Os elementos transponíveis são conhecidos por possuírem a fascinante propriedade de mudarem de local dentro do genoma de suas espécies hospedeiras e mesmo de serem capazes de atravessar barreiras interespecíficas, invadindo novos genomas. Neste estudo, uma nova família de elementos transponíveis, denominada harrow, é descrita para a Superfamília hAT. Buscas por seqüências harrow foram realizadas em 65 espécies de Drosophilidae, sendo que a maior parte dessas espécies pertence a grupos Neotropicais do gênero Drosophila ou é cosmopolita. As seqüências harrow encontradas apresentam distribuições descontínuas ao longo do gênero Drosophila e apresentam altas similaridades entre si, inconsistentes com os tempos de divergência das espécies hospedeiras. Além disso, incongruências topológicas foram encontradas entre as filogenias de harrow e das espécies hospedeiras. Os resultados obtidos no presente estudo indicam que harrow provavelmente invadiu os genomas de seus hospedeiros por múltiplos eventos de transferência horizontal, os quais devem ter ocorrido entre espécies dos Trópicos do Novo Mundo. Estes resultados reforçam a visão de que eventos de transferências horizontais entre eucariotos são mais comuns do que se previa anteriormente. / Transposable elements are known for their amazing properties of moving from one place to another inside the genome of their host species, as well as, for their ability to cross species boundaries, invading new genomes. In this study, a new family of transposable elements, harrow, is described for the hAT Superfamily of DNA transposons. Searches for harrow sequences were conducted in 65 Drosophilidae species, mainly representing Neotropical and cosmopolitan group species from genus Drosophila. The obtained harrow sequences show a patchy distribution along the genus Drosophila and present high sequence similarities, which are inconsistent with the divergence times of the host species. Additionally, topological incongruities were found between harrow and host species phylogenies. The results obtained in this study indicate that harrow has probably invaded its host genomes through multiple horizontal transfer events, which should have occurred in Neotropical regions. These results support the growing view that horizontal transfers between eukaryotes are more common than they have been thought before.

Os elementos transponíveis são conhecidos por possuírem a fascinante propriedade de mudarem de local dentro do genoma de suas espécies hospedeiras e mesmo de serem capazes de atravessar barreiras interespecíficas, invadindo novos genomas. Neste estudo, uma nova família de elementos transponíveis, denominada harrow, é descrita para a Superfamília hAT. Buscas por seqüências harrow foram realizadas em 65 espécies de Drosophilidae, sendo que a maior parte dessas espécies pertence a grupos Neotropicais do gênero Drosophila ou é cosmopolita. As seqüências harrow encontradas apresentam distribuições descontínuas ao longo do gênero Drosophila e apresentam altas similaridades entre si, inconsistentes com os tempos de divergência das espécies hospedeiras. Além disso, incongruências topológicas foram encontradas entre as filogenias de harrow e das espécies hospedeiras. Os resultados obtidos no presente estudo indicam que harrow provavelmente invadiu os genomas de seus hospedeiros por múltiplos eventos de transferência horizontal, os quais devem ter ocorrido entre espécies dos Trópicos do Novo Mundo. Estes resultados reforçam a visão de que eventos de transferências horizontais entre eucariotos são mais comuns do que se previa anteriormente. / Transposable elements are known for their amazing properties of moving from one place to another inside the genome of their host species, as well as, for their ability to cross species boundaries, invading new genomes. In this study, a new family of transposable elements, harrow, is described for the hAT Superfamily of DNA transposons. Searches for harrow sequences were conducted in 65 Drosophilidae species, mainly representing Neotropical and cosmopolitan group species from genus Drosophila. The obtained harrow sequences show a patchy distribution along the genus Drosophila and present high sequence similarities, which are inconsistent with the divergence times of the host species. Additionally, topological incongruities were found between harrow and host species phylogenies. The results obtained in this study indicate that harrow has probably invaded its host genomes through multiple horizontal transfer events, which should have occurred in Neotropical regions. These results support the growing view that horizontal transfers between eukaryotes are more common than they have been thought before.

Os elementos transponíveis são conhecidos por possuírem a fascinante propriedade de mudarem de local dentro do genoma de suas espécies hospedeiras e mesmo de serem capazes de atravessar barreiras interespecíficas, invadindo novos genomas. Neste estudo, uma nova família de elementos transponíveis, denominada harrow, é descrita para a Superfamília hAT. Buscas por seqüências harrow foram realizadas em 65 espécies de Drosophilidae, sendo que a maior parte dessas espécies pertence a grupos Neotropicais do gênero Drosophila ou é cosmopolita. As seqüências harrow encontradas apresentam distribuições descontínuas ao longo do gênero Drosophila e apresentam altas similaridades entre si, inconsistentes com os tempos de divergência das espécies hospedeiras. Além disso, incongruências topológicas foram encontradas entre as filogenias de harrow e das espécies hospedeiras. Os resultados obtidos no presente estudo indicam que harrow provavelmente invadiu os genomas de seus hospedeiros por múltiplos eventos de transferência horizontal, os quais devem ter ocorrido entre espécies dos Trópicos do Novo Mundo. Estes resultados reforçam a visão de que eventos de transferências horizontais entre eucariotos são mais comuns do que se previa anteriormente. / Transposable elements are known for their amazing properties of moving from one place to another inside the genome of their host species, as well as, for their ability to cross species boundaries, invading new genomes. In this study, a new family of transposable elements, harrow, is described for the hAT Superfamily of DNA transposons. Searches for harrow sequences were conducted in 65 Drosophilidae species, mainly representing Neotropical and cosmopolitan group species from genus Drosophila. The obtained harrow sequences show a patchy distribution along the genus Drosophila and present high sequence similarities, which are inconsistent with the divergence times of the host species. Additionally, topological incongruities were found between harrow and host species phylogenies. The results obtained in this study indicate that harrow has probably invaded its host genomes through multiple horizontal transfer events, which should have occurred in Neotropical regions. These results support the growing view that horizontal transfers between eukaryotes are more common than they have been thought before.

As células-tronco mesenquimais (MSC) são caracterizadas pelo seu potencial de diferenciação em células de origem mesenquimal como adipócitos, condrócitos e osteócitos; ação parácrina; capacidade imunorregulatória e tropismo por regiões lesionadas e câncer. Estas células já foram isoladas de diferentes órgãos e tecidos e apresentam características bastante similares, mas não idênticas: fato que ressalta a importância da realização de estudos comparativos para determinar a real equivalência das MSC de diferentes origens. Os principais objetivos deste trabalho foram analisar o potencial de transferência gênica mediado por lipofectamine 2000, detectar e quantificar a expressão dos fatores de pluripotência Oct4, Klf4, Sox2, c-Myc, Lin28, Tcl-1α, Nanog e comparar a eficiência de reprogramação celular em MSC murinas provenientes de medula óssea (moMSC), tecido adiposo (ADSC), rim (rMSC), pulmão (pMSC), veia cava (cMSC) e medula espinhal (meMSC). Estas células também foram classificadas com relação ao tempo de cultivo, sendo subdivididas em: Cultivo Inicial (até passagem 7), Cultivo Intermediário (da passagem 8 a 12) e Cultivo Tardio (a partir da passagem 13). No que se refere à transfecção usando lipofectamine 2000, foi observada maior eficiência em pMSC e rMSC quando comparadas a cMSC, todas em passagem tardia. Neste trabalho é mostrada a expressão de Klf4, Sox2, Lin28 e c- Myc em MSC murinas isoladas de pulmão, rim, tecido adiposo e medula espinhal. Lin28 foi detectado apenas no estágio inicial do cultivo de pMSC e ADSC e intermediário de rMSC. Enquanto que nas meMSC, Lin28 e Sox2 parecem diminuir com o tempo de cultivo chegando a zero no cultivo tardio. Não foi detectada a expressão de Oct4, Nanog ou Tcl-1α. Um dado muito expressivo é a reprogramação de moMSC apenas com OCT4 e SOX2 quando é utilizado o co-cultivo com fibroblastos embrionários 15 murinos (MEF). Aqui também pode ser visto que existe uma relação direta entre eficiência de geração de iPSC e o tempo de substituição das condições de cultivo nos dois tempos testados. Quando o co-cultivo em MEF é substituído por placas recobertas por gelatina e meio mESC induzido, não é observada a reprogramação apenas com dois fatores, sendo obrigatória a adição de c-MYC ou KLF4. pMSC apresentou maior número de iPSC quando comparado aos demais, seguida de moMSC e rMSC. Não detectamos reprogramação em ADSC. Outra variação observada foi que as moMSC reprogramam mais rapidamente (dia 8), sendo seguidas pelas pMSC (dia 10) e pelas rMSC (dia 16). O potencial de utilização das MSC na terapia gênica ex vivo e na reprogramação celular é variável e possivelmente está associado ao local de onde estas células são isoladas, além do estágio de cultivo. Ainda assim, muitos estudos ainda precisam ser realizados para estipular de forma exata a colaboração que cada MSC pode oferecer para o uso clínico. / The Mesenchymal Stem Cells (MSC) are characterized by their potential to differentiate into cells of mesenchymal origin such as adipocytes, chondrocytes and osteocytes; paracrine action; immunoregulatory capacity and tropism for injured regions and cancer. These cells have been isolated from different tissues and organs and exhibit similar characteristics, but are not identical: a fact that highlights the importance of comparative studies to determine the real equivalence of MSC from different sources. The objectives of this study were to analyze the potential of gene transfer mediated by Lipofectamine 2000; detect and quantify the expression of pluripotency factors Oct4, Klf4, Sox2, c-Myc, Lin28, Tcl-1α, Nanog and compare the efficiency of reprogramming in murine MSC isolated from bone marrow (moMSC), adipose tissue (ADSC), kidney (rMSC), lung (PMSC), vena cava (cMSC) and spinal cord (meMSC). These cells were classified according to time of cultivation, subdivided in: Recent Cultivation (up to passage 7), Cultivation Intermediate (passage 8 to 12) and Late Cultivation (from passage 13). Regarding transfection using Lipofectamine 2000, higher efficiency was achieved in PMSC and rMSC compared to cMSC, all in late passage. In this work we show the expression of Klf4, Sox2, c-Myc and Lin28 in MSC isolated from murine lung, kidney, adipose tissue and spinal cord. Lin28 was detected only in the early stage of cultivation in pMSC and ADSC and intermediate cultivation in rMSC. In meMSC, the expression of Lin28 and Sox2 appears to decrease with time not being detected in late cultivation. We did not detect the expression of Oct4, Nanog or Tcl-1α in any sample studied. A very important finding was the reprogramming of moMSC with only OCT4 and SOX2 when it was co-culture on murine embryonic fibroblasts (MEF). In this study was detected a direct relationship between efficiency of iPSC generation and the time of replacement of culture conditions, considering the times tested; 3 or 5 days post transduction. When the co-cultivation on MEF was replaced by plates coated with gelatin and induced medium is not observed with only two reprogramming factors, being required the addition of KLF4 or c-MYC. Comparing the efficiency of reprogramation between MSC, pMSC showed higher number of iPSC when compared to the others, followed by moMSC and rMSC. There was not detected cell reprogramming in ADSC. Another variation observed was in the reprogramming time. The moMSC reprogram faster (8 days), being followed by the pMSC (day 10) and the rMSC (day 16). The potential use of MSC in ex vivo gene therapy and cellular reprogramming is variable and may be associated with the location from which these cells are isolated, beyond the stage of cultivation. However, further studies are necessary to accurately stipulate the clinical use for each MSC.

As células-tronco mesenquimais (MSC) são caracterizadas pelo seu potencial de diferenciação em células de origem mesenquimal como adipócitos, condrócitos e osteócitos; ação parácrina; capacidade imunorregulatória e tropismo por regiões lesionadas e câncer. Estas células já foram isoladas de diferentes órgãos e tecidos e apresentam características bastante similares, mas não idênticas: fato que ressalta a importância da realização de estudos comparativos para determinar a real equivalência das MSC de diferentes origens. Os principais objetivos deste trabalho foram analisar o potencial de transferência gênica mediado por lipofectamine 2000, detectar e quantificar a expressão dos fatores de pluripotência Oct4, Klf4, Sox2, c-Myc, Lin28, Tcl-1α, Nanog e comparar a eficiência de reprogramação celular em MSC murinas provenientes de medula óssea (moMSC), tecido adiposo (ADSC), rim (rMSC), pulmão (pMSC), veia cava (cMSC) e medula espinhal (meMSC). Estas células também foram classificadas com relação ao tempo de cultivo, sendo subdivididas em: Cultivo Inicial (até passagem 7), Cultivo Intermediário (da passagem 8 a 12) e Cultivo Tardio (a partir da passagem 13). No que se refere à transfecção usando lipofectamine 2000, foi observada maior eficiência em pMSC e rMSC quando comparadas a cMSC, todas em passagem tardia. Neste trabalho é mostrada a expressão de Klf4, Sox2, Lin28 e c- Myc em MSC murinas isoladas de pulmão, rim, tecido adiposo e medula espinhal. Lin28 foi detectado apenas no estágio inicial do cultivo de pMSC e ADSC e intermediário de rMSC. Enquanto que nas meMSC, Lin28 e Sox2 parecem diminuir com o tempo de cultivo chegando a zero no cultivo tardio. Não foi detectada a expressão de Oct4, Nanog ou Tcl-1α. Um dado muito expressivo é a reprogramação de moMSC apenas com OCT4 e SOX2 quando é utilizado o co-cultivo com fibroblastos embrionários 15 murinos (MEF). Aqui também pode ser visto que existe uma relação direta entre eficiência de geração de iPSC e o tempo de substituição das condições de cultivo nos dois tempos testados. Quando o co-cultivo em MEF é substituído por placas recobertas por gelatina e meio mESC induzido, não é observada a reprogramação apenas com dois fatores, sendo obrigatória a adição de c-MYC ou KLF4. pMSC apresentou maior número de iPSC quando comparado aos demais, seguida de moMSC e rMSC. Não detectamos reprogramação em ADSC. Outra variação observada foi que as moMSC reprogramam mais rapidamente (dia 8), sendo seguidas pelas pMSC (dia 10) e pelas rMSC (dia 16). O potencial de utilização das MSC na terapia gênica ex vivo e na reprogramação celular é variável e possivelmente está associado ao local de onde estas células são isoladas, além do estágio de cultivo. Ainda assim, muitos estudos ainda precisam ser realizados para estipular de forma exata a colaboração que cada MSC pode oferecer para o uso clínico. / The Mesenchymal Stem Cells (MSC) are characterized by their potential to differentiate into cells of mesenchymal origin such as adipocytes, chondrocytes and osteocytes; paracrine action; immunoregulatory capacity and tropism for injured regions and cancer. These cells have been isolated from different tissues and organs and exhibit similar characteristics, but are not identical: a fact that highlights the importance of comparative studies to determine the real equivalence of MSC from different sources. The objectives of this study were to analyze the potential of gene transfer mediated by Lipofectamine 2000; detect and quantify the expression of pluripotency factors Oct4, Klf4, Sox2, c-Myc, Lin28, Tcl-1α, Nanog and compare the efficiency of reprogramming in murine MSC isolated from bone marrow (moMSC), adipose tissue (ADSC), kidney (rMSC), lung (PMSC), vena cava (cMSC) and spinal cord (meMSC). These cells were classified according to time of cultivation, subdivided in: Recent Cultivation (up to passage 7), Cultivation Intermediate (passage 8 to 12) and Late Cultivation (from passage 13). Regarding transfection using Lipofectamine 2000, higher efficiency was achieved in PMSC and rMSC compared to cMSC, all in late passage. In this work we show the expression of Klf4, Sox2, c-Myc and Lin28 in MSC isolated from murine lung, kidney, adipose tissue and spinal cord. Lin28 was detected only in the early stage of cultivation in pMSC and ADSC and intermediate cultivation in rMSC. In meMSC, the expression of Lin28 and Sox2 appears to decrease with time not being detected in late cultivation. We did not detect the expression of Oct4, Nanog or Tcl-1α in any sample studied. A very important finding was the reprogramming of moMSC with only OCT4 and SOX2 when it was co-culture on murine embryonic fibroblasts (MEF). In this study was detected a direct relationship between efficiency of iPSC generation and the time of replacement of culture conditions, considering the times tested; 3 or 5 days post transduction. When the co-cultivation on MEF was replaced by plates coated with gelatin and induced medium is not observed with only two reprogramming factors, being required the addition of KLF4 or c-MYC. Comparing the efficiency of reprogramation between MSC, pMSC showed higher number of iPSC when compared to the others, followed by moMSC and rMSC. There was not detected cell reprogramming in ADSC. Another variation observed was in the reprogramming time. The moMSC reprogram faster (8 days), being followed by the pMSC (day 10) and the rMSC (day 16). The potential use of MSC in ex vivo gene therapy and cellular reprogramming is variable and may be associated with the location from which these cells are isolated, beyond the stage of cultivation. However, further studies are necessary to accurately stipulate the clinical use for each MSC.

As células-tronco mesenquimais (MSC) são caracterizadas pelo seu potencial de diferenciação em células de origem mesenquimal como adipócitos, condrócitos e osteócitos; ação parácrina; capacidade imunorregulatória e tropismo por regiões lesionadas e câncer. Estas células já foram isoladas de diferentes órgãos e tecidos e apresentam características bastante similares, mas não idênticas: fato que ressalta a importância da realização de estudos comparativos para determinar a real equivalência das MSC de diferentes origens. Os principais objetivos deste trabalho foram analisar o potencial de transferência gênica mediado por lipofectamine 2000, detectar e quantificar a expressão dos fatores de pluripotência Oct4, Klf4, Sox2, c-Myc, Lin28, Tcl-1α, Nanog e comparar a eficiência de reprogramação celular em MSC murinas provenientes de medula óssea (moMSC), tecido adiposo (ADSC), rim (rMSC), pulmão (pMSC), veia cava (cMSC) e medula espinhal (meMSC). Estas células também foram classificadas com relação ao tempo de cultivo, sendo subdivididas em: Cultivo Inicial (até passagem 7), Cultivo Intermediário (da passagem 8 a 12) e Cultivo Tardio (a partir da passagem 13). No que se refere à transfecção usando lipofectamine 2000, foi observada maior eficiência em pMSC e rMSC quando comparadas a cMSC, todas em passagem tardia. Neste trabalho é mostrada a expressão de Klf4, Sox2, Lin28 e c- Myc em MSC murinas isoladas de pulmão, rim, tecido adiposo e medula espinhal. Lin28 foi detectado apenas no estágio inicial do cultivo de pMSC e ADSC e intermediário de rMSC. Enquanto que nas meMSC, Lin28 e Sox2 parecem diminuir com o tempo de cultivo chegando a zero no cultivo tardio. Não foi detectada a expressão de Oct4, Nanog ou Tcl-1α. Um dado muito expressivo é a reprogramação de moMSC apenas com OCT4 e SOX2 quando é utilizado o co-cultivo com fibroblastos embrionários 15 murinos (MEF). Aqui também pode ser visto que existe uma relação direta entre eficiência de geração de iPSC e o tempo de substituição das condições de cultivo nos dois tempos testados. Quando o co-cultivo em MEF é substituído por placas recobertas por gelatina e meio mESC induzido, não é observada a reprogramação apenas com dois fatores, sendo obrigatória a adição de c-MYC ou KLF4. pMSC apresentou maior número de iPSC quando comparado aos demais, seguida de moMSC e rMSC. Não detectamos reprogramação em ADSC. Outra variação observada foi que as moMSC reprogramam mais rapidamente (dia 8), sendo seguidas pelas pMSC (dia 10) e pelas rMSC (dia 16). O potencial de utilização das MSC na terapia gênica ex vivo e na reprogramação celular é variável e possivelmente está associado ao local de onde estas células são isoladas, além do estágio de cultivo. Ainda assim, muitos estudos ainda precisam ser realizados para estipular de forma exata a colaboração que cada MSC pode oferecer para o uso clínico. / The Mesenchymal Stem Cells (MSC) are characterized by their potential to differentiate into cells of mesenchymal origin such as adipocytes, chondrocytes and osteocytes; paracrine action; immunoregulatory capacity and tropism for injured regions and cancer. These cells have been isolated from different tissues and organs and exhibit similar characteristics, but are not identical: a fact that highlights the importance of comparative studies to determine the real equivalence of MSC from different sources. The objectives of this study were to analyze the potential of gene transfer mediated by Lipofectamine 2000; detect and quantify the expression of pluripotency factors Oct4, Klf4, Sox2, c-Myc, Lin28, Tcl-1α, Nanog and compare the efficiency of reprogramming in murine MSC isolated from bone marrow (moMSC), adipose tissue (ADSC), kidney (rMSC), lung (PMSC), vena cava (cMSC) and spinal cord (meMSC). These cells were classified according to time of cultivation, subdivided in: Recent Cultivation (up to passage 7), Cultivation Intermediate (passage 8 to 12) and Late Cultivation (from passage 13). Regarding transfection using Lipofectamine 2000, higher efficiency was achieved in PMSC and rMSC compared to cMSC, all in late passage. In this work we show the expression of Klf4, Sox2, c-Myc and Lin28 in MSC isolated from murine lung, kidney, adipose tissue and spinal cord. Lin28 was detected only in the early stage of cultivation in pMSC and ADSC and intermediate cultivation in rMSC. In meMSC, the expression of Lin28 and Sox2 appears to decrease with time not being detected in late cultivation. We did not detect the expression of Oct4, Nanog or Tcl-1α in any sample studied. A very important finding was the reprogramming of moMSC with only OCT4 and SOX2 when it was co-culture on murine embryonic fibroblasts (MEF). In this study was detected a direct relationship between efficiency of iPSC generation and the time of replacement of culture conditions, considering the times tested; 3 or 5 days post transduction. When the co-cultivation on MEF was replaced by plates coated with gelatin and induced medium is not observed with only two reprogramming factors, being required the addition of KLF4 or c-MYC. Comparing the efficiency of reprogramation between MSC, pMSC showed higher number of iPSC when compared to the others, followed by moMSC and rMSC. There was not detected cell reprogramming in ADSC. Another variation observed was in the reprogramming time. The moMSC reprogram faster (8 days), being followed by the pMSC (day 10) and the rMSC (day 16). The potential use of MSC in ex vivo gene therapy and cellular reprogramming is variable and may be associated with the location from which these cells are isolated, beyond the stage of cultivation. However, further studies are necessary to accurately stipulate the clinical use for each MSC.

O estudo de metodologias que possibilitem o acesso de moléculas terapêuticas ao cérebro evitando a barreira hematoencefálica (blood-brain barrier, BBB), é extremamente importante para o tratamento das doenças que afetam o sistema nervoso central. Os estudos se concentram na busca por vias seguras e pouco invasivas. Recentemente a via nasal tem mostrado resultados positivos na administração de fármacos ao sistema nervoso central de maneira segura, sugerindo a utilização desta via para a terapia gênica. Neste trabalho, foi estudada a administração intranasal de um vetor não viral, que codifica o gene da proteína verde fluorescente otimizada (enhanced green fluorescent proten, EGFP), diluído em água ou em solução de sulfato de zinco em camundongos adultos da linhagem BALB/c. Os resultados de RT-PCR mostraram que o vetor atingiu o cérebro em ambos tratamentos, e sua expressão foi mantida até 8 semanas após o tratamento. A expressão da EGPF em diferentes regiões cerebrais foi analisada 1, 2, 4 e 8 semanas após o tratamento, através de imunohistoquímica. Nossos resultados mostraram que um número muito pequeno de células foi transfectado em ambos tratamentos e que a freqüência destas células nas regiões cerebrais estudadas varia muito mesmo entre animais do mesmo grupo. O tratamento com sulfato de zinco não aumentou a eficiência do vetor. Os maiores números de células transfectadas encontradas foram no bulbo olfatório e hipocampos uma semana após o tratamento. Nossos resultados mostram pela primeira vez a expressão prolongada de um gene administrados pela via nasal no cérebro. / The investigation of methods that allow the access of therapeutic molecules to the brain, overcoming the blood-brain barrier (BBB), is of great importance for the treatment of diseases reaching the central nervous system. Studies concentrate mainly on the search for safer and less aggressive routes. Recent studies have suggested that pharmaceutical agents can reach the brain by the nasal route, that may thus be also appropriate for gene therapy. Here, we investigated brain targeting by intranasal administration of a plasmid vector (pREGFP) with the reporter gene EGFP, diluted in water or in a zinc sulfate/water solution, to adult BALB/c mice. Brain regions were examined by RT-PCR or immunohistochemistry 1, 2, 4 or 8 weeks after the treatment. RT-PCR results showed that the plasmid DNA reached the brain similarly with the two types of treatment. Expression of egfp was observed in all groups, and maintained even 8 weeks after treatment. Brain sections submitted to immunohistochemistry (IHC) were analyzed for the detection of EGFP-positive cells, that could be observed in brain samples from mice treated by intranasal administration of pREGFP. The frequency of EGFP-positive cells was very low, and presented great variation even among mice from the same experimental group. The supplementation of the transfection medium with zinc sulfate did not induce higher numbers of EGFP-positive cells. A higher frequency of these cells was observed in the olfactory bulb one week after treatment, and in the hippocampus as compared to other brain regions. Our results show for the first time the long-term expression of a gene carried by a nonviral vector to the central nervous system.

O estudo de metodologias que possibilitem o acesso de moléculas terapêuticas ao cérebro evitando a barreira hematoencefálica (blood-brain barrier, BBB), é extremamente importante para o tratamento das doenças que afetam o sistema nervoso central. Os estudos se concentram na busca por vias seguras e pouco invasivas. Recentemente a via nasal tem mostrado resultados positivos na administração de fármacos ao sistema nervoso central de maneira segura, sugerindo a utilização desta via para a terapia gênica. Neste trabalho, foi estudada a administração intranasal de um vetor não viral, que codifica o gene da proteína verde fluorescente otimizada (enhanced green fluorescent proten, EGFP), diluído em água ou em solução de sulfato de zinco em camundongos adultos da linhagem BALB/c. Os resultados de RT-PCR mostraram que o vetor atingiu o cérebro em ambos tratamentos, e sua expressão foi mantida até 8 semanas após o tratamento. A expressão da EGPF em diferentes regiões cerebrais foi analisada 1, 2, 4 e 8 semanas após o tratamento, através de imunohistoquímica. Nossos resultados mostraram que um número muito pequeno de células foi transfectado em ambos tratamentos e que a freqüência destas células nas regiões cerebrais estudadas varia muito mesmo entre animais do mesmo grupo. O tratamento com sulfato de zinco não aumentou a eficiência do vetor. Os maiores números de células transfectadas encontradas foram no bulbo olfatório e hipocampos uma semana após o tratamento. Nossos resultados mostram pela primeira vez a expressão prolongada de um gene administrados pela via nasal no cérebro. / The investigation of methods that allow the access of therapeutic molecules to the brain, overcoming the blood-brain barrier (BBB), is of great importance for the treatment of diseases reaching the central nervous system. Studies concentrate mainly on the search for safer and less aggressive routes. Recent studies have suggested that pharmaceutical agents can reach the brain by the nasal route, that may thus be also appropriate for gene therapy. Here, we investigated brain targeting by intranasal administration of a plasmid vector (pREGFP) with the reporter gene EGFP, diluted in water or in a zinc sulfate/water solution, to adult BALB/c mice. Brain regions were examined by RT-PCR or immunohistochemistry 1, 2, 4 or 8 weeks after the treatment. RT-PCR results showed that the plasmid DNA reached the brain similarly with the two types of treatment. Expression of egfp was observed in all groups, and maintained even 8 weeks after treatment. Brain sections submitted to immunohistochemistry (IHC) were analyzed for the detection of EGFP-positive cells, that could be observed in brain samples from mice treated by intranasal administration of pREGFP. The frequency of EGFP-positive cells was very low, and presented great variation even among mice from the same experimental group. The supplementation of the transfection medium with zinc sulfate did not induce higher numbers of EGFP-positive cells. A higher frequency of these cells was observed in the olfactory bulb one week after treatment, and in the hippocampus as compared to other brain regions. Our results show for the first time the long-term expression of a gene carried by a nonviral vector to the central nervous system.

O estudo de metodologias que possibilitem o acesso de moléculas terapêuticas ao cérebro evitando a barreira hematoencefálica (blood-brain barrier, BBB), é extremamente importante para o tratamento das doenças que afetam o sistema nervoso central. Os estudos se concentram na busca por vias seguras e pouco invasivas. Recentemente a via nasal tem mostrado resultados positivos na administração de fármacos ao sistema nervoso central de maneira segura, sugerindo a utilização desta via para a terapia gênica. Neste trabalho, foi estudada a administração intranasal de um vetor não viral, que codifica o gene da proteína verde fluorescente otimizada (enhanced green fluorescent proten, EGFP), diluído em água ou em solução de sulfato de zinco em camundongos adultos da linhagem BALB/c. Os resultados de RT-PCR mostraram que o vetor atingiu o cérebro em ambos tratamentos, e sua expressão foi mantida até 8 semanas após o tratamento. A expressão da EGPF em diferentes regiões cerebrais foi analisada 1, 2, 4 e 8 semanas após o tratamento, através de imunohistoquímica. Nossos resultados mostraram que um número muito pequeno de células foi transfectado em ambos tratamentos e que a freqüência destas células nas regiões cerebrais estudadas varia muito mesmo entre animais do mesmo grupo. O tratamento com sulfato de zinco não aumentou a eficiência do vetor. Os maiores números de células transfectadas encontradas foram no bulbo olfatório e hipocampos uma semana após o tratamento. Nossos resultados mostram pela primeira vez a expressão prolongada de um gene administrados pela via nasal no cérebro. / The investigation of methods that allow the access of therapeutic molecules to the brain, overcoming the blood-brain barrier (BBB), is of great importance for the treatment of diseases reaching the central nervous system. Studies concentrate mainly on the search for safer and less aggressive routes. Recent studies have suggested that pharmaceutical agents can reach the brain by the nasal route, that may thus be also appropriate for gene therapy. Here, we investigated brain targeting by intranasal administration of a plasmid vector (pREGFP) with the reporter gene EGFP, diluted in water or in a zinc sulfate/water solution, to adult BALB/c mice. Brain regions were examined by RT-PCR or immunohistochemistry 1, 2, 4 or 8 weeks after the treatment. RT-PCR results showed that the plasmid DNA reached the brain similarly with the two types of treatment. Expression of egfp was observed in all groups, and maintained even 8 weeks after treatment. Brain sections submitted to immunohistochemistry (IHC) were analyzed for the detection of EGFP-positive cells, that could be observed in brain samples from mice treated by intranasal administration of pREGFP. The frequency of EGFP-positive cells was very low, and presented great variation even among mice from the same experimental group. The supplementation of the transfection medium with zinc sulfate did not induce higher numbers of EGFP-positive cells. A higher frequency of these cells was observed in the olfactory bulb one week after treatment, and in the hippocampus as compared to other brain regions. Our results show for the first time the long-term expression of a gene carried by a nonviral vector to the central nervous system.

Nanoemulsões catiônicas têm sido recentemente propostas como sistemas carreadores de DNA. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a influência de diferentes fosfolipídeos sobre propriedades dos complexos formados entre nanoemulsões e pDNA (pTracerTMCMV2). Em uma primeira etapa, nanoemulsões catiônicas constituídas de triglicerídeos de cadeia média, estearilamina, lecitina de gema de ovo ou fosfolipídeos isolados (DSPC, DOPC, DSPE ou DOPE), glicerol e água foram preparadas através do procedimento de emulsificação espontânea. Independente do tipo de fosfolipídeo empregado, esse procedimento conduziu à obtenção de nanoemulsões catiônicas monodispersas com diâmetro de gotícula e potencial zeta de cerca de 250 nm e +50 mV, respectivamente. A complexação do pDNA com as nanoemulsões catiônicas, avaliada através do retardamento de migração do pDNA em gel de agarose por eletroforese, foi total quando o complexo apresenta uma relação de cargas [+/-] ≥ 1,0. Nestas condições, os complexos formados foram protegidos da degradação pela enzima DNase I. Em uma segunda etapa, a citotoxicidade das nanoemulsões e dos complexos com o pDNA sobre células Hep G2 foi avaliada, através do ensaio de MTT. Os resultados obtidos demonstraram que a adição de quantidades crescentes das nanoemulsões, conduz a uma toxicidade progressiva sobre as células, independente do pH do meio. Dentre as formulações estudadas, aquelas estabilizadas pelos fosfolipídeos DSPC e DSPE, de elevada temperatura de transição de fases, foram marcadamente menos tóxicas, em comparação com as formulações obtidas com lecitina, DOPC e DOPE. Essa mesma tendência foi detectada para os complexos formados com o pDNA. Em uma última etapa, foi realizado um estudo preliminar de transferência gênica em células Hep G2, utilizando a técnica de PCR em tempo real. Dentre as diferentes formulações testadas, a maior quantidade de DNA de GFP detectada parece ser para a formulação obtida com o fosfolipídeo DSPC, ilustrando as potencialidades de uso das nanoemulsões desenvolvidas como reagentes de transfecção de pDNA em células Hep G2. Em conclusão, o conjunto dos resultados obtidos demonstra o efeito dos fosfolipídeos empregados sobre propriedades físico-químicas, complexação, estabilidade, citotoxicidade e transfecção de nanoemulsões catiônicas como sistemas carreadores de pDNA. / Cationic nanoemulsions have been recently considered as potential delivery systems for DNA. The aim of the present work was to evaluate the influence of different phospholipids on the properties of complexes formed between nanoemulsions and pDNA (pTracerTM-CMV2). First, cationic nanoemulsions composed of medium chain triglycerides, stearlyamine, egg lecithin or isolated phospholipids (DSPC, DOPC, DSPE or DOPE), glycerol and water were prepared through spontaneous emulsification process. Independently of the type of phospholipid used this procedure results in monodisperses cationic nanoemulsions with droplet size and zeta potential of about 250 nm and +50 mV, respectively. The complexation of pDNA with cationic nanoemulsions, analyzed by agarose gel retardation assay was total when the complex possesses a charge relation [+/-] ≥ 1.0. In these conditions the complexes were protected from enzymatic degradation by DNase I. After that, the cytotoxicity of the nanoemulsion and the complexes with pDNA in Hep G2 cells was evaluated through MTT assay. The results showed that the addition of increasing amount of nanoemulsion leads to a progressive toxicity on the cells independently of the media’s pH. Among the studied formulations the ones stabilized with the phospholipids DSPC and DSPE, that have elevated phase transition temperatures, were much less cytotoxic in comparison with the formulations obtained with lecithin, DOPC and DOPE. This same trend was detected for the complexes formed with pDNA. Finally a preliminary study of gene transfer to Hep G2 cells was performed using real-time PCR technique. Among the different formulations tested, the major quantity of reporter DNA detected seems to be for the formulation obtained with the DSPC phospholipid. This shows the potentialities of the use of nanoemulsions as transfection reagents of pDNA in Hep G2 cells. In conclusion, the overall results show the effect of the phospholipids on physicochemical properties, complexation, stability, cytotoxicity and transfection of cationic nanoemulsions as delivery systems for pDNA.