosine, whether or not under pressure, showed greater sensitivity to duramycin, and when treated with amphotericin B, these parasites showed greater resistance. Another approach analyzed in this thesis was to elucidate the phospholipid recognized by the macrophage during infection by L. (L.) amazonensis. As a result, we observed that PC-containing liposomes lead to dose-dependent decrease of infection, which has not been seen in PS or PC: PE. This result suggests the importance of PC for the establishment of infectivity.

A temperatura é o fator ambiental mais importante que afeta a atividade de animais ectotérmicos, como peixes. Ajustes compensatórios à temperatura ocorrem em diferentes cursos temporais, que variam de menos de um minuto a mais de um mês, e as membranas são os primeiros alvos afetados pelas mudanças de temperatura, com resposta imediata dos componentes lipídicos a este desafio. Este trabalho teve como objetivo estimar a capacidade alostática (na estrutura e funções de membrana) no contexto das variáveis climáticas relevantes e caracterizar o âmbito e os mecanismos de mudança, incluindo os mecanismos que concedem tolerância a mudanças de temperatura agudas e crônicas. Juvenis de Steindachneridion parahybae uma espécie de peixe nativa ameaçada de extinção, foram progressivamente resfriados de 30° C a 24, 17 e 12 ° C, nas quais foram mantidas por até 5 dias no tratamento agudo e por até 30 dias no tratamento crônico. Os tecidos hepático, encefálico e branquial foram amostrados, com análises subsequentes das principais frações fosfolipídicas (fosfatidilcolina (FC) e fosfatidiletanolamina (FE) e análises posicionais de cada fração), atividade da Na+/ K+-ATPase e histomorfologia branquial. Os animais mantidos na temperatura mais baixa mostraram uma elevada taxa de mortalidade, provavelmente devido à proximidade desta temperatura ao limite térmico inferior para esta espécie. A atividade da Na+/ K+-ATPase se mostrou aumentada nas temperaturas mais baixas, corroborando o aumento das lesões morfológicas branquiais e massa de fígado para estas temperaturas. Em geral o perfil de ácidos graxos de FC mantiveram-se mais estáveis do que o observado para FE. O teste agudo aparentemente afetou consideravelmente C20-22n3 (FC hepática e sn-1 ; FE encefálica e hepática), enquanto que no teste crônico, C20-22n6 foi o grupamento mais afetado (FC e FE hepático em sn-2 e sn-1). O ensaio agudo mostrou um padrão de manutenção da estrutura de membrana cerebral, com uma diminuição de C20-22n3 hepática e aumento destes ácidos graxos no encéfalo durante o tratamento. Em ambos os tecidos e frações analisados foi possível detectar evidências significativas de reestruturação da membrana, mostrando que o Surubim do Paraíba foi capaz de proporcionar ajustes compensatórios em respostas de aclimatação. / Temperature is the most important environmental factor affecting the activity of ectothermic animals such as fish. Compensatory adjustments to temperature occur with time courses ranging from less than a minute to more than a month, and membranes are the first targets affected by change of temperature, and their lipid components respond immediately to this challenge. This project aimed to estimate the allostatic capacity (in membrane structure and function) in the context of relevant climate variables, and to characterize the scope and the defense mechanisms available, including those yielding tolerance to acute and chronic temperature shifts. Steindachneridion parahybae juveniles, an endangered native fish species, were progressively cooled from 30°C to 24, 17 and 12°C, in which they were maintained for up to 5 days in the acute trial and for up 30 days in the chronic trial. Brain, liver and branchial tissues were sampled, with subsequent analyses of the main phospholipids fractions (phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylethanolamine (PE), and the positional analyses of each fraction), Na+/K+-ATPase activity and histomorphology of gills. The animals maintained atlower temperature showed a high rate of mortality, probably because this temperature is near the lower thermal limit for this species. The activity of Na+ K+ATPase increased at lower temperatures, the same pattern observed for morphological injuries in gills and increased liver mass. Generally the fatty acid profiles of PC remained more stable than those in PE. The acute test apparently had affected considerably C20-22n3 (liver PC and sn-1 PC; PE in brain and liver), while for the chronic test, C20-22n6 was more affected (PC and PE liver on sn-2 and sn-1). The acute trial showed a pattern of maintenance of brain membrane structure, with a decrease of PE-associated C20-22n3 in the liver and an increase of these fatty acids in brain during the test. In both tissues and fractions analyzed it was possible to detect significant evidences of membrane restructuring, showing that the Surubim do Paraiba was able to provide compensatory adjustments in acclimation responses

A fosfolipase A2 (PLA2) é uma enzima chave no metabolismo dos fosfolípides de membrana e é um dos principais componentes envolvidos na sinalização celular. Alterações da atividade da PLA2 tem sido descritas no cérebro e no sangue (soro, plasma e plaquetas) de pacientes com diversas doenças neuropsiquiátricas. Neste estudo foi desenvolvido um ensaio radioenzimático para detectar em plaquetas, a atividade dos três principais grupos de PLA2, que são PLA2 secretórias ou PLA2 extracelular dependente de Ca 2+ (sPLA2); PLA2 citósólicas dependentes de Ca 2+ (cPLA2) e as PLA2 intracelulares independentes de Ca 2+ (iPLA2). Para confirmar a presença desses grupos da enzima em plaquetas, algumas variáveis foram testadas, como as diferenças de preferência ao ácido graxo como substrato, o requerimento de cálcio e a inibição seletiva com os inibidores Bromoenol lactone (BEL) e o Methyl Arachidonyl Fluorophosphonate (MAFP). Os resultados obtidos demonstram a presença dos três principais grupos de PLA2 (sPLA2, cPLA2, and iPLA2) em plaquetas. Estes achados sugerem o uso de plaquetas, uma amostra biológica de fácil acesso, como possível modelo periférico de neurônios para o estudo do metabolismo de fosfolípides. / Phospholipase A2 (PLA2) is a key-enzyme in the metabolism of membrane phospholipids and is one of the major components involved in cell signaling. Alterations of PLA2 activity have been reported in brains and blood cells in several neuropsychiatric diseases. In this study we developed a radio-enzymatic assay to detect in platelets the activity of the three main groups of PLA2, which are secretory PLA2 or extracellular calcium dependent PLA2 (sPLA2), cytosolic calcium dependent PLA2 (cPLA2) and intracellular calcium independent PLA2 (iPLA2). To confirm the presence of these PLA2 groups some variables were tested, such as differences in the preferred fatty acid substrate, calcium dependence, and selective inhibition with Bromoenol lactone (BEL) and Methyl Arachidonyl Fluorophosphonate (MAFP). Our findings demonstrate the presence of the three main groups of PLA2 (sPLA2, cPLA2, and iPLA2) in platelets. In addition, this study is in line with others suggesting that platelets, a typical biological sample, can be used as a peripheral model for neurons.

O acesso à permeabilidade é uma etapa crucial na definição da via de administração de um fármaco, além de ser um dos parâmetros utilizados para a avaliação e seleção de moléculas durante as fases iniciais da pesquisa por novos fármacos. Diversos modelos in vitro têm sido descritos para a realização dos estudos de permeabilidade, mas ainda é evidente a carência de padronização de seus protocolos. O modelo de Permeabilidade em Membrana Artificial Paralela (PAMPA) é rápido e simples, podendo ser facilmente incorporado à rotina de um laboratório. Não obstante, tem apresentado excelente correlação com modelos in vitro quando na avaliação da permeabilidade de fármacos transportados pela via passiva transcelular. O principal objetivo deste trabalho foi investigar a influência das principais variáveis do método de PAMPA e seu impacto na permeabilidade de fármacos. Para tanto, foram selecionados 9 fármacos com características físico-químicas distintas, em função dos seguintes critérios: lipofilicidade (logP); Área de Superfície Polar (PSA); Volume Molecular (VM); pKa; Peso Molecular (PM); Número doadores de ligação de hidrogênio (HBD) e Sistema de Classificação Biofarmacêutica (SCB). Os fármacos selecionados foram listados quanto à sua permeabilidade em jejuno humano (Peff) e em cultura de células Caco-2, além de Fração de Absorção (FA%) em humanos. Para o estudo das variáveis da técnica de PAMPA, a ferramenta de Desenho de Experimentos (DOE) foi utilizada e as seguintes condições de ensaio foram exploradas: gradiente de pH do meio do compartimento doador, presença ou ausência de ácido glicocólico no meio do compartimento receptor, variação do tempo de incubação, presença ou ausência de agitação das placas durante a incubação e variação da composição lipídica da membrana artificial. A combinação fatorial completa das condições de ensaio a serem exploradas resultou em 96 experimentos, os quais foram executados em triplicata. Os resultados obtidos apontaram que as variações do pH do meio do compartimento doador, do tempo de incubação e da composição do meio do compartimento receptor foram as condições do ensaio de PAMPA que mais impactaram a permeabilidade dos fármacos. Os resultados obtidos nos 96 experimentos do DOE foram relacionados, a partir de regressão linear, com os parâmetros fisico-químicos e dados de permeabilidade dos fármacos do estudo. O experimento de DOE que apresentou melhor correlação com os dados de permeabilidade em jejuno humano para os fármacos contemplados neste estudo teve um R2=0,858. As condições de ensaio consideradas para este experimento foram: pH 4,5 no compartimento doador, incubação de 15 horas, ausência de agitação das placas, membrana composta por fosfatidilcolina 10% (p/v) e colesterol 0,5% (p/v) e presença de ácido glicocólico 0,5% (p/v) no compartimento receptor. Dentre as propriedades físico-químicas, o PM, PSA e VM foram propriedades comuns a grupos de fármacos cuja permeabilidade foi favorecida pelas mesmas condições de ensaio de PAMPA. Os maiores valores de permeabilidade em PAMPA foram obtidos para fármacos com Peff entre 1 e 2 *10-4 cm/s, permeabilidade em células Caco-2 entre 20 e 27 *10-6 cm/s, faixa de logP entre 0 e 3 além de PM abaixo de 300 Da e PSA abaixo de 90Å2. / The permeability access is a critical step when defining the route of administration of a drug, besides from being one of the parameters considered for selecting the best candidates during the initial stages of new molecules discovery. For this reason, there is a need to implement high capacity and low cost models, which have a high correlation with in vivo permeability. Several in vitro models have been described for the studies of permeability, but the lack of standardization of protocols is still evident. Parallel Artificial Membrane Permeability Assay (PAMPA) is fast and simple and can be easily incorporated into the routine of a laboratory. Nevertheless, it has shown excellent correlation with in vitro models when evaluating the permeability of drugs that are transported primarily by passive transcellular route. The aim of this project was to investigate the influence of key variables of PAMPA on the permeability of drugs. Therefore, nine drugs with different physicochemical characteristics were selected based on the following criteria: lipophilicity (logP), Polar Surface Area (PSA), Molecular Volume (MV), pKa, Molecular Weight (MW), number of Hydrogen Bond Donors (HBD) and Biopharmaceutical Classification System (BCS). In addition, the drugs were listed for their permeability in human jejunum, Caco-2 and Fraction of Absorption (FA%) in humans. Design of Experiments (DOE) was considered to plan the PAMPA experiments, and the following assay conditions were explored: pH gradient in the donor compartment, glycocholic acid presence or absence in the acceptor compartment, variations in the incubation time, presence or absence of plate agitation and variations in the lipid composition of the artificial membranes. Full factorial combination of the assay variables resulted in 96 experiments, which were performed in triplicate. The results showed that the pH of the donor compartment, the incubation time and acceptor compartment composition were the assay conditions which most impacted the PAMPA results of drugs. The 96 DOE experiments results were then correlated, by linear regression, with both the physic-chemical and permeability data of the selected drugs. The DOE experiment that showed the best correlation with the permeability in human jejunum (R2 = 0.858) for the drugs included in this study had the following test conditions: pH 4.0 in the donor compartment, incubation of 15 hours, without plate agitation, artificial membrane composed of phosphatidylcholine 10% (w/v) and cholesterol 0.5% (w/v) in dodecane and presence of glycocholic acid 0.5% (w/v) in the receptor compartment. Among the studied physicochemical properties, the molecular weight (MW), polar surface area (PSA) and molecular volume (VM) were the best drivers for determining PAMPA most suitable assay conditions. The highest PAMPA values were obtained for drugs with Peff between 1 and 2 *10-4 cm/s and Caco-2 permeability between 20 and 27 *10-6 cm/s, besides from logP between 0 and 3, MW below 300 Da and PSA below 90Å2.

O acesso à permeabilidade é uma etapa crucial na definição da via de administração de um fármaco, além de ser um dos parâmetros utilizados para a avaliação e seleção de moléculas durante as fases iniciais da pesquisa por novos fármacos. Diversos modelos in vitro têm sido descritos para a realização dos estudos de permeabilidade, mas ainda é evidente a carência de padronização de seus protocolos. O modelo de Permeabilidade em Membrana Artificial Paralela (PAMPA) é rápido e simples, podendo ser facilmente incorporado à rotina de um laboratório. Não obstante, tem apresentado excelente correlação com modelos in vitro quando na avaliação da permeabilidade de fármacos transportados pela via passiva transcelular. O principal objetivo deste trabalho foi investigar a influência das principais variáveis do método de PAMPA e seu impacto na permeabilidade de fármacos. Para tanto, foram selecionados 9 fármacos com características físico-químicas distintas, em função dos seguintes critérios: lipofilicidade (logP); Área de Superfície Polar (PSA); Volume Molecular (VM); pKa; Peso Molecular (PM); Número doadores de ligação de hidrogênio (HBD) e Sistema de Classificação Biofarmacêutica (SCB). Os fármacos selecionados foram listados quanto à sua permeabilidade em jejuno humano (Peff) e em cultura de células Caco-2, além de Fração de Absorção (FA%) em humanos. Para o estudo das variáveis da técnica de PAMPA, a ferramenta de Desenho de Experimentos (DOE) foi utilizada e as seguintes condições de ensaio foram exploradas: gradiente de pH do meio do compartimento doador, presença ou ausência de ácido glicocólico no meio do compartimento receptor, variação do tempo de incubação, presença ou ausência de agitação das placas durante a incubação e variação da composição lipídica da membrana artificial. A combinação fatorial completa das condições de ensaio a serem exploradas resultou em 96 experimentos, os quais foram executados em triplicata. Os resultados obtidos apontaram que as variações do pH do meio do compartimento doador, do tempo de incubação e da composição do meio do compartimento receptor foram as condições do ensaio de PAMPA que mais impactaram a permeabilidade dos fármacos. Os resultados obtidos nos 96 experimentos do DOE foram relacionados, a partir de regressão linear, com os parâmetros fisico-químicos e dados de permeabilidade dos fármacos do estudo. O experimento de DOE que apresentou melhor correlação com os dados de permeabilidade em jejuno humano para os fármacos contemplados neste estudo teve um R2=0,858. As condições de ensaio consideradas para este experimento foram: pH 4,5 no compartimento doador, incubação de 15 horas, ausência de agitação das placas, membrana composta por fosfatidilcolina 10% (p/v) e colesterol 0,5% (p/v) e presença de ácido glicocólico 0,5% (p/v) no compartimento receptor. Dentre as propriedades físico-químicas, o PM, PSA e VM foram propriedades comuns a grupos de fármacos cuja permeabilidade foi favorecida pelas mesmas condições de ensaio de PAMPA. Os maiores valores de permeabilidade em PAMPA foram obtidos para fármacos com Peff entre 1 e 2 *10-4 cm/s, permeabilidade em células Caco-2 entre 20 e 27 *10-6 cm/s, faixa de logP entre 0 e 3 além de PM abaixo de 300 Da e PSA abaixo de 90Å2. / The permeability access is a critical step when defining the route of administration of a drug, besides from being one of the parameters considered for selecting the best candidates during the initial stages of new molecules discovery. For this reason, there is a need to implement high capacity and low cost models, which have a high correlation with in vivo permeability. Several in vitro models have been described for the studies of permeability, but the lack of standardization of protocols is still evident. Parallel Artificial Membrane Permeability Assay (PAMPA) is fast and simple and can be easily incorporated into the routine of a laboratory. Nevertheless, it has shown excellent correlation with in vitro models when evaluating the permeability of drugs that are transported primarily by passive transcellular route. The aim of this project was to investigate the influence of key variables of PAMPA on the permeability of drugs. Therefore, nine drugs with different physicochemical characteristics were selected based on the following criteria: lipophilicity (logP), Polar Surface Area (PSA), Molecular Volume (MV), pKa, Molecular Weight (MW), number of Hydrogen Bond Donors (HBD) and Biopharmaceutical Classification System (BCS). In addition, the drugs were listed for their permeability in human jejunum, Caco-2 and Fraction of Absorption (FA%) in humans. Design of Experiments (DOE) was considered to plan the PAMPA experiments, and the following assay conditions were explored: pH gradient in the donor compartment, glycocholic acid presence or absence in the acceptor compartment, variations in the incubation time, presence or absence of plate agitation and variations in the lipid composition of the artificial membranes. Full factorial combination of the assay variables resulted in 96 experiments, which were performed in triplicate. The results showed that the pH of the donor compartment, the incubation time and acceptor compartment composition were the assay conditions which most impacted the PAMPA results of drugs. The 96 DOE experiments results were then correlated, by linear regression, with both the physic-chemical and permeability data of the selected drugs. The DOE experiment that showed the best correlation with the permeability in human jejunum (R2 = 0.858) for the drugs included in this study had the following test conditions: pH 4.0 in the donor compartment, incubation of 15 hours, without plate agitation, artificial membrane composed of phosphatidylcholine 10% (w/v) and cholesterol 0.5% (w/v) in dodecane and presence of glycocholic acid 0.5% (w/v) in the receptor compartment. Among the studied physicochemical properties, the molecular weight (MW), polar surface area (PSA) and molecular volume (VM) were the best drivers for determining PAMPA most suitable assay conditions. The highest PAMPA values were obtained for drugs with Peff between 1 and 2 *10-4 cm/s and Caco-2 permeability between 20 and 27 *10-6 cm/s, besides from logP between 0 and 3, MW below 300 Da and PSA below 90Å2.

Nanoemulsões catiônicas têm sido recentemente propostas como sistemas carreadores de DNA. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a influência de diferentes fosfolipídeos sobre propriedades dos complexos formados entre nanoemulsões e pDNA (pTracerTMCMV2). Em uma primeira etapa, nanoemulsões catiônicas constituídas de triglicerídeos de cadeia média, estearilamina, lecitina de gema de ovo ou fosfolipídeos isolados (DSPC, DOPC, DSPE ou DOPE), glicerol e água foram preparadas através do procedimento de emulsificação espontânea. Independente do tipo de fosfolipídeo empregado, esse procedimento conduziu à obtenção de nanoemulsões catiônicas monodispersas com diâmetro de gotícula e potencial zeta de cerca de 250 nm e +50 mV, respectivamente. A complexação do pDNA com as nanoemulsões catiônicas, avaliada através do retardamento de migração do pDNA em gel de agarose por eletroforese, foi total quando o complexo apresenta uma relação de cargas [+/-] ≥ 1,0. Nestas condições, os complexos formados foram protegidos da degradação pela enzima DNase I. Em uma segunda etapa, a citotoxicidade das nanoemulsões e dos complexos com o pDNA sobre células Hep G2 foi avaliada, através do ensaio de MTT. Os resultados obtidos demonstraram que a adição de quantidades crescentes das nanoemulsões, conduz a uma toxicidade progressiva sobre as células, independente do pH do meio. Dentre as formulações estudadas, aquelas estabilizadas pelos fosfolipídeos DSPC e DSPE, de elevada temperatura de transição de fases, foram marcadamente menos tóxicas, em comparação com as formulações obtidas com lecitina, DOPC e DOPE. Essa mesma tendência foi detectada para os complexos formados com o pDNA. Em uma última etapa, foi realizado um estudo preliminar de transferência gênica em células Hep G2, utilizando a técnica de PCR em tempo real. Dentre as diferentes formulações testadas, a maior quantidade de DNA de GFP detectada parece ser para a formulação obtida com o fosfolipídeo DSPC, ilustrando as potencialidades de uso das nanoemulsões desenvolvidas como reagentes de transfecção de pDNA em células Hep G2. Em conclusão, o conjunto dos resultados obtidos demonstra o efeito dos fosfolipídeos empregados sobre propriedades físico-químicas, complexação, estabilidade, citotoxicidade e transfecção de nanoemulsões catiônicas como sistemas carreadores de pDNA. / Cationic nanoemulsions have been recently considered as potential delivery systems for DNA. The aim of the present work was to evaluate the influence of different phospholipids on the properties of complexes formed between nanoemulsions and pDNA (pTracerTM-CMV2). First, cationic nanoemulsions composed of medium chain triglycerides, stearlyamine, egg lecithin or isolated phospholipids (DSPC, DOPC, DSPE or DOPE), glycerol and water were prepared through spontaneous emulsification process. Independently of the type of phospholipid used this procedure results in monodisperses cationic nanoemulsions with droplet size and zeta potential of about 250 nm and +50 mV, respectively. The complexation of pDNA with cationic nanoemulsions, analyzed by agarose gel retardation assay was total when the complex possesses a charge relation [+/-] ≥ 1.0. In these conditions the complexes were protected from enzymatic degradation by DNase I. After that, the cytotoxicity of the nanoemulsion and the complexes with pDNA in Hep G2 cells was evaluated through MTT assay. The results showed that the addition of increasing amount of nanoemulsion leads to a progressive toxicity on the cells independently of the media’s pH. Among the studied formulations the ones stabilized with the phospholipids DSPC and DSPE, that have elevated phase transition temperatures, were much less cytotoxic in comparison with the formulations obtained with lecithin, DOPC and DOPE. This same trend was detected for the complexes formed with pDNA. Finally a preliminary study of gene transfer to Hep G2 cells was performed using real-time PCR technique. Among the different formulations tested, the major quantity of reporter DNA detected seems to be for the formulation obtained with the DSPC phospholipid. This shows the potentialities of the use of nanoemulsions as transfection reagents of pDNA in Hep G2 cells. In conclusion, the overall results show the effect of the phospholipids on physicochemical properties, complexation, stability, cytotoxicity and transfection of cationic nanoemulsions as delivery systems for pDNA.

Nanoemulsões catiônicas têm sido recentemente propostas como sistemas carreadores de DNA. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a influência de diferentes fosfolipídeos sobre propriedades dos complexos formados entre nanoemulsões e pDNA (pTracerTMCMV2). Em uma primeira etapa, nanoemulsões catiônicas constituídas de triglicerídeos de cadeia média, estearilamina, lecitina de gema de ovo ou fosfolipídeos isolados (DSPC, DOPC, DSPE ou DOPE), glicerol e água foram preparadas através do procedimento de emulsificação espontânea. Independente do tipo de fosfolipídeo empregado, esse procedimento conduziu à obtenção de nanoemulsões catiônicas monodispersas com diâmetro de gotícula e potencial zeta de cerca de 250 nm e +50 mV, respectivamente. A complexação do pDNA com as nanoemulsões catiônicas, avaliada através do retardamento de migração do pDNA em gel de agarose por eletroforese, foi total quando o complexo apresenta uma relação de cargas [+/-] ≥ 1,0. Nestas condições, os complexos formados foram protegidos da degradação pela enzima DNase I. Em uma segunda etapa, a citotoxicidade das nanoemulsões e dos complexos com o pDNA sobre células Hep G2 foi avaliada, através do ensaio de MTT. Os resultados obtidos demonstraram que a adição de quantidades crescentes das nanoemulsões, conduz a uma toxicidade progressiva sobre as células, independente do pH do meio. Dentre as formulações estudadas, aquelas estabilizadas pelos fosfolipídeos DSPC e DSPE, de elevada temperatura de transição de fases, foram marcadamente menos tóxicas, em comparação com as formulações obtidas com lecitina, DOPC e DOPE. Essa mesma tendência foi detectada para os complexos formados com o pDNA. Em uma última etapa, foi realizado um estudo preliminar de transferência gênica em células Hep G2, utilizando a técnica de PCR em tempo real. Dentre as diferentes formulações testadas, a maior quantidade de DNA de GFP detectada parece ser para a formulação obtida com o fosfolipídeo DSPC, ilustrando as potencialidades de uso das nanoemulsões desenvolvidas como reagentes de transfecção de pDNA em células Hep G2. Em conclusão, o conjunto dos resultados obtidos demonstra o efeito dos fosfolipídeos empregados sobre propriedades físico-químicas, complexação, estabilidade, citotoxicidade e transfecção de nanoemulsões catiônicas como sistemas carreadores de pDNA. / Cationic nanoemulsions have been recently considered as potential delivery systems for DNA. The aim of the present work was to evaluate the influence of different phospholipids on the properties of complexes formed between nanoemulsions and pDNA (pTracerTM-CMV2). First, cationic nanoemulsions composed of medium chain triglycerides, stearlyamine, egg lecithin or isolated phospholipids (DSPC, DOPC, DSPE or DOPE), glycerol and water were prepared through spontaneous emulsification process. Independently of the type of phospholipid used this procedure results in monodisperses cationic nanoemulsions with droplet size and zeta potential of about 250 nm and +50 mV, respectively. The complexation of pDNA with cationic nanoemulsions, analyzed by agarose gel retardation assay was total when the complex possesses a charge relation [+/-] ≥ 1.0. In these conditions the complexes were protected from enzymatic degradation by DNase I. After that, the cytotoxicity of the nanoemulsion and the complexes with pDNA in Hep G2 cells was evaluated through MTT assay. The results showed that the addition of increasing amount of nanoemulsion leads to a progressive toxicity on the cells independently of the media’s pH. Among the studied formulations the ones stabilized with the phospholipids DSPC and DSPE, that have elevated phase transition temperatures, were much less cytotoxic in comparison with the formulations obtained with lecithin, DOPC and DOPE. This same trend was detected for the complexes formed with pDNA. Finally a preliminary study of gene transfer to Hep G2 cells was performed using real-time PCR technique. Among the different formulations tested, the major quantity of reporter DNA detected seems to be for the formulation obtained with the DSPC phospholipid. This shows the potentialities of the use of nanoemulsions as transfection reagents of pDNA in Hep G2 cells. In conclusion, the overall results show the effect of the phospholipids on physicochemical properties, complexation, stability, cytotoxicity and transfection of cationic nanoemulsions as delivery systems for pDNA.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-10-18T17:05:09Z No. of bitstreams: 1 Marcos Soares Vieira.Atividades das paraoxanase... 2013.pdf: 1230050 bytes, checksum: 912c1ef5707ad9fba3fa861c29a41e7e (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-18T17:05:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marcos Soares Vieira.Atividades das paraoxanase... 2013.pdf: 1230050 bytes, checksum: 912c1ef5707ad9fba3fa861c29a41e7e (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Doenças cardiovasculares (DCV) são as principais causas de morbidade e mortalidade do ocidente, aparecendo como causa mais frequente de óbitos nos países desenvolvidos e em desenvolvimento. Alterações no metabolismo das lipoproteínas estão diretamente relacionadas ao aumento do risco de DCV. Objetivos: Avaliar o remodelamento da partícula HDL determinando a capacidade de incorporação de fosfolipídeos na HDL, a atividade da paraoxonase/aril-esterase (PON), dentre outros marcadores plasmáticos relacionados ao metabolismo da HDL, além da influência da hipertrigliceridemia neste processo. Casuística e Métodos: Estudo de corte transversal, com amostragem por conveniência. Foram avaliados ambulatorialmente 66 indivíduos do sexo masculino, idade entre 32 e 75 anos (média: 51,1), distribuídos em dois grupos, não-hipertrigliceridêmicos (NHipTRI) e hipertrigliceridêmicos (HipTRI), estes últimos estratificados em dois níveis, HipTRI HDL-C≥40 e HipTRI HDL-C<40. Foram realizados testes estatísticos paramétricos e não-paramétricos, utilizando o software GraphPad Prism 5.01 (USA), e as diferenças foram consideradas significantes quando p<0,05 para intervalo de confiança de 95%. Resultados: Não foram observadas diferenças nas prevalências dos fatores de risco para DCV, como sedentarismo, etilismo, hipertensão, diabetes e tabagismo, entre os grupos. A atividade da PON e a incorporação de fosfolipídeos foram similares nos três grupos estudados. O tamanho estimado da partícula HDL foi maior no grupo NHipTRI (0,29±0,05), do que nos grupos hipertrigliceridemicos: HipTRI HDL ≥40 (0,26±0,03), e HipTRI HDL<40 (0,24±0,05). No grupo NHipTRI foi encontrada correlação linear positiva entre a atividade da PON e apoA (r=0,3908, p=0,0484, Pearson). Já no grupo HipTRI HDL≥40 houve correlação positiva entre PON e apoB (r=0,5678, p=0,0342, Pearson). Por outro lado, no grupo HipTRI HDL<40 houve correlação linear negativa entre apoB e incorporação de fosfolipídeos na HDL (r=-0,5144, p=0,0290, Pearson). Conclusão: Desta forma, os resultados sugerem que a hipertrigliceridemia interfere não só no remodelamento da HDL, como também sua capacidade antioxidante. / Cardiovascular diseases (CVD) are the leading causes of morbidity and mortality in the western world and is the major cause of death in developed and developing countries. Lipoprotein metabolism is directly related to the risk of developing CVD. Objectives: this study aimed to evaluate HDL particle remodeling, determining HDL ability to incorporate phospholipids, paraoxonase (PON) activity, among others plasma markers related to HDL metabolism, besides the influence of hypertriglyceridemia in this process. Casuistic and Methods: a cross-sectional study with convenience sampling, were carried out with 66 subjects outpatient males, aged between 32 and 75 years old (mean: 51.1), into nonhypertriglyceridemic (NHipTRI) and hypertriglyceridemic (HipTRI) groups, the HipTRI group were stratified in HipTRI com HDL-C ≥ 40 mg/dL and HipTRI com HDL-C <40 mg/dL. Parametric and non-parametric statistic tests were performed in GraphPad Prism 5.01 (USA), and differences were considered significant when p <0.05 to C.I of 95%. Results: there were no differences in the prevalence of CVD risk factors, such as sedentarism, alcohol drinkers, hypertension, diabetes, and tobacco users in the groups. PON activity and phospholipids incorporation were similar in the three groups. The estimated size of HDL particles was greater in NHipTRI (0.29 ± 0.05) when compared to hypertriglyceridemic groups: HipTRI HDL≥40 mg/dL (0.26 ± 0.03) and HipTRI HDL>40 mg/dL (0.24 ± 0.05). In NHipTRI group positive linear correlation was found between PON activity and apoA (r = 0.3908, p = 0.0484, Pearson). In HipTRI HDL≥40 mg/dL group, positive correlation were found between PON and apoB (r = 0.5678, p = 0.0342, Pearson). On the other hand, HipTRI HDL<40 mg/dL shows a negative linear correlation between apoB and phospholipids incorporation into HDL (r = -0.5144, p = 0.0290, Pearson). Conclusion: the results suggest that hypertriglyceridemia can affect both remodeling of particles HDL, as their antioxidant capacity.