Made available in DSpace on 2015-12-06T23:05:32Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:02:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo895_1.pdf: 2338866 bytes, checksum: b0579d16e31ce4eb83ec3e3b93a96401 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / O objetivo desse estudo foi caracterizar bactérias causadoras de infecção hospitalar que apresentam resistência aos dois principais grupos de antibióticos que afetam a síntese da parede celular representados pelos glicopeptídeos e ß-lactâmicos. Neste, reportamos o isolamento e caracterização das primeiras amostras de Enterococcus faecalis resistentes ao glicopeptideo vancomicina (VRE) no Nordeste do Brasil e isolados clínicos de Klebsiella pneumoniae resistentes aos antibióticos ß-lactâmicos envolvidos em episódios de infecções hospitalar. Estes isolados foram testados quanto a susceptibilidade aos antimicrobianos de escolha. Os enterococos foram tipificados por meio de macro-restrição do DNA cromossomal e analisados quanto a presença dos genes de resistência e de elementos genéticos móveis. Os isolados apresentaram resistência a múltiplos antimicrobianos e apenas um perfil genético foi encontrado, sugerindo a disseminação de uma linhagem clonal entre os pacientes infectados, também a presença específica do gene vanA e do elemento de transposição Tn1546-like associado a plasmídios mostram capacidade de disseminação dos mecanismos de resistência aos glicopeptídeos por meio de processos de conjugação genética entre as bactérias. Os isolados de K. pneumoniae foram tipificados por ribotipagem e analisados quanto a presença dos genes de resistência e de elementos genéticos móveis. Os isolados apresentaram o fenótipo de ESBL, ou seja, produtoras de ß-lactamases de espectro ampliado. Este fenótipo foi associado a presença dos genes blaTEM, blaCTX-M e blaSHV tanto no cromossomo como em plasmídios naturais dos isolados. Estes genes foram detectados em diferentes associações, como genes únicos (25,5%), duplos (41,8%) e triplos (32,7%). A presença dos três genes no mesmo isolado foi detectada em percentuais superiores àqueles relatados na literatura. Em adição, foram também detectadas as presenças do integron de classe 1 carreando outros genes de resistência, gerando o fenótipo de co-resistência dessas bactérias a outros antimicrobianos. A detecção de várias linhagens clonais mostra o surgimento de vários eventos de resistência ou a transferência dos marcadores genéticos entre as bactérias. Assim, os resultados puderam mostrar o crescimento da disseminação dos elementos genéticos de resistência bacteriana a antibióticos entre isolados de bactérias causadoras de infecção hospitalar, diminuindo, assim, as possibilidades terapêuticas para o tratamento dessas infecções

Antibiotic resistance is increasing worldwide, which is threatening the effectiveness of even the most potent and recent antibiotics. The successful treatment of disease is hampered due to the multidrug resistant (MDR) phenotype exhibited by the bacterial pathogens. Therefore, the aims of this thesis were to investigate MDR through several different approaches. Integrons are important contributors to the MDR profile of nosocomial isolates within Australia, therefore the incidence of integrons was assessed in a collection of 72 conjugative clinical plasmids isolated from E. coli, a cohort of 30 urinary tract infection (UTI) isolates and a cohort of four bacteria producing metallo-beta-lactamases (MBLs). Integrons were found in 63% (45/72) of the conjugative plasmids by polymerase chain reaction (PCR). Sequencing of gene cassette arrays revealed that cassettes of the dfr and aadA families were most common. Within the cohort of UTI bacteria, 37% (11/30) were positive for class 1 integrons, and the dfrA17-aadA5 gene cassette array was most common. The four MBL-producers contained the gene cassette blaIMP-4 found within a class 1 integron which was responsible for the MBL phenotype. An assay based on real-time PCR was also developed to measure the recombination activity of the integron integrase (IntI) enzymes. The existing method of IntI measurement, the in vivo conduction assay, was used as a basis for the development of the real-time PCR assay. Five 59-be from the gene cassettes aadB, orfA, sat2, dfrA1 and aacA4 were cloned as recognition sites used in the real-time PCR assay. IntI1 was the most active integrase and showed an activity of 2.31 ?? 10??-1 when recombining the aadB and orfA 59-be. The highest level of class 2 integrase activity was 2.00 ?? 10-1?? during recombination of the sat2 and dfrA1 59-be, while IntI3 showed its highest recombination frequency of 2.29 ?? 10-1?? when the aadB and orfA 59-be were used. Additionally, the real-time PCR assay was used assess the levels of IntI activity over time. Using this method, the level of recombination as time progressed remained stable at a level of 4.10 ?? 10-2????. MDR was also analysed in 37 Acinetobacter baumannii isolates which were collected from four hospitals in Sydney. Minimum inhibitory concentration (MIC) analysis to 25 antibiotics revealed that all isolates showed a reduced susceptibility to between five and 24 antibiotics. PCR was performed to detect the presence of resistance determinants. Class 1 integrons encoding resistance to aminoglycosides, antiseptics and disinfectants were found in 35 % (13/37) of the isolates. Aminoglycoside resistance genes including aphA1 (12/37), strA (1/37) and strB (22/39) were also found. Resistance to beta-lactams was also observed in all isolates, which correlated with the presence of the ampC and blaOXA-51-like genes. The insertion sequence ISAba1 which provides an alternative promoter leading to increased gene expression was found upstream of the ampC gene in 29 isolates; the same isolates also contained the identical insertion sequence upstream of the carbapenemase resistance gene blaOXA-23. These 29 isolates also possessed the tetracycline resistance gene tetB. All but one of these 29 isolates also contained the gene blaTEM-1. Resistance to quinolones and fluoroquinolones was attributed to the presence of a Ser83-Leu83 gyrA mutation present in 36 resistant isolates. Furthermore, a putative dihydrofolate resistance gene, folA, was found in all isolates. Repetitive extragenic palindromic PCR revealed the presence of seven clonal groups. Overall, this study demonstrated the widespread impact and dissemination of MDR within nosocomial settings in Australia. The use of new assays, such as the real-time PCR assay developed in this thesis, is essential to the understanding of dissemination of antibiotic resistance.

Made available in DSpace on 2015-12-06T22:54:31Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O presente estudo teve como objetivo determinar as β)lactamases envolvidas na resistência às cefalosporinas de amplo espectro em uma coleção de Pseudomonas aeruginosa isoladas de hemoculturas de pacientes internados em um complexo hospitalar universitário na cidade de São Paulo durante o ano de 2005. No primeiro trabalho descrevemos a produção de CTX)M)2 em um isolado que apresentava o estranho fenótipo de sensibilidade à ceftazidima e resistência à cefepima. O gene que codificava esta enzima estava localizado no cromossomo bacteriano, em um contexto genético idêntico àquele encontrado em plasmídeos que carregam blaCTX)M)2, que encontram)se disseminados entre enterobactérias. No segundo trabalho, descrevemos as β)lactamases envolvidas na resistência à ceftazidima em 43 isolados de P. aeruginosa da referida coleção, assim como o contexto e suporte no qual estavam inseridos os genes que codificavam as enzimas identificadas. Além disso, realizamos a tipagem molecular dos isolados estudados e pesquisamos os prontuários médicos dos pacientes infectados pelas amostras estudadas. A hiperprodução de AmpC foi considerada a única β)lactamase relacionada à resistência a ceftazidima em quatro isolados (9,3 por cento). Nove isolados (20,9 por cento) apresentaram a produção de β)lactamase de espectro estendido (ESBL), sendo que sete (16,3 por cento) apresentavam a enzima GES)1 e dois isolados (4,6 por cento) apresentavam a enzima CTX)M)2. A atividade hidrolítica contra os carbapenens foi detectada em trinta isolados (69,7 por cento), nos quais as enzimas IMP)1, GES) 5 e SPM)1 foram identificadas em 1, 2 e 27 isolados, respectivamente. Nenhum isolado apresentou produção simultânea de metalo)β)lactamase e ESBL. Os genes blaSPM)1 e blaCTX)M)2 estavam associados às seqüências de inserção ISCR4 e ISCR1, respectivamente, enquanto que os genes blaGES)1, blaGES)5 e blaIMP)1 estavam localizados em integrons da classe 1. Todos os genes codificadores de β)lactamases identificados apresentavam localização cromossomal. A tipagem molecular dos isolados estudados evidenciou a existência de sete genótipos distintos; porém, isolados produtores de uma mesma enzima freqüentemente apresentavam relação clonal. A análise dos prontuários médicos revelou que metade dos pacientes que apresentaram infecção da corrente sanguínea pelos isolados de P. aeruginosa estudados receberam terapia inadequada. Este estudo permitiu identificar a diversidade de genes codificadores de β)lactamases de amplo espectro hidrolítico que foram adquiridos por isolados clínicos de P. aeruginosa. Estes genes foram inseridos no DNA cromossomal destes isolados e, posteriormente, disseminados por transmissão cruzada.. / The aim of this study was to identify the β-lactamases involved in broad-spectrum cephalosporin resistance in P. aeruginosa isolates recovered from blood culture of patients hospitalized at a Brazilian teaching hospital located in São Paulo, between January and December 2005. In the first manuscript we have described the production of CTX-M-2 causing ceftazidime susceptibility and cefepime resistance in a P. aeruginosa clinical isolate. The CTX-M-2-encoding gene was located at the bacterial chromosome, and its vicinities were identical to those observed in blaCTX-M-2-carrying plasmids from enterobacterial isolates. In the second manuscript we have evaluated 43 ceftazidime-resistant P. aeruginosa isolates from the referred collection. We have described the β-lactamases involved in ceftazdidme resistance, as well as the genetic context and support of β-lactamaseencoding genes and we have performed molecular typing of isolates. The medical records of patients infected with isolates studied were also analyzed. AmpC overproduction was found to be the only β-lactamase-mediated mechanism responsible for ceftazidime resistance in four isolates (9.3%). Nine isolates (20.9%) produced an extended-spectrum β-lactamase (ESBL), either GES-1 (n = 7, 16.3%) or CTX-M-2 (n = 2, 4.6%). Carbapenemase activity was detected in 30 (69,7%) isolates, in which two (4.6%) produced the ESBL GES-5, a single isolate (2.3%) produced the metallo-β-lactamase (MBL) IMP-1; and 27 isolates produced the MBL SPM-1 (62.8%). None of the isolates coproduced both ESBL and MBL. Insertion sequence elements ISCR4 and ISCR1 were associated with blaSPM-1 and blaCTX-M-2 genes, respectively, whereas the blaGES and blaIMP-1 genes were part of class 1 integron structures. All β- lactamase-encoding genes identified were chromosomally located. Molecular typing showed the existence of seven distinct genotypes, in which producers of the same β- lactamase often belonged to a single clone. Clinical data revealed that half of the patients infected with isolates studied have received inadequate therapy, suggesting that empirical treatment protocols should be updated in the hospital studied. In this study we have identified a variety of broad-spectrum β-lactamase-encoding genes that have been initially acquired by P. aeruginosa clinical isolates, inserted on its chromosomal DNA and then spread between patients by cross-transmition. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Gram-negative bacteria are able to cause many infections including blood stream infections (BSI).These bacteria may become resistant to antibiotics, often by acquiring genes in the presence of antibiotic selection pressure. Multi drug resistant Gram-negative bacteria have become an increasing problem worldwide. A study of antibiotic resistance in Gram-negative bacteria isolated from blood cultures from patients in the New Royal Infirmary of Edinburgh (NRIE) was performed. In addition, a study was performed on isolates from patients in an intensive care unit in Egypt. All isolates were investigated for susceptibility to an extensive range of antibiotics. Gram-negative bacteria from Edinburgh found to be resistant to either cefotaxime or ceftazidime were investigated further. Among the cefotaxime/ceftazidime resistant isolates, Polymerase Chain Reaction (PCR) analysis revealed the presence of CTX-M- β-lactamases. Seven E.coli isolates were found to have CTX-M-15 β-lactamases while the CTX-M-14 β-lactamase was detected in six Enterobacter cloacae. The insertion sequence ISEcp1 was detected upstream of the blaCTX-M-15 gene in some isolates while IS26 was found truncating the ISEcp1 in other isolates. Conjugation experiments found the blaCTX-M-15 gene was transferable to E. coli J62-2. All the isolates had detectable plasmids, a plasmid ~260kb carried the blaCTX-M-15 gene. Analysis of the -containing isolates by PFGE shows that those carrying the CTX-M-14 β-lactamase were identical indicating cross infection within the hospital. The CTX-M- 15 β-lactamase-containing isolates showed four isolates had ≥85% similarity but the others were diverse. Class 1 integrons were found in eight of the CTX-M β-lactamase containing isolates with the associated gene cassette and sul1 gene. The isolates from Egypt were found to be resistant to carbapenem, which is the final mainstream antibiotic option in the treatment of multidrug resistant Gram-negative bacteria. Further analysis revealed all carried the CTX-M-14 β-lactamase and two additionally carried the VIM-4 metallo β-lactamase, which accounted for the resistance to the carbapenems. Furthermore, the insertion sequence ISEcp1 was found upstream of the blaCTX-M-14 gene in two of the isolates. The blaVIM-4 gene was found to be part of the gene cassette in the class 1 integron associate with complex ISCR1. Two of the Egyptian isolates had a detectable plasmid, ~300kb in size, which carried both blaCTX-M-14 and blaVIM-4 genes. All the blood culture isolates were examined to ascertain the persistence of sulphonamide resistance despite the long-term prescribing reduction on this antibacterial. PCR was performed to detect sul1, sul2 and sul3 genes in all the isolates. Of the sulphonamide resistant isolates 25 carried the sul1, 27 carried the sul2 and none carried the sul3 genes. Eight isolates had both the sul1 and sul2 genes. Most of the isolates carried sul1 had Int1 as part of the same class 1 integron. Interestingly three isolates were PCR negative for sul1 but positive for sul2 and int1. Int2 and 3 were found in 3 and 2 isolates respectively. The class 1 integron contained different insert gene cassettes; dfrA (dfrA17, dfrA16, dfrA15), aadA (aadA5, aadA2, aadA1) and blaOXA-1 families in addition to the resident sul gene. In conclusion this thesis shows the diversity of the genetic environment and carriers of the CTX-M β-lactamases within the same hospital. Sulphonamide resistance in Gram-negatives persists despite the prescribing reduction of this antibacterial in a Scottish hospital and the recommended constraint on the use of sulphonamide.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:05:33Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / CAPES: BEX0612/02-2 / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Acinetobacter baumannii é um dos principais patógenos associados a infecções nosocomiais, incluindo pneumonias, meningites secundárias, infecções urinárias e bacteremias. Esse microrganismo apresenta uma grande capacidade de se disseminar, além de adquirir novos mecanismos de resistência. Devido a essas propriedades, numerosos surtos de Acinetobacter baumannii multirresistente têm sido relatados em diversos países, inclusive no Brasil. O objetivo deste estudo foi analisar mecanismos envolvidos na resistência em Acinetobacter baumannii, avaliando a relação de elementos promotores com o aumento da resistência aos carbapenêmicos, além de analisar a presença de integrons envolvidos na disseminação de genes de resistência. Este foi um estudo transversal experimental no qual foram incluídas amostras provenientes de cinco hospitais da cidade de Porto Alegre obtidas no período de julho de 2007 a junho de 2008. Foram selecionados 41 isolados resistentes aos carbapenêmicos representantes de diferentes clones determinados por pulsed field gel eletrophoresis (PFGE) além de 17 amostras sensíveis aos carbapenêmicos, totalizando 58 isolados no estudo. Todos os isolados analisados apresentaram o gene blaOXA-51-like, caracterizando a espécie A. baumannii. Integrons de classe 2 foram os mais prevalentes (50; 86.2%) nos isolados testados, entretanto, integrons de classe 1 (15; 25.9%) também foram detectados. O elemento de inserção ISAba1 foi evidenciado em associação com o gene blaOXA-23-like em 36 isolados resistentes, e demonstrou uma significativa relação (p<0,001) com o aumento das concentrações inibitórias mínimas (MICs) dos carbapenêmicos imipenem e meropenem. A associação de ISAba1 com blaOXA-51-like não apresentou relação com aumento das MICs para os carbapenêmicos. A partir dos dados mostrados nesse trabalho, demonstramos a importância do elemento ISAba1, quando associado ao gene blaOXA-23-like, no aumento dos níveis de resistência aos carbapenêmicos meropenem e imipenem. A presença de integrons em todos os isolados resistentes aos carbapenêmicos reitera a importância desses elementos na disseminação de determinantes da resistência entre isolados de A. baumannii.

Acinetobacter baumannii é um dos principais patógenos associados a infecções nosocomiais, incluindo pneumonias, meningites secundárias, infecções urinárias e bacteremias. Esse microrganismo apresenta uma grande capacidade de se disseminar, além de adquirir novos mecanismos de resistência. Devido a essas propriedades, numerosos surtos de Acinetobacter baumannii multirresistente têm sido relatados em diversos países, inclusive no Brasil. O objetivo deste estudo foi analisar mecanismos envolvidos na resistência em Acinetobacter baumannii, avaliando a relação de elementos promotores com o aumento da resistência aos carbapenêmicos, além de analisar a presença de integrons envolvidos na disseminação de genes de resistência. Este foi um estudo transversal experimental no qual foram incluídas amostras provenientes de cinco hospitais da cidade de Porto Alegre obtidas no período de julho de 2007 a junho de 2008. Foram selecionados 41 isolados resistentes aos carbapenêmicos representantes de diferentes clones determinados por pulsed field gel eletrophoresis (PFGE) além de 17 amostras sensíveis aos carbapenêmicos, totalizando 58 isolados no estudo. Todos os isolados analisados apresentaram o gene blaOXA-51-like, caracterizando a espécie A. baumannii. Integrons de classe 2 foram os mais prevalentes (50; 86.2%) nos isolados testados, entretanto, integrons de classe 1 (15; 25.9%) também foram detectados. O elemento de inserção ISAba1 foi evidenciado em associação com o gene blaOXA-23-like em 36 isolados resistentes, e demonstrou uma significativa relação (p<0,001) com o aumento das concentrações inibitórias mínimas (MICs) dos carbapenêmicos imipenem e meropenem. A associação de ISAba1 com blaOXA-51-like não apresentou relação com aumento das MICs para os carbapenêmicos. A partir dos dados mostrados nesse trabalho, demonstramos a importância do elemento ISAba1, quando associado ao gene blaOXA-23-like, no aumento dos níveis de resistência aos carbapenêmicos meropenem e imipenem. A presença de integrons em todos os isolados resistentes aos carbapenêmicos reitera a importância desses elementos na disseminação de determinantes da resistência entre isolados de A. baumannii.

Acinetobacter baumannii é um dos principais patógenos associados a infecções nosocomiais, incluindo pneumonias, meningites secundárias, infecções urinárias e bacteremias. Esse microrganismo apresenta uma grande capacidade de se disseminar, além de adquirir novos mecanismos de resistência. Devido a essas propriedades, numerosos surtos de Acinetobacter baumannii multirresistente têm sido relatados em diversos países, inclusive no Brasil. O objetivo deste estudo foi analisar mecanismos envolvidos na resistência em Acinetobacter baumannii, avaliando a relação de elementos promotores com o aumento da resistência aos carbapenêmicos, além de analisar a presença de integrons envolvidos na disseminação de genes de resistência. Este foi um estudo transversal experimental no qual foram incluídas amostras provenientes de cinco hospitais da cidade de Porto Alegre obtidas no período de julho de 2007 a junho de 2008. Foram selecionados 41 isolados resistentes aos carbapenêmicos representantes de diferentes clones determinados por pulsed field gel eletrophoresis (PFGE) além de 17 amostras sensíveis aos carbapenêmicos, totalizando 58 isolados no estudo. Todos os isolados analisados apresentaram o gene blaOXA-51-like, caracterizando a espécie A. baumannii. Integrons de classe 2 foram os mais prevalentes (50; 86.2%) nos isolados testados, entretanto, integrons de classe 1 (15; 25.9%) também foram detectados. O elemento de inserção ISAba1 foi evidenciado em associação com o gene blaOXA-23-like em 36 isolados resistentes, e demonstrou uma significativa relação (p<0,001) com o aumento das concentrações inibitórias mínimas (MICs) dos carbapenêmicos imipenem e meropenem. A associação de ISAba1 com blaOXA-51-like não apresentou relação com aumento das MICs para os carbapenêmicos. A partir dos dados mostrados nesse trabalho, demonstramos a importância do elemento ISAba1, quando associado ao gene blaOXA-23-like, no aumento dos níveis de resistência aos carbapenêmicos meropenem e imipenem. A presença de integrons em todos os isolados resistentes aos carbapenêmicos reitera a importância desses elementos na disseminação de determinantes da resistência entre isolados de A. baumannii.

The genus Salmonella, comprised of 2400 serotypes, is one of the leading causes of foodborne illnesses in the US and has been used for the deliberate contamination of food. A rapid system for detection, isolation, typing and antibiotic susceptibility profiling is essential for diagnosis and source tracking in natural outbreaks or a bioterrorism event. Pure culture is essential for molecular typing and antibiotic resistance testing. The virulence and the resistance mechanisms of Salmonella are rapidly evolving and many are still unexplained. The first aim of the study was to rapidly detect and isolate Salmonella from intentionally contaminated food. The second aim was to build a DNA fingerprinting database for accurate identification of the subtype. The third objective was to study the antibiotic susceptibility patterns and the underlying mechanisms of resistance. A correlation between the DNA subtypes and antibiograms was hypothesized. An association between the resistance determinants and pathogenicity genes was expected. A total of 114 isolates including environmental and clinical sources were tested. General and selective enrichments and immunomagnetic separation (IMS) were tested for rapid detection and isolation of Salmonella from eight food groups. Isolates were subtyped by pulsed field gel electrophoresis (PFGE) and automated RiboPrinter®. Resistance to 31 drugs was tested by the Sensititre® system and integrons were identified by PCR. The association between virulence and resistance was verified by Southern hybridization. Of the three genes tested, ompF was found to be the most reliable target for identifying Salmonella subspecies I, III and IV. Detection by real time PCR after enrichment in buffered peptone water and isolation by IMS provided the fastest results. Sixty two ribotypes and 74 pulsotypes were observed for the 100 isolates subtyped. Sixty isolates were resistant to one or more antimicrobials and 12 had class-1 integrons. In conclusion, pure culture was achieved in 25 hours by IMS. Ribotyping, a comparatively rapid technique was found to be ideal for initial identification. PFGE, which was more discriminatory, was appropriate for source tracking. Contrary to the original hypothesis, no correlation between subtyping and antibiograms was observed and no association of integrons with the virulence genes tested was demonstrated