Enterococcus faecalis estão entre as principais causas de infecções hospitalares em todo o mundo e é uma das mais importantes na área clínica devido à presença de inúmeros fatores de virulência que reforçam sua patogenicidade. Estudos mostram que concentrações subinibitórias de antimicrobianos podem alterar a resposta transcricional e fenotípica de bactérias, porém pouco se sabe sobre como a vancomicina pode afetar a expressão gênica nos microrganismos portadores de seus genes de resistência (genes van). Portanto, este trabalho objetivou avaliar presença e expressão de genes vanC em E. faecalis vancomicina-susceptíveis e avaliar o comportamento de isolados Enterococos Vancomicina-Resistentes (EVR) na ausência e presença de concentrações subinibitórias de vancomicina por PCR quantitativa. Identificamos a presença e a expressão de genes vanC em E. faecalis vancomicina-susceptíveis, sendo estes genes específicos para as espécies Enterococcus gallinarum e Enterococcus casseliflavus, sugere-se que o E. faecalis possa tê-los adquirido por transferência horizontal. Verificamos que a presença de vancomicina in vitro é capaz de interferir na modulação de genes de virulência em isolados EVR, porém não interfere na formação de biofilme destes isolados. Embora os dados aqui apresentados refiram-se a testes in vitro, podemos inferir que os genes vanC estão sendo transferidos para outras espécies e que a vancomicina pode estar contribuindo para o aumento na expressão de fatores de virulência in vivo, levando ao agravamento de quadros clínicos. / Enterococcus faecalis are among the leading causes of nosocomial infections worldwide and is one of the most important in the clinical area due to the presence of numerous virulence factors that enhance the pathogenicity. Studies show that sub-inhibitory concentrations of antibiotics can alter the transcriptional and phenotypic response of bacteria, but little is known about the effect of vancomycin in gene expression in microorganism bearers of their resistance genes (genes van). Therefore, this study aimed to evaluate the presence and expression of vanC genes in E. faecalis vancomycin susceptible and evaluate the behavior of vancomycin resistant enterococci (VRE) strains in the absence and presence of sub-inhibitory concentrations of vancomycin for Quantitative-PCR. We have identified the presence and expression of vanC genes in E. faecalis which are specific to Enterococcus gallinarum and Enterococcus casseliflavus species, it is suggested that the E. faecalis may have acquired these genes by horizontal gene transfer. We found that the presence of vancomycin in vitro is able of interfering with modulation of expression of virulence genes in VRE strains but does not interfere in the biofilm formation of these isolates. Although the data presented here were obtained from in vitro tests, we can infer that the vanC genes are being transferred to other species and that vancomycin may be contributing to the increase in the expression of virulence factors in vivo, leading to worseres clinical outcomes.

Nanoemulsões catiônicas têm sido recentemente propostas como sistemas carreadores de DNA. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a influência de diferentes fosfolipídeos sobre propriedades dos complexos formados entre nanoemulsões e pDNA (pTracerTMCMV2). Em uma primeira etapa, nanoemulsões catiônicas constituídas de triglicerídeos de cadeia média, estearilamina, lecitina de gema de ovo ou fosfolipídeos isolados (DSPC, DOPC, DSPE ou DOPE), glicerol e água foram preparadas através do procedimento de emulsificação espontânea. Independente do tipo de fosfolipídeo empregado, esse procedimento conduziu à obtenção de nanoemulsões catiônicas monodispersas com diâmetro de gotícula e potencial zeta de cerca de 250 nm e +50 mV, respectivamente. A complexação do pDNA com as nanoemulsões catiônicas, avaliada através do retardamento de migração do pDNA em gel de agarose por eletroforese, foi total quando o complexo apresenta uma relação de cargas [+/-] ≥ 1,0. Nestas condições, os complexos formados foram protegidos da degradação pela enzima DNase I. Em uma segunda etapa, a citotoxicidade das nanoemulsões e dos complexos com o pDNA sobre células Hep G2 foi avaliada, através do ensaio de MTT. Os resultados obtidos demonstraram que a adição de quantidades crescentes das nanoemulsões, conduz a uma toxicidade progressiva sobre as células, independente do pH do meio. Dentre as formulações estudadas, aquelas estabilizadas pelos fosfolipídeos DSPC e DSPE, de elevada temperatura de transição de fases, foram marcadamente menos tóxicas, em comparação com as formulações obtidas com lecitina, DOPC e DOPE. Essa mesma tendência foi detectada para os complexos formados com o pDNA. Em uma última etapa, foi realizado um estudo preliminar de transferência gênica em células Hep G2, utilizando a técnica de PCR em tempo real. Dentre as diferentes formulações testadas, a maior quantidade de DNA de GFP detectada parece ser para a formulação obtida com o fosfolipídeo DSPC, ilustrando as potencialidades de uso das nanoemulsões desenvolvidas como reagentes de transfecção de pDNA em células Hep G2. Em conclusão, o conjunto dos resultados obtidos demonstra o efeito dos fosfolipídeos empregados sobre propriedades físico-químicas, complexação, estabilidade, citotoxicidade e transfecção de nanoemulsões catiônicas como sistemas carreadores de pDNA. / Cationic nanoemulsions have been recently considered as potential delivery systems for DNA. The aim of the present work was to evaluate the influence of different phospholipids on the properties of complexes formed between nanoemulsions and pDNA (pTracerTM-CMV2). First, cationic nanoemulsions composed of medium chain triglycerides, stearlyamine, egg lecithin or isolated phospholipids (DSPC, DOPC, DSPE or DOPE), glycerol and water were prepared through spontaneous emulsification process. Independently of the type of phospholipid used this procedure results in monodisperses cationic nanoemulsions with droplet size and zeta potential of about 250 nm and +50 mV, respectively. The complexation of pDNA with cationic nanoemulsions, analyzed by agarose gel retardation assay was total when the complex possesses a charge relation [+/-] ≥ 1.0. In these conditions the complexes were protected from enzymatic degradation by DNase I. After that, the cytotoxicity of the nanoemulsion and the complexes with pDNA in Hep G2 cells was evaluated through MTT assay. The results showed that the addition of increasing amount of nanoemulsion leads to a progressive toxicity on the cells independently of the media’s pH. Among the studied formulations the ones stabilized with the phospholipids DSPC and DSPE, that have elevated phase transition temperatures, were much less cytotoxic in comparison with the formulations obtained with lecithin, DOPC and DOPE. This same trend was detected for the complexes formed with pDNA. Finally a preliminary study of gene transfer to Hep G2 cells was performed using real-time PCR technique. Among the different formulations tested, the major quantity of reporter DNA detected seems to be for the formulation obtained with the DSPC phospholipid. This shows the potentialities of the use of nanoemulsions as transfection reagents of pDNA in Hep G2 cells. In conclusion, the overall results show the effect of the phospholipids on physicochemical properties, complexation, stability, cytotoxicity and transfection of cationic nanoemulsions as delivery systems for pDNA.

Enterococcus faecalis estão entre as principais causas de infecções hospitalares em todo o mundo e é uma das mais importantes na área clínica devido à presença de inúmeros fatores de virulência que reforçam sua patogenicidade. Estudos mostram que concentrações subinibitórias de antimicrobianos podem alterar a resposta transcricional e fenotípica de bactérias, porém pouco se sabe sobre como a vancomicina pode afetar a expressão gênica nos microrganismos portadores de seus genes de resistência (genes van). Portanto, este trabalho objetivou avaliar presença e expressão de genes vanC em E. faecalis vancomicina-susceptíveis e avaliar o comportamento de isolados Enterococos Vancomicina-Resistentes (EVR) na ausência e presença de concentrações subinibitórias de vancomicina por PCR quantitativa. Identificamos a presença e a expressão de genes vanC em E. faecalis vancomicina-susceptíveis, sendo estes genes específicos para as espécies Enterococcus gallinarum e Enterococcus casseliflavus, sugere-se que o E. faecalis possa tê-los adquirido por transferência horizontal. Verificamos que a presença de vancomicina in vitro é capaz de interferir na modulação de genes de virulência em isolados EVR, porém não interfere na formação de biofilme destes isolados. Embora os dados aqui apresentados refiram-se a testes in vitro, podemos inferir que os genes vanC estão sendo transferidos para outras espécies e que a vancomicina pode estar contribuindo para o aumento na expressão de fatores de virulência in vivo, levando ao agravamento de quadros clínicos. / Enterococcus faecalis are among the leading causes of nosocomial infections worldwide and is one of the most important in the clinical area due to the presence of numerous virulence factors that enhance the pathogenicity. Studies show that sub-inhibitory concentrations of antibiotics can alter the transcriptional and phenotypic response of bacteria, but little is known about the effect of vancomycin in gene expression in microorganism bearers of their resistance genes (genes van). Therefore, this study aimed to evaluate the presence and expression of vanC genes in E. faecalis vancomycin susceptible and evaluate the behavior of vancomycin resistant enterococci (VRE) strains in the absence and presence of sub-inhibitory concentrations of vancomycin for Quantitative-PCR. We have identified the presence and expression of vanC genes in E. faecalis which are specific to Enterococcus gallinarum and Enterococcus casseliflavus species, it is suggested that the E. faecalis may have acquired these genes by horizontal gene transfer. We found that the presence of vancomycin in vitro is able of interfering with modulation of expression of virulence genes in VRE strains but does not interfere in the biofilm formation of these isolates. Although the data presented here were obtained from in vitro tests, we can infer that the vanC genes are being transferred to other species and that vancomycin may be contributing to the increase in the expression of virulence factors in vivo, leading to worseres clinical outcomes.

Nanoemulsões catiônicas têm sido recentemente propostas como sistemas carreadores de DNA. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a influência de diferentes fosfolipídeos sobre propriedades dos complexos formados entre nanoemulsões e pDNA (pTracerTMCMV2). Em uma primeira etapa, nanoemulsões catiônicas constituídas de triglicerídeos de cadeia média, estearilamina, lecitina de gema de ovo ou fosfolipídeos isolados (DSPC, DOPC, DSPE ou DOPE), glicerol e água foram preparadas através do procedimento de emulsificação espontânea. Independente do tipo de fosfolipídeo empregado, esse procedimento conduziu à obtenção de nanoemulsões catiônicas monodispersas com diâmetro de gotícula e potencial zeta de cerca de 250 nm e +50 mV, respectivamente. A complexação do pDNA com as nanoemulsões catiônicas, avaliada através do retardamento de migração do pDNA em gel de agarose por eletroforese, foi total quando o complexo apresenta uma relação de cargas [+/-] ≥ 1,0. Nestas condições, os complexos formados foram protegidos da degradação pela enzima DNase I. Em uma segunda etapa, a citotoxicidade das nanoemulsões e dos complexos com o pDNA sobre células Hep G2 foi avaliada, através do ensaio de MTT. Os resultados obtidos demonstraram que a adição de quantidades crescentes das nanoemulsões, conduz a uma toxicidade progressiva sobre as células, independente do pH do meio. Dentre as formulações estudadas, aquelas estabilizadas pelos fosfolipídeos DSPC e DSPE, de elevada temperatura de transição de fases, foram marcadamente menos tóxicas, em comparação com as formulações obtidas com lecitina, DOPC e DOPE. Essa mesma tendência foi detectada para os complexos formados com o pDNA. Em uma última etapa, foi realizado um estudo preliminar de transferência gênica em células Hep G2, utilizando a técnica de PCR em tempo real. Dentre as diferentes formulações testadas, a maior quantidade de DNA de GFP detectada parece ser para a formulação obtida com o fosfolipídeo DSPC, ilustrando as potencialidades de uso das nanoemulsões desenvolvidas como reagentes de transfecção de pDNA em células Hep G2. Em conclusão, o conjunto dos resultados obtidos demonstra o efeito dos fosfolipídeos empregados sobre propriedades físico-químicas, complexação, estabilidade, citotoxicidade e transfecção de nanoemulsões catiônicas como sistemas carreadores de pDNA. / Cationic nanoemulsions have been recently considered as potential delivery systems for DNA. The aim of the present work was to evaluate the influence of different phospholipids on the properties of complexes formed between nanoemulsions and pDNA (pTracerTM-CMV2). First, cationic nanoemulsions composed of medium chain triglycerides, stearlyamine, egg lecithin or isolated phospholipids (DSPC, DOPC, DSPE or DOPE), glycerol and water were prepared through spontaneous emulsification process. Independently of the type of phospholipid used this procedure results in monodisperses cationic nanoemulsions with droplet size and zeta potential of about 250 nm and +50 mV, respectively. The complexation of pDNA with cationic nanoemulsions, analyzed by agarose gel retardation assay was total when the complex possesses a charge relation [+/-] ≥ 1.0. In these conditions the complexes were protected from enzymatic degradation by DNase I. After that, the cytotoxicity of the nanoemulsion and the complexes with pDNA in Hep G2 cells was evaluated through MTT assay. The results showed that the addition of increasing amount of nanoemulsion leads to a progressive toxicity on the cells independently of the media’s pH. Among the studied formulations the ones stabilized with the phospholipids DSPC and DSPE, that have elevated phase transition temperatures, were much less cytotoxic in comparison with the formulations obtained with lecithin, DOPC and DOPE. This same trend was detected for the complexes formed with pDNA. Finally a preliminary study of gene transfer to Hep G2 cells was performed using real-time PCR technique. Among the different formulations tested, the major quantity of reporter DNA detected seems to be for the formulation obtained with the DSPC phospholipid. This shows the potentialities of the use of nanoemulsions as transfection reagents of pDNA in Hep G2 cells. In conclusion, the overall results show the effect of the phospholipids on physicochemical properties, complexation, stability, cytotoxicity and transfection of cationic nanoemulsions as delivery systems for pDNA.

Enterococcus faecalis estão entre as principais causas de infecções hospitalares em todo o mundo e é uma das mais importantes na área clínica devido à presença de inúmeros fatores de virulência que reforçam sua patogenicidade. Estudos mostram que concentrações subinibitórias de antimicrobianos podem alterar a resposta transcricional e fenotípica de bactérias, porém pouco se sabe sobre como a vancomicina pode afetar a expressão gênica nos microrganismos portadores de seus genes de resistência (genes van). Portanto, este trabalho objetivou avaliar presença e expressão de genes vanC em E. faecalis vancomicina-susceptíveis e avaliar o comportamento de isolados Enterococos Vancomicina-Resistentes (EVR) na ausência e presença de concentrações subinibitórias de vancomicina por PCR quantitativa. Identificamos a presença e a expressão de genes vanC em E. faecalis vancomicina-susceptíveis, sendo estes genes específicos para as espécies Enterococcus gallinarum e Enterococcus casseliflavus, sugere-se que o E. faecalis possa tê-los adquirido por transferência horizontal. Verificamos que a presença de vancomicina in vitro é capaz de interferir na modulação de genes de virulência em isolados EVR, porém não interfere na formação de biofilme destes isolados. Embora os dados aqui apresentados refiram-se a testes in vitro, podemos inferir que os genes vanC estão sendo transferidos para outras espécies e que a vancomicina pode estar contribuindo para o aumento na expressão de fatores de virulência in vivo, levando ao agravamento de quadros clínicos. / Enterococcus faecalis are among the leading causes of nosocomial infections worldwide and is one of the most important in the clinical area due to the presence of numerous virulence factors that enhance the pathogenicity. Studies show that sub-inhibitory concentrations of antibiotics can alter the transcriptional and phenotypic response of bacteria, but little is known about the effect of vancomycin in gene expression in microorganism bearers of their resistance genes (genes van). Therefore, this study aimed to evaluate the presence and expression of vanC genes in E. faecalis vancomycin susceptible and evaluate the behavior of vancomycin resistant enterococci (VRE) strains in the absence and presence of sub-inhibitory concentrations of vancomycin for Quantitative-PCR. We have identified the presence and expression of vanC genes in E. faecalis which are specific to Enterococcus gallinarum and Enterococcus casseliflavus species, it is suggested that the E. faecalis may have acquired these genes by horizontal gene transfer. We found that the presence of vancomycin in vitro is able of interfering with modulation of expression of virulence genes in VRE strains but does not interfere in the biofilm formation of these isolates. Although the data presented here were obtained from in vitro tests, we can infer that the vanC genes are being transferred to other species and that vancomycin may be contributing to the increase in the expression of virulence factors in vivo, leading to worseres clinical outcomes.

Orientador: Marcelo Lancellotti / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T12:32:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cury_GiseleCristianeGentile_D.pdf: 5956781 bytes, checksum: b28217e4d95beb4734f0357ed4181696 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital quando for liberada / Abstract: The abstract is available with the full electronic document when available / Doutorado / Bioquimica / Doutora em Biologia Funcional e Molecular

Introdução. A resistência bacteriana é facilitada pela pressão seletiva do uso de antimicrobianos na clínica e em outras atividades, como a agricultura e pecuária, além de poder ser disseminada para a natureza por meio do lançamento inadequado do esgoto ou pela aplicação do lodo de esgoto na agricultura. As -lactamases de espectro estendido (ESBL) são uma das formas mais prevalentes de resistência em Gram negativos no mundo, e seus genes codificadores são disseminados por meio de diversos elementos genéticos, principalmente transposons e integrons mobilizados para plasmídios. Objetivo. Identificar e caracterizar genes codificadores de ESBL, bem como suas prováveis formas de mobilização, em enterobactérias isoladas de fontes ambientais e clínicas. Material e Métodos. Quarenta e cinco cepas isoladas de um hospital público em 2004 e 2005, responsáveis por infecções hospitalares (14), infecções comunitárias (7) e colonizações (24), e 7 isoladas de estações de tratamento de esgoto (ETE) em 2009, em São Paulo, geneticamente distintas e produtoras de ESBL da família Enterobacteriaceae, foram estudadas. A técnica de PCR seguida de sequenciamento foi utilizada para a identificação dos genes blaESBL, triagem de elementos móveis e mapeamento do ambiente genético de blaESBL. A identificação dos grupos de incompatibilidade plasmidial (Inc) foi realizada pela técnica de PBRT, e a determinação dos tamanhos dos plasmídios pela técnica de S1-PFGE. Resultados. Os genes blaESBL identificados foram: amostras clínicas - blaTEM-15, blaTEM-197, blaSHV-5, blaSHV-12, blaSHV-27, blaSHV-28, blaSHV-45, blaSHV-55, blaSHV-110, blaCTX-M-2, blaCTX-M-59 e blaCTX-M-131; amostras ambientais blaSHV-28, blaCTX-M-15 e blaCTX-M-8. Os genes blaTEM- 15 e blaTEM-197 estavam associados aos elementos Tn2* e Tn3, respectivamente. Os genes blaSHV-5 e blaSHV-12 estavam associados à IS26, e não foi possível determinar o ambiente genético dos demais genes blaSHV. Os genes blaCTX-M-2, blaCTX-M-59 e blaCTXM- 131 estavam inseridos em integrons de classe 1 complexos, blaCTX-M-15 estava associado à ISEcp1 interrompida pela IS26, e blaCTX-M-8 estava associado à IS10, também interrompida pela IS26. Os principais grupos Inc detectados foram IncA/C (37 por cento ) e IncF (30,4 por cento ). Exceto por 7 cepas clínicas, todas apresentavam plasmídios de alto peso molecular, entre 48,5kb e 388kb. Conclusões. Este estudo detectou 15 genes blaESBL diferentes, dos quais dois são genes novos (blaTEM-197 e blaCTX-M-131) e três são inéditos no Brasil (blaTEM-15, blaSHV-55 e blaSHV-110). A maioria das cepas deste estudo possuía genes blaESBL associados a elementos mobilizáveis, bem como continham plasmídios de grupos Inc envolvidos na disseminação da resistência antimicrobiana. Além disso, carreavam plasmídios provavelmente conjugativos. Os resultados deste estudo mostram genes de resistência associados a elementos mobilizáveis em cepas contendo elementos transferíveis. As cepas foram isoladas tanto em uma instituição de saúde como nas ETEs da Grande São Paulo, mostrando o potencial de disseminação da resistência da clínica para o ambiente em nossa região. / Introduction. Bacterial resistance is facilitated by selective pressure of antimicrobial use in clinical and other activities, as agriculture and livestock, and can be spread to nature through the inadequate discharge of sewage or by the use of sludge in agriculture. Extended-spectrum -lactamases (ESBL) are the most prevalente forms of resistance in Gram-negative bacteria in the world, and their encoding genes are disseminated through several genetic elements, especially transposons and integrons mobilized to plasmids. Objective. To identify and characterize ESBL-encoding genes, as well as their probable mobilization pathways, in enterobacteria isolated from clinical and environmental sources. Material and Methods. Forty-five strains isolated from a public hospital in 2004 and 2005, responsible for hospital infections (14), community-acquired infections (7) and colonizations (24), and 7 isolated from sewage treatment plants (ETE) in 2009, in São Paulo, genetically distinct and ESBL producers from Enterobacteriaceae family, were studied. PCR technique followed by sequencing was used for blaESBL genes identification, mobile elements screening and blaESBL genetic environment mapping. Plasmid incompatibility groups (Inc) were identified by PBRT technique, and plasmid sizes were determined by S1-PFGE technique. Results. The blaESBL genes identified were: clinical samples - blaTEM-15, blaTEM-197, blaSHV-5, blaSHV-12, blaSHV-27, blaSHV-28, blaSHV-45, blaSHV-55, blaSHV-110, blaCTX-M-2, blaCTX-M-59 and blaCTX-M-131; environmental samples blaSHV-28, blaCTX-M-15 and blaCTX-M-8. Genes blaTEM-15 and blaTEM-197 were associated to the elements Tn2* and Tn3, respectivelly. Genes blaSHV-5 and blaSHV-12 were associated to IS26, and it was not possible to detect the genetic environment of the other blaSHV genes. Genes blaCTX-M-2, blaCTX-M-59 and blaCTX-M-131 were inserted in complex class 1 integrons, blaCTX-M-15 was associated to ISEcp1 interrupted by IS26, and blaCTX-M-8 was associated to IS10, also interrupted by IS26. The most common Inc grups detected were IncA/C (37 per cent ) and IncF (30,4 per cent ). Except for 7 clinical strains, all isolates showed high molecular weight plasmids, rangng from 48,5kb to 388kb. Conclusions. This study detected 15 different blaESBL genes, from which 2 are new genes (blaTEM-197 e blaCTX-M-131) and 3 are still unpublished in Brazil (blaTEM-15, blaSHV-55 and blaSHV-110). Most of the strains from this study had blaESBL genes associated to mobile elements, as well as they had plasmids from Inc groups involved in the spread of antimicrobial resistance. Moreover, the strains probably carried conjugative plasmids. Results from the present work show resistance genes associated to mobile elements in strains carrying transferable elements. The strains were isolated either from a healthcare institution or from ETEs in São Paulo, which shows the spread potential of resistance from the clinic to the environment in our region.

Introdução. A resistência bacteriana a antibióticos é aceita como um dos maiores problemas de saúde pública. As tetraciclinas são antibióticos de amplo espectro, e após seu uso indiscriminado observou-se o surgimento de bactérias resistentes, levando médicos e veterinários a diminuírem seu uso. Objetivos. Verificar o perfil de sensibilidade a tetraciclinas em isolados clínicos e ambientais de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae e Aeromonas spp., bem como pesquisar os principais genes tet associados à resistência a esta classe de antibióticos e determinar a potencial forma de disseminação destes genes através da caracterização de seu ambiente genético. Material e Métodos. Os perfis de sensibilidade à tetraciclina (TET), doxiciclina (DOX), minociclina (MIN) e tigeciclina (TGC) de 572 isolados foram obtidos através das técnicas de Disco-Difusão e Concentração Inibitória Mínima. Os isolados não-sensíveis à tetraciclina foram submetidos a reações de PCR para pesquisa de grupos Inc, genes tet e para a caracterização de seu ambiente genético pela pesquisa das integrases de classes 1, 2, 3 e 4, e dos elementos genéticos móveis Tn1721, IS26, Tn10 e ISAS5. Perfis de similaridade genética dos isolados foram obtidos através das técnicas de ERIC-PCR e PFGE. Após análise destes resultados 33 cepas foram selecionadas para as técnicas de S1-PFGE e transformação. Resultados. A partir dos 572 isolados 18,5 por cento foram resistentes à TET, 13,5 por cento à DOX, 8 por cento à MIN e nenhum à TGC. Vinte e dois por cento dos isolados clínicos e 16,3 por cento ambientais foram resistentes à TET. Os genes codificadores de bomba de efluxo tet(A), tet(B), tet(C), tet(D) e tet(E), foram observados em 25,5 por cento , 33 por cento , 6,5 por cento , 18,9 por cento e 23,5 por cento dos isolados, respectivamente. Noventa e cinco por cento, 100 por cento , 100 por cento e 4,5 por cento das cepas carreando o gene tet(A), tet(B), tet(D) e tet(E), foram não-sensíveis à DOX, nesta ordem. Resistência à MIN foi observada em 4,2 por cento , 78,8 por cento e 100 por cento dos isolados carreando tet(A), tet(B) e tet(D), respectivamente. O gene tet(A) estava associado a Tn1721, tet(B) à Tn10 e tet(C) e tet(D) à IS26. Nenhuma das integrases pesquisadas estavam associadas aos genes tet detectados. Os grupos IncF, IncFIB e IncA/C foram observados em 54,8 por cento , 41,1 por cento e 28,7 por cento dos isolados, respectivamente. Uma cepa de Aeromonas spp. carreava um plasmídio do grupo IncP. Através dos perfis de similaridade genética foi observado que dentre os isolados hospitalares de K. pneumoniae houve a ocorrência de perfis genéticos idênticos, no entanto nos demais isolados do estudo os perfis genéticos observados eram distintos. Das 33 cepas selecionadas para os experimentos de linearização plasmidial e de transformação, 8 foram transformadas com sucesso, nas quais foi observada a presença dos genes tet em plasmídios. Conclusões. Uma baixa porcentagem de resistência à TET foi detectada. Verificou-se que a TGC foi a tetraciclina mais ativa, seguida da MIN. Os genes tet(A) e tet(B) foram os mais prevalentes. Todas as cepas carreando tet(B) e tet(D) foram não-sensíveis a DOX e MIN. Plasmídios dos grupos IncF, FIB e A/C foram os mais detectados neste estudo. Os resultados sugerem que os genes tet(A), (B), (C) e (D) são disseminados por meio de plasmídios e estão associados aos transposons Tn1721, IS10 e IS26. Estudos adicionais com isolados mais recentes e outros gêneros bacterianos são necessários, para contribuir com informações da resistência bacteriana a tetraciclinas. / Introduction. The antibiotic resistance is accepted as one of the major problems for public health. Tetracyclines are broad spectrum antibiotics, and its indiscriminate use promoted the emergence of resistant bacteria, leading physicians and veterinarians to decrease its use. Objectives. Verify the susceptibility of clinical and environmental isolates of Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae and Aeromonas spp. to tetracyclines, and also search for the main tet genes associated with resistance to these antibiotics and determine the potential mechanism of tet genes dissemination by characterizing their genetic context. Material and Methods. Disk-Diffusion and Minimum Inhibitory Concentration tests were carried out in 572 isolates using tetracycline (TET), doxycycline (DOX), minocycline (MIN) and tigecycline (TGC). PCR was carried out in TET non-susceptible isolates for the detection of Inc groups, tet genes and its genetic context determination through the search of classes 1, 2, 3, and 4 integrases, and Tn1721, Tn10, IS26 and ISAS5 mobile genetic elements. Genetic similarities patterns were determined by ERIC-PCR and PFGE techniques. After analyzing the results 33 strains were selected for the S1-PFGE and transformation experiments. Results. From 572 isolates, 18.5 per cent were TET-resistant, 13.5 per cent DOX-resistant, 8 per cent MIN-resistant and none resistant to TGC. Twenty-two per cent and 16.3 per cent of clinical and environmental isolates were TET-resistant, in that order. Genes tet(A), tet(B), tet(C), tet(D) and tet(E), coding for efflux pump mechanism, were found in 25.5 per cent , 33 per cent , 6.5 per cent , 18.9 per cent and 23.5 per cent of the isolates, respectively. Ninety-five per cent, 100 per cent , 100 per cent and 4.5 per cent of the isolates carrying tet(A), tet(B), tet(D) and tet(E) were non-susceptible to DOX, respectively. Resistance to MIN was observed in 4.2 per cent , 78.8 per cent and 100 per cent of isolates carrying tet(A), tet(B) and tet(D), in that order. The gene tet(A) was associated with Tn1721, tet(B) with Tn10, and tet(C) and (D) with IS26. None of the searched integrases were associated with the tet genes detected. Groups IncF, IncFIB and IncA/C were respectively observed in 54.8 per cent , 41.1 per cent and 28.7 per cent of the isolates. One Aeromonas spp. was carrying an IncP plasmid. The genetic similarities patterns demonstrated that there were identical genetic patterns among the hospital K. pneumoniae isolates, however all the remaining isolates possessed distinct genetic patterns. Of the 33 strains selected for plasmid linearization and transformation experiments, 8 were successfully transformed, in which the presence of tet genes in plasmids were observed. Conclusions. A low level of tetracycline resistance was detected. TGC was the most active tested antibiotic, followed by MIN. Genes tet(A) and tet(B) were the most prevalent among the isolates. All strains carrying tet(B) and tet(D) were non-susceptible to DOX and MIN. Groups IncF, IncFIB and IncA/C were the most detected in this study. The results suggest that tet(A), (B), (C) and (D) are disseminated by plasmids and are associated with Tn1721, Tn10 and IS26. Additional studies assembling recent isolates and other genera are necessary in order to contribute with information about the bacteria resistance to tetracyclines.

Introdução. A resistência bacteriana a antibióticos é aceita como um dos maiores problemas de saúde pública. As tetraciclinas são antibióticos de amplo espectro, e após seu uso indiscriminado observou-se o surgimento de bactérias resistentes, levando médicos e veterinários a diminuírem seu uso. Objetivos. Verificar o perfil de sensibilidade a tetraciclinas em isolados clínicos e ambientais de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae e Aeromonas spp., bem como pesquisar os principais genes tet associados à resistência a esta classe de antibióticos e determinar a potencial forma de disseminação destes genes através da caracterização de seu ambiente genético. Material e Métodos. Os perfis de sensibilidade à tetraciclina (TET), doxiciclina (DOX), minociclina (MIN) e tigeciclina (TGC) de 572 isolados foram obtidos através das técnicas de Disco-Difusão e Concentração Inibitória Mínima. Os isolados não-sensíveis à tetraciclina foram submetidos a reações de PCR para pesquisa de grupos Inc, genes tet e para a caracterização de seu ambiente genético pela pesquisa das integrases de classes 1, 2, 3 e 4, e dos elementos genéticos móveis Tn1721, IS26, Tn10 e ISAS5. Perfis de similaridade genética dos isolados foram obtidos através das técnicas de ERIC-PCR e PFGE. Após análise destes resultados 33 cepas foram selecionadas para as técnicas de S1-PFGE e transformação. Resultados. A partir dos 572 isolados 18,5 por cento foram resistentes à TET, 13,5 por cento à DOX, 8 por cento à MIN e nenhum à TGC. Vinte e dois por cento dos isolados clínicos e 16,3 por cento ambientais foram resistentes à TET. Os genes codificadores de bomba de efluxo tet(A), tet(B), tet(C), tet(D) e tet(E), foram observados em 25,5 por cento , 33 por cento , 6,5 por cento , 18,9 por cento e 23,5 por cento dos isolados, respectivamente. Noventa e cinco por cento, 100 por cento , 100 por cento e 4,5 por cento das cepas carreando o gene tet(A), tet(B), tet(D) e tet(E), foram não-sensíveis à DOX, nesta ordem. Resistência à MIN foi observada em 4,2 por cento , 78,8 por cento e 100 por cento dos isolados carreando tet(A), tet(B) e tet(D), respectivamente. O gene tet(A) estava associado a Tn1721, tet(B) à Tn10 e tet(C) e tet(D) à IS26. Nenhuma das integrases pesquisadas estavam associadas aos genes tet detectados. Os grupos IncF, IncFIB e IncA/C foram observados em 54,8 por cento , 41,1 por cento e 28,7 por cento dos isolados, respectivamente. Uma cepa de Aeromonas spp. carreava um plasmídio do grupo IncP. Através dos perfis de similaridade genética foi observado que dentre os isolados hospitalares de K. pneumoniae houve a ocorrência de perfis genéticos idênticos, no entanto nos demais isolados do estudo os perfis genéticos observados eram distintos. Das 33 cepas selecionadas para os experimentos de linearização plasmidial e de transformação, 8 foram transformadas com sucesso, nas quais foi observada a presença dos genes tet em plasmídios. Conclusões. Uma baixa porcentagem de resistência à TET foi detectada. Verificou-se que a TGC foi a tetraciclina mais ativa, seguida da MIN. Os genes tet(A) e tet(B) foram os mais prevalentes. Todas as cepas carreando tet(B) e tet(D) foram não-sensíveis a DOX e MIN. Plasmídios dos grupos IncF, FIB e A/C foram os mais detectados neste estudo. Os resultados sugerem que os genes tet(A), (B), (C) e (D) são disseminados por meio de plasmídios e estão associados aos transposons Tn1721, IS10 e IS26. Estudos adicionais com isolados mais recentes e outros gêneros bacterianos são necessários, para contribuir com informações da resistência bacteriana a tetraciclinas. / Introduction. The antibiotic resistance is accepted as one of the major problems for public health. Tetracyclines are broad spectrum antibiotics, and its indiscriminate use promoted the emergence of resistant bacteria, leading physicians and veterinarians to decrease its use. Objectives. Verify the susceptibility of clinical and environmental isolates of Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae and Aeromonas spp. to tetracyclines, and also search for the main tet genes associated with resistance to these antibiotics and determine the potential mechanism of tet genes dissemination by characterizing their genetic context. Material and Methods. Disk-Diffusion and Minimum Inhibitory Concentration tests were carried out in 572 isolates using tetracycline (TET), doxycycline (DOX), minocycline (MIN) and tigecycline (TGC). PCR was carried out in TET non-susceptible isolates for the detection of Inc groups, tet genes and its genetic context determination through the search of classes 1, 2, 3, and 4 integrases, and Tn1721, Tn10, IS26 and ISAS5 mobile genetic elements. Genetic similarities patterns were determined by ERIC-PCR and PFGE techniques. After analyzing the results 33 strains were selected for the S1-PFGE and transformation experiments. Results. From 572 isolates, 18.5 per cent were TET-resistant, 13.5 per cent DOX-resistant, 8 per cent MIN-resistant and none resistant to TGC. Twenty-two per cent and 16.3 per cent of clinical and environmental isolates were TET-resistant, in that order. Genes tet(A), tet(B), tet(C), tet(D) and tet(E), coding for efflux pump mechanism, were found in 25.5 per cent , 33 per cent , 6.5 per cent , 18.9 per cent and 23.5 per cent of the isolates, respectively. Ninety-five per cent, 100 per cent , 100 per cent and 4.5 per cent of the isolates carrying tet(A), tet(B), tet(D) and tet(E) were non-susceptible to DOX, respectively. Resistance to MIN was observed in 4.2 per cent , 78.8 per cent and 100 per cent of isolates carrying tet(A), tet(B) and tet(D), in that order. The gene tet(A) was associated with Tn1721, tet(B) with Tn10, and tet(C) and (D) with IS26. None of the searched integrases were associated with the tet genes detected. Groups IncF, IncFIB and IncA/C were respectively observed in 54.8 per cent , 41.1 per cent and 28.7 per cent of the isolates. One Aeromonas spp. was carrying an IncP plasmid. The genetic similarities patterns demonstrated that there were identical genetic patterns among the hospital K. pneumoniae isolates, however all the remaining isolates possessed distinct genetic patterns. Of the 33 strains selected for plasmid linearization and transformation experiments, 8 were successfully transformed, in which the presence of tet genes in plasmids were observed. Conclusions. A low level of tetracycline resistance was detected. TGC was the most active tested antibiotic, followed by MIN. Genes tet(A) and tet(B) were the most prevalent among the isolates. All strains carrying tet(B) and tet(D) were non-susceptible to DOX and MIN. Groups IncF, IncFIB and IncA/C were the most detected in this study. The results suggest that tet(A), (B), (C) and (D) are disseminated by plasmids and are associated with Tn1721, Tn10 and IS26. Additional studies assembling recent isolates and other genera are necessary in order to contribute with information about the bacteria resistance to tetracyclines.

Introdução. A resistência bacteriana é facilitada pela pressão seletiva do uso de antimicrobianos na clínica e em outras atividades, como a agricultura e pecuária, além de poder ser disseminada para a natureza por meio do lançamento inadequado do esgoto ou pela aplicação do lodo de esgoto na agricultura. As -lactamases de espectro estendido (ESBL) são uma das formas mais prevalentes de resistência em Gram negativos no mundo, e seus genes codificadores são disseminados por meio de diversos elementos genéticos, principalmente transposons e integrons mobilizados para plasmídios. Objetivo. Identificar e caracterizar genes codificadores de ESBL, bem como suas prováveis formas de mobilização, em enterobactérias isoladas de fontes ambientais e clínicas. Material e Métodos. Quarenta e cinco cepas isoladas de um hospital público em 2004 e 2005, responsáveis por infecções hospitalares (14), infecções comunitárias (7) e colonizações (24), e 7 isoladas de estações de tratamento de esgoto (ETE) em 2009, em São Paulo, geneticamente distintas e produtoras de ESBL da família Enterobacteriaceae, foram estudadas. A técnica de PCR seguida de sequenciamento foi utilizada para a identificação dos genes blaESBL, triagem de elementos móveis e mapeamento do ambiente genético de blaESBL. A identificação dos grupos de incompatibilidade plasmidial (Inc) foi realizada pela técnica de PBRT, e a determinação dos tamanhos dos plasmídios pela técnica de S1-PFGE. Resultados. Os genes blaESBL identificados foram: amostras clínicas - blaTEM-15, blaTEM-197, blaSHV-5, blaSHV-12, blaSHV-27, blaSHV-28, blaSHV-45, blaSHV-55, blaSHV-110, blaCTX-M-2, blaCTX-M-59 e blaCTX-M-131; amostras ambientais blaSHV-28, blaCTX-M-15 e blaCTX-M-8. Os genes blaTEM- 15 e blaTEM-197 estavam associados aos elementos Tn2* e Tn3, respectivamente. Os genes blaSHV-5 e blaSHV-12 estavam associados à IS26, e não foi possível determinar o ambiente genético dos demais genes blaSHV. Os genes blaCTX-M-2, blaCTX-M-59 e blaCTXM- 131 estavam inseridos em integrons de classe 1 complexos, blaCTX-M-15 estava associado à ISEcp1 interrompida pela IS26, e blaCTX-M-8 estava associado à IS10, também interrompida pela IS26. Os principais grupos Inc detectados foram IncA/C (37 por cento ) e IncF (30,4 por cento ). Exceto por 7 cepas clínicas, todas apresentavam plasmídios de alto peso molecular, entre 48,5kb e 388kb. Conclusões. Este estudo detectou 15 genes blaESBL diferentes, dos quais dois são genes novos (blaTEM-197 e blaCTX-M-131) e três são inéditos no Brasil (blaTEM-15, blaSHV-55 e blaSHV-110). A maioria das cepas deste estudo possuía genes blaESBL associados a elementos mobilizáveis, bem como continham plasmídios de grupos Inc envolvidos na disseminação da resistência antimicrobiana. Além disso, carreavam plasmídios provavelmente conjugativos. Os resultados deste estudo mostram genes de resistência associados a elementos mobilizáveis em cepas contendo elementos transferíveis. As cepas foram isoladas tanto em uma instituição de saúde como nas ETEs da Grande São Paulo, mostrando o potencial de disseminação da resistência da clínica para o ambiente em nossa região. / Introduction. Bacterial resistance is facilitated by selective pressure of antimicrobial use in clinical and other activities, as agriculture and livestock, and can be spread to nature through the inadequate discharge of sewage or by the use of sludge in agriculture. Extended-spectrum -lactamases (ESBL) are the most prevalente forms of resistance in Gram-negative bacteria in the world, and their encoding genes are disseminated through several genetic elements, especially transposons and integrons mobilized to plasmids. Objective. To identify and characterize ESBL-encoding genes, as well as their probable mobilization pathways, in enterobacteria isolated from clinical and environmental sources. Material and Methods. Forty-five strains isolated from a public hospital in 2004 and 2005, responsible for hospital infections (14), community-acquired infections (7) and colonizations (24), and 7 isolated from sewage treatment plants (ETE) in 2009, in São Paulo, genetically distinct and ESBL producers from Enterobacteriaceae family, were studied. PCR technique followed by sequencing was used for blaESBL genes identification, mobile elements screening and blaESBL genetic environment mapping. Plasmid incompatibility groups (Inc) were identified by PBRT technique, and plasmid sizes were determined by S1-PFGE technique. Results. The blaESBL genes identified were: clinical samples - blaTEM-15, blaTEM-197, blaSHV-5, blaSHV-12, blaSHV-27, blaSHV-28, blaSHV-45, blaSHV-55, blaSHV-110, blaCTX-M-2, blaCTX-M-59 and blaCTX-M-131; environmental samples blaSHV-28, blaCTX-M-15 and blaCTX-M-8. Genes blaTEM-15 and blaTEM-197 were associated to the elements Tn2* and Tn3, respectivelly. Genes blaSHV-5 and blaSHV-12 were associated to IS26, and it was not possible to detect the genetic environment of the other blaSHV genes. Genes blaCTX-M-2, blaCTX-M-59 and blaCTX-M-131 were inserted in complex class 1 integrons, blaCTX-M-15 was associated to ISEcp1 interrupted by IS26, and blaCTX-M-8 was associated to IS10, also interrupted by IS26. The most common Inc grups detected were IncA/C (37 per cent ) and IncF (30,4 per cent ). Except for 7 clinical strains, all isolates showed high molecular weight plasmids, rangng from 48,5kb to 388kb. Conclusions. This study detected 15 different blaESBL genes, from which 2 are new genes (blaTEM-197 e blaCTX-M-131) and 3 are still unpublished in Brazil (blaTEM-15, blaSHV-55 and blaSHV-110). Most of the strains from this study had blaESBL genes associated to mobile elements, as well as they had plasmids from Inc groups involved in the spread of antimicrobial resistance. Moreover, the strains probably carried conjugative plasmids. Results from the present work show resistance genes associated to mobile elements in strains carrying transferable elements. The strains were isolated either from a healthcare institution or from ETEs in São Paulo, which shows the spread potential of resistance from the clinic to the environment in our region.