LIMA, K. A. Estudo do potencial convulsivante de compostos carbapenêmicos em modelo de convulsão induzido por pilocarpina in vivo e in vitro. 2017. 84 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Farmacologia Pós-Graduação (posgfarmacologia@gmail.com) on 2017-09-19T12:25:43Z No. of bitstreams: 1 2017_dis_kalima.pdf: 2047350 bytes, checksum: 43b31c2e36ab057817ee3bbc4b329e8b (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-09-19T15:30:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_dis_kalima.pdf: 2047350 bytes, checksum: 43b31c2e36ab057817ee3bbc4b329e8b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-19T15:30:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_dis_kalima.pdf: 2047350 bytes, checksum: 43b31c2e36ab057817ee3bbc4b329e8b (MD5) Previous issue date: 2017-07-17 / Infectious diseases of bacterial etiology have always been a serious problem for societies, not only because of their easy and rapid spread, but also because of the high mortality they cause. Treatment of these infections requires the therapeutic use of antibiotics. Carbapenems are antimicrobial drugs belonging to the β-lactam group and act by inhibiting bacterial cell wall synthesis. Treatment with these drugs can trigger several adverse effects such as nausea, rash, leucopenia, thrombocytopenia, nephrotoxicity and neurotoxicity. The risk of neurotoxicity is inherent in all class representatives, but seizure incidence may vary between drugs. This study aimed to study the effects of carbapenems (imipenem, meropenem and ertapenem) on pilocarpine induced seizure in mice. Male Swiss mice (28-34g) were pretreated with these antimicrobials at doses of 100mg / kg and 200mg / kg for 7 days. Two hours after the last dose of each drug, seizure was induced in all animals by the administration of pilocarpine 400 mg / kg ip. In the behavioral analysis, the times for the first seizure and death were recorded and, after the tests , Three brain areas (pre-frontal cortex, hippocampus and striatum) were dissected to determine the degree of lipid peroxidation, malondialdehyde concentration (MDA), nitrite concentration and the participation of the antioxidant defense glutathione reductase (GSH). Data were analyzed by ANOVA and Student-Newman-Keuls as post-test. All antibiotics were found to reduce seizure and death latencies at doses of 100 and 200 mg / kg with significance (p <0.001). Regarding the parameters of oxidative stress, there was an increase in MDA levels in all areas of the groups treated with antimicrobials at doses of 100 and 200 mg / kg, however, the groups receiving pilocarpine increased in all areas only At the dose of 200mg / kg. Nitrite concentration is also elevated in most areas at doses of 100 and 200 mg / kg and in groups receiving pilocarpine. A reduction in GSH concentration was observed in all areas of the antimicrobial groups at doses of 100 and 200 mg / kg relative to the healthy group. Therefore, our findings corroborate with the pro-convulsive activity of these antimicrobials already described in other studies, however, we suggest a participation of cholinergic mechanisms not previously described. / As doenças infeciosas de etiologia bacteriana foram sempre um grave problema para as sociedades, não só pela sua fácil e rápida propagação, como pela elevada mortalidade que causam. O tratamento destas infeções requer o uso terapêutico de antibióticos. Os carbapenêmicos são fármacos antimicrobianos que pertencem ao grupo β-lactâmicos e atuam inibindo a síntese da parede celular bacteriana. O tratamento com esses fármacos pode desencadear vários efeitos adversos como náuseas, erupções cutâneas, leucopenia, trombocitopenia, nefrotoxicidade e neurotoxicidade. O risco de neurotoxicidade é inerente a todos os representantes da classe, mas incidência da convulsão pode variar entre os fármacos. Este trabalho teve como objetivo estudar os efeitos dos carbapenêmicos (imipenem, meropenem e ertapenem) em modelo de convulsão induzida por pilocarpina em camundongos. Camundongos Swiss machos (28-34g), (n=8), foram pré-tratados com esses antimicrobianos nas doses de 100mg/kg e 200mg/kg por 7 dias. Duas horas após a última dose de cada fármaco foi induzida a convulsão em todos os animais através da administração de pilocarpina 400 mg/kg, via i.p.. Na análise comportamental, foram registrados os tempos para ocorrência da primeira convulsão e morte e, após os testes, foram dissecadas três áreas cerebrais (córtex pré-frontal, hipocampo e corpo estriado) para determinar o grau de peroxidação lipídica, a concentração de malondialdeido (MDA), a concentração de nitrito e a participação da defesa antioxidante glutationa redutase (GSH). Os dados foram analisados por ANOVA e Student-Newman-Keuls como pós-teste. Foi observado que todos os antibióticos reduziram a latência de convulsão e de morte nas doses de 100 e 200 mg/kg com significância (p<0,001). Em relação aos parâmetros de estresse oxidativo, houve aumento dos níveis de MDA em todas as áreas dos grupos tratados com os antimicrobianos nas doses de 100 e 200 mg/kg, no entanto, os grupos que receberam pilocarpina, houve aumento em todas as áreas apenas na dose de 200mg/kg. A concentração de nitrito também se encontra elevada na maioria das áreas nas doses de 100 e 200 mg/kg e nos grupos que receberam pilocarpina. Observou-se uma redução na concentração de GSH em todas as áreas dos grupos tratados com os antimicrobianos nas doses de 100 e 200 mg/kg em relação ao grupo sadio. Portanto, nossos achados corroboram com a atividade pró-convulsivante desses antimicrobianos já descrita em outros estudos, no entanto, sugerimos uma participação de mecanismos colinérgicos não descrita anteriormente.

Submitted by Isaac Francisco de Souza Dias (isaac.souzadias@ufpe.br) on 2016-07-18T18:44:57Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE GUILHERME VERAS 19 OUT-MM.pdf: 2315237 bytes, checksum: dfde31585678c4be265e3df28d667cb7 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-18T18:44:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE GUILHERME VERAS 19 OUT-MM.pdf: 2315237 bytes, checksum: dfde31585678c4be265e3df28d667cb7 (MD5) Previous issue date: 2014-11-10 / Objetivo: Avaliar o resultado do tratamento com meropenem intravenoso de peritonite grave em ratos com diferentes idades. Métodos: Trinta ratos Wistar estratificados em três grupos: grupo I - seis meses de idade; grupo II - 12 meses de idade; e grupo III - 18 meses de idade, submetidos à indução de peritonite autógena com suspensão de fezes a 10% (6ml/kg de rato), foram tratados com meropenem intravenoso na dose única de 40mg/Kg de rato. Os animais que sobreviveram foram acompanhados por 45 dias. Os parâmetros das variáveis quantitativas foram expressos por suas médias e pelo erro padrão da média (EPM) e p < 0,05 foi usado para rejeitar a hipótese de nulidade. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais. Resultados: A mortalidade foi igual para os grupos I e II (10%). No grupo III, 4 dos 10 animais morreram nas primeiras 24 horas e mais 4 até 48 horas. De interesse, mesmo os ratos jovens que sobreviveram apresentaram abscessos residuais nas cavidades abdominal e torácica, embora tenham evoluído com vida quase normal. Com exceção de um rato do grupo I, todos os animais sobreviventes dos três grupos apresentaram hemocultura negativa. Conclusões: O tratamento da peritonite fecal autógena grave com meropenem intravenoso alcançou bons resultados em ratos com seis e doze meses de idade, mesmo considerando os abscessos residuais na cavidade abdominal e torácica. No entanto, 8 dos 10 ratos idosos (80%) não conseguiram superar o desafio infeccioso inicial, provando que o envelhecimento é um fator de risco muito importante no prejuízo da resposta imunológica. Assim, a sepse continua a ser uma situação desafiadora, especialmente em idosos. / Purpose: To evaluate the treatment outcome of severe peritonitis treated with intravenous meropenem in rats with increasing age. Methods: Thirty Wistar rats stratified in three groups: group I – six month-old; group II – 12 month-old; and group III – 18 month-old, underwent autogenously fecal peritonitis (6 ml/kg rat), were treated with intravenous meropenem at a single dose of 40 mg/kg of rat. The survival animals were followed-up for 45 days. The parameters of the quantitative variables were expressed as means and standard error of the mean (SEM) and p <0.05 was used to reject the null hypothesis. The study was approved by the Ethics Committee on Animal Use. Results: Mortality was similar for groups I and II (10%). In group III, 4 of 10 animals died within the first 24 hours and 4 more up to 48 hours. Of interest, even young rats that survived had residual abscesses in both the abdominal and thoracic cavities, although they were living an almost normal life. Except for one rat in group I, all surviving animals of the three groups showed a negative blood culture. Conclusions: The outcome of severe autogenously peritonitis in rats treated with intravenous meropenem in rats was good in animal with ages of six and twelve months, even considering the residual abscesses in the abdominal and chest cavities. However, 8 of 10 elderly rats (80%) could not overcome the initial infectious challenge, proving that aging is an important risk factor in the loss of immune response. Thus, sepsis continues to be a challenging situation, especially in the

Acinetobacter baumannii é considerado um dos patógenos de maior importância clínica atualmente, sendo responsável por uma variedade de infeções nosocomiais como, bacteremias, infecções no trato urinário, pneumonias associadas a ventilação mecânica, meningites secundárias e infecções em feridas. Desde a última década o tratamento de infecções por Acinetobacter spp. vem sendo dificultado pela emergência de cepas multirresistentes. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi determinar a dinâmica populacional e as características moleculares envolvidas na resistência de Acinetobacter spp. Foram avaliados isolados de Acinetobacter spp. provenientes de seis hospitais da cidade de Porto Alegre coletados entre janeiro de 2013 e março de 2014. A espécie Acinetobacter baumannii foi identificada pela presença do gene blaOXA-51, além de PCR multiplex para o gene gyrB. Carbapenemases (blaNDM, blaOXA-23-like, blaOXA-24/40-like, blaOXA-58-like e blaOXA-143-like), além dos integrons de classe 1 e 2 foram pesquisados por PCR. Um total de 524 isolados de Acinetobacter spp. foram coletados, e a maioria (487/92,9%) foram identificados como A. baumannii, seguidos pelas espécies A. nosocomialis (9/1,7%), A. pittii (3/0,6%), A. calcoaceticus (3/0,6%) e por fim, 22 (4,2%) isolados não pertenciam ao complexo A. baumannii-calcoaceticus. Quanto ao perfil de sensibilidade, 83% dos isolados demonstraram não ser sensíveis aos carbapenêmicos (imipenem e meropenem). Dos isolados de A. baumannii, 429 (88,1%) continham o gene blaOXA-23, além disso, foram observados dois isolados de A. nosocomialis contendo o gene blaOXA-23. Foi possível identificar dois isolados de A. baumannii produtores de blaOXA24/40 (0,8%) pela primeira vez na região Sul do país. A análise do gene por sequenciamento caracterizou como sendo a variante blaOXA-72, e a tipagem por MLST caracterizou os isolados como pertencentes a ST730 (CC79). Também foram analisados por MLST, isolados produtores de OXA-72 do estado de São Paulo e do Paraná. A análise dos dados demonstrou que estes isolados estão associados aos complexos clonais epidêmicos CC15 e CC79. A pesquisa para o gene blaNDM foi positiva para um isolado de A. pittii, sendo o primeiro isolado de Acinetobacter não baumannii produtor de NDM-1 no Brasil. A análise do contexto genético de blaNDM-1 demonstrou a presença de ISAba125 upstream ao gene, além disso, o gene demonstrou estar localizado no cromossomo da bactéria. Foi observada uma maior prevalência de integrons de classe 2 nos isolados avaliados (134/25,5%), quando comparada aos integrons de classe 1 (72/13,7%). Raros (2/0,4%) isolados apresentaram ambas as classes de integrons. Um total 244 isolados de A. baumannii resistentes aos carbapenêmicos foram submetidos à tipagem por REP-PCR, que demonstrou a presença de 20 grupos clonais entre os isolados analisados. Isolados de diferentes grupos clonais foram selecionados para a tipagem por MLST. Com o objetivo de realizarmos uma análise longitudinal dos clones circulantes desde o primeiro surto de Acinetobacter baumannii resistente aos carbapenêmicos (CRAB) na cidade de Porto Alegre, também foram selecionados para análise por MLST isolados de A. baumannii pertencentes ao nosso banco de dados com diferentes perfis clonais, coletados entre 2007 e 2008. Através da análise dos dados gerados pelo MLST no banco de dados do Instituto Pasteur, foram descritas 13 novas STs: ST883 (CC32), ST884 (CC221), ST885 (CC79), ST886, ST887, ST888, ST889 (CC464), ST892 (CC15), ST899, ST902 (CC1), ST903 (CC79), ST904 (CC15) e ST905 (CC32). A avaliação da dinâmica populacional de A. baumannii nos dois períodos avaliados demonstrou a permanência de isolados pertencentes aos complexos clonais CC15 e CC79 desde o período do primeiro surto de CRAB da cidade de Porto Alegre até o ano de 2014, demonstrando a capacidade desses clones de se manter por longos períodos no ambiente hospitalar. Além disso, estes CCs apresentaram uma elevada prevalência durante o primeiro período avaliado (2007-2008). Este dado que nos permite inferir que o primeiro surto de CRAB produtor de OXA-23 da cidade de Porto Alegre foi relacionado a disseminação de CC15 e CC79. / Acinetobacter baumannii is considered one of the main pathogens of clinical importance currently, being responsible for a wide range of nosocomial infections such as, bacteremias, urinary tract infections, ventilator-associated pneumonia, secondary meningitis and wound infections. Since the last decade the treatment of these infections has been impaired by the emergence of multiresistant strains. In this context, the aim of this study was to determine the population dynamic and the molecular characteristics involved in Acinetobacter spp. resistance. A total of 524 Acinetobacter spp. isolates were collected from six Porto Alegre hospitals from January 2013 to March 2014. A. baumannii species were identified by the presence of blaOXA-51 gene and by the gyrB multiplex PCR. Carbapenemase genes (blaNDM, blaOXA-23-like, blaOXA-24/40-like, blaOXA-58-like and blaOXA-143-like) as well as class 1 and 2 integrons were investigated by PCR. As expected, the majority (487/92.9%) of isolates were identified as A. baumannii, followed by A. nosocomialis (9/1.7%), A. pittii (3/0.6%), and A. calcoaceticus (3/0.6%). A total of 22 (4.2%) isolates were not identified as A. baumannii-calcoaceticus complex. Analysis of the susceptibility profile demonstrated that 83% of the isolates were not susceptible to carbapenems (imipenem e meropenem). Among the A. baumannii isolates, 429/487 (88.1%) presented blaOXA-23 gene. Two A. nosocomialis isolates also presented the blaOXA-23 gene. We also found, for the first time in Southern Brazil, two A. baumannii isolates containing blaOXA24/40 (0.8%). The sequencing of blaOXA24/40 identified the variant blaOXA-72, and MLST analysis characterized both isolates as ST730 (CC79). In addition, OXA-72-producing A. baumannii isolates from the states of São Paulo and Paraná were analyzed by MLST. Data analysis demonstrated that the isolates were associated to the clonal complexes CC15 and CC79. The screening of blaNDM gene was positive for an A. pittii isolate. Therewith, in the present study we described for the first time a Acinetobacter non-baumannii producing NDM-1 in Brazil. Analysis of the genetic environment of blaNDM-1 gene demonstrated the presence of ISAba125 upstream of the gene and that the gene was chromosome-located in A. pittii. It was observed an increased prevalence of class 2 integrons (134/25.5%) compared to class 1 integrons (72/13.7%). Only a few isolates presented both classes (2/0.4%). A total of 244 carbapenem-resistant A. baumannii isolates were typed by REP-PCR, which demonstrated the presence of 20 clonal groups. Isolates belonging to different clonal groups were selected for MLST typing. In order to conduct a longitudinal analysis of circulating clones from the first CRAB outbreak in the city of Porto Alegre, we also selected A. baumannii isolates with different clonal profiles collected between 2007 and 2008. According to MLST database from Pasteur Institute, we identified 13 new STs: ST883 (CC32), ST884 (CC221), ST885 (CC79), ST886, ST887, ST888, ST889 (CC464), ST892 (CC15), ST899, ST902 (CC1), ST903 (CC79), ST904 (CC15) and ST905 (CC32). The analysis of A. baumannii population dynamics in the two periods of the study demonstrated the persistence of the clonal complexes CC15 and CC79 from the first CRAB outbreak in Porto Alegre city, up to the year of 2014. Besides, these CCs presented a high prevalence during the first period (2007-2008) evaluated. These data allow us to infer that the first CRAB OXA-23-producing outbreak in Porto Alegre city was related to the dissemination of CC15 and CC79.

Acinetobacter baumannii é um patógeno nosocomial que está envolvido em um amplo espectro de infeções hospitalares. A maior preocupação atual é devido a sua alta capacidade de adquirir mecanismos de resistência, principalmente aos carbapenêmicos, fármacos utilizados normalmente para o tratamento dessas infecções. Desta forma, as opções terapêuticas tornam-se restritas e por isso, as polimixinas (polimixina B e colistina) voltaram a serem utilizadas na prática clínica. A heterorresistência a colistina já foi descrita em estudos recentes com isolados de A. baumannii e outros estudos detectaram a presença de resistência adaptativa as polimixinas. O objetivo deste estudo foi investigar a presença do fenômeno de heterorresistência e resistência adaptativa a polimixina B, e avaliar sua estabilidade. A pesquisa foi feita em isolados pertencentes a 15 clones diferentes de A. baumannii resistentes aos carbapenênicos e sensíveis a polimixina B. A avaliação da heterorresistência foi feita através da análise do perfil da população (PAP) para 29 isolados, selecionados aleatoriamente (pelo menos um de cada clone). A indução da resistência foi avaliada para 22 isolados, selecionados aleatoriamente (pelo menos um de cada clone), submetendo os isolados ao cultivo em concentrações crescentes de polimixina B. A determinação da estabilidade das subpopulações e da indução da resistência foi feita através de passagens, em dias consecutivos, em meio livre de antibiótico. Foram consideradas subpopulações heterogêneas aquele isolado que possuía colônias com uma CIM maior do que a população original para polimixina B. A CIM foi reavaliada após 75 e 60 dias de estocagem em -80ºC para os isolados que apresentaram subpopulação heterogênea ou indução da resistência para a polimixina B, respectivamente. Dos 29 isolados, submetidos a avaliação da heterorresistência, 26 (90%) apresentaram subpopulações heterogêneas para polimixina B. Nenhum isolado apresentou subpopulação superior a 2 μg/mL para polimixina B, ou seja, não foi encontrado neste estudo subpopulações heterorresistentes. As CIMs das subpopulações heterogêneas permaneceram iguais após os subcultivos em meio livre de antibiótico, mas quando a CIM foi reavaliada depois da estocagem, os valores obtidos foram os mesmos da população original. Dos 22 isolados submetidos a indução de resistência, 12 (55%) apresentaram algum crescimento até a concentração de 64 μg/mL de polimixina B. Após as passagens em meio livre de antibiótico a CIM diminuiu, voltando a CIM original na reavaliação após a estocagem a -80ºC. Este estudo mostra pela primeira vez a avaliação da heterorresistência e indução da resistência para polimixina B em isolados de A. baumannii resistentes aos carbapenêmicos. O fenômeno de heterorresistência não foi encontrado neste estudo, no entanto, subpopulações com uma CIM maior do que a original foram identificadas em 90% dos isolados. As CIMs das subpopulações permaneceram estáveis após 4 dias de passagens em meio livre de antibiótico, mas retornaram a CIM original após estocagem, o que sugere o envolvimento de mecanismos moleculares neste fenômeno. A presença da resistência induzida a polimixina B foi detectada em 55% dos isolados, sugerindo que este fenômeno pode ser comum entre os isolados de A. baumannii resistentes aos carbapenêmicos, frente a polimixina B. Embora a presença de subpopulações heterogêneas e a indução da resistência a polimixina B tenha sido comum neste estudo, mais estudos são necessários para um melhor entendimento do significado clínico e das implicações terapêuticas destes dois fenômenos.

A capacidade de adquirir, com facilidade, resistência à terapia antimicrobiana torna-se uma das características mais estudadas em Acinetobacter sp., mundialmente conhecido por estar relacionado a surtos de infecções associadas à assistência a saúde (IAAS) e por ser apontado como um grave problema de saúde pública. Embora isolados clínicos desse gênero sejam extensivamente estudados quanto à presença e a diversidade de genes do tipo OXA-carbapenemases,existem poucos estudos sobre essa relação em isolados ambientais. Este trabalho teve como objetivo determinar a presença de carbapenemases do tipo OXA (e sua diversidade), de ISAba1 e de sua relação com as carbapenemases em isolados clínicos e de esgoto hospitalar de Acinetobacter sp. na cidade de Porto Alegre, Rio Grande do Sul. Um total de 310 isolados (145 clínicos e 165 ambientais) foram submetidos a análise por PCR das regiões genéticas de interesse. A diversidade dos genes do tipo blaOXA-51 foi realizada por DGGE. Os resultados indicam a presença do gene blaOXA-58 em um isolado, pela primeira vez no Brasil. A sequência ISAba1 foi frequentemente encontrada (92,9%), porém, a sua associação com blaOXA-51 foi baixa e encontrada em 9,8% dos isolados clínicos e em 6,5% dos isolados ambientais. A análise de diversidade revelou uma baixa freqüência de alelos de OXA-51 entre os isolados estudados, sendo blaOXA-65 a variante mais encontrada. Contudo, podemos afirmar que o esgoto hospitalar analisado constitui-se de uma fonte de contaminação de bactérias patogênicas e que as precárias políticas de saneamento podem proporcionar a disseminação de multirresistência para o meio ambiente. / The ability of easily acquiring resistance to antimicrobial therapy becomes one of the most studied features in Acinetobacter sp., world renowned for being related to outbreaks of infection associated with health care and for being appointed as a serious public health problem. Although clinical isolates of this genus are extensively studied for the presence and diversity of OXAcarbapenemase genes, there are few studies about this relationship in environmental isolates. This study aimed to determine the presence of OXAtype carbapenemases (and yours diversity), of ISAba1 and its relationship with carbapenemases in clinical and hospital sewage isolates of Acinetobacter sp. in Porto Alegre, Rio Grande do Sul. A total of 310 strains (145 of clinical origin and 165 of environmental origin) were subjected to PCR analysis of genetic regions of interest. The diversity of blaOXA-51-like genes was performed by DGGE. The results indicate the presence of the gene blaOXA-58 in an isolated, for the first time in Brazil. ISAba1 was frequently found (92.9%) but its association with blaOXA-51-like was low and was found in 9.8% of clinical isolates and in 6.5% of environmental isolates. The diversity analysis showed that there is a low frequency of alleles of OXA-51 among the studied isolates being blaOXA-65 variant the most often found. However, we can state that the hospital sewage is considered to be a source of pathogenic bacteria contamination and that the poor sanitation politics contributes to the spread of multidrug resistance in the environment.

A capacidade de adquirir, com facilidade, resistência à terapia antimicrobiana torna-se uma das características mais estudadas em Acinetobacter sp., mundialmente conhecido por estar relacionado a surtos de infecções associadas à assistência a saúde (IAAS) e por ser apontado como um grave problema de saúde pública. Embora isolados clínicos desse gênero sejam extensivamente estudados quanto à presença e a diversidade de genes do tipo OXA-carbapenemases,existem poucos estudos sobre essa relação em isolados ambientais. Este trabalho teve como objetivo determinar a presença de carbapenemases do tipo OXA (e sua diversidade), de ISAba1 e de sua relação com as carbapenemases em isolados clínicos e de esgoto hospitalar de Acinetobacter sp. na cidade de Porto Alegre, Rio Grande do Sul. Um total de 310 isolados (145 clínicos e 165 ambientais) foram submetidos a análise por PCR das regiões genéticas de interesse. A diversidade dos genes do tipo blaOXA-51 foi realizada por DGGE. Os resultados indicam a presença do gene blaOXA-58 em um isolado, pela primeira vez no Brasil. A sequência ISAba1 foi frequentemente encontrada (92,9%), porém, a sua associação com blaOXA-51 foi baixa e encontrada em 9,8% dos isolados clínicos e em 6,5% dos isolados ambientais. A análise de diversidade revelou uma baixa freqüência de alelos de OXA-51 entre os isolados estudados, sendo blaOXA-65 a variante mais encontrada. Contudo, podemos afirmar que o esgoto hospitalar analisado constitui-se de uma fonte de contaminação de bactérias patogênicas e que as precárias políticas de saneamento podem proporcionar a disseminação de multirresistência para o meio ambiente. / The ability of easily acquiring resistance to antimicrobial therapy becomes one of the most studied features in Acinetobacter sp., world renowned for being related to outbreaks of infection associated with health care and for being appointed as a serious public health problem. Although clinical isolates of this genus are extensively studied for the presence and diversity of OXAcarbapenemase genes, there are few studies about this relationship in environmental isolates. This study aimed to determine the presence of OXAtype carbapenemases (and yours diversity), of ISAba1 and its relationship with carbapenemases in clinical and hospital sewage isolates of Acinetobacter sp. in Porto Alegre, Rio Grande do Sul. A total of 310 strains (145 of clinical origin and 165 of environmental origin) were subjected to PCR analysis of genetic regions of interest. The diversity of blaOXA-51-like genes was performed by DGGE. The results indicate the presence of the gene blaOXA-58 in an isolated, for the first time in Brazil. ISAba1 was frequently found (92.9%) but its association with blaOXA-51-like was low and was found in 9.8% of clinical isolates and in 6.5% of environmental isolates. The diversity analysis showed that there is a low frequency of alleles of OXA-51 among the studied isolates being blaOXA-65 variant the most often found. However, we can state that the hospital sewage is considered to be a source of pathogenic bacteria contamination and that the poor sanitation politics contributes to the spread of multidrug resistance in the environment.

Acinetobacter baumannii é um dos principais patógenos associados a infecções nosocomiais, incluindo pneumonias, meningites secundárias, infecções urinárias e bacteremias. Esse microrganismo apresenta uma grande capacidade de se disseminar, além de adquirir novos mecanismos de resistência. Devido a essas propriedades, numerosos surtos de Acinetobacter baumannii multirresistente têm sido relatados em diversos países, inclusive no Brasil. O objetivo deste estudo foi analisar mecanismos envolvidos na resistência em Acinetobacter baumannii, avaliando a relação de elementos promotores com o aumento da resistência aos carbapenêmicos, além de analisar a presença de integrons envolvidos na disseminação de genes de resistência. Este foi um estudo transversal experimental no qual foram incluídas amostras provenientes de cinco hospitais da cidade de Porto Alegre obtidas no período de julho de 2007 a junho de 2008. Foram selecionados 41 isolados resistentes aos carbapenêmicos representantes de diferentes clones determinados por pulsed field gel eletrophoresis (PFGE) além de 17 amostras sensíveis aos carbapenêmicos, totalizando 58 isolados no estudo. Todos os isolados analisados apresentaram o gene blaOXA-51-like, caracterizando a espécie A. baumannii. Integrons de classe 2 foram os mais prevalentes (50; 86.2%) nos isolados testados, entretanto, integrons de classe 1 (15; 25.9%) também foram detectados. O elemento de inserção ISAba1 foi evidenciado em associação com o gene blaOXA-23-like em 36 isolados resistentes, e demonstrou uma significativa relação (p<0,001) com o aumento das concentrações inibitórias mínimas (MICs) dos carbapenêmicos imipenem e meropenem. A associação de ISAba1 com blaOXA-51-like não apresentou relação com aumento das MICs para os carbapenêmicos. A partir dos dados mostrados nesse trabalho, demonstramos a importância do elemento ISAba1, quando associado ao gene blaOXA-23-like, no aumento dos níveis de resistência aos carbapenêmicos meropenem e imipenem. A presença de integrons em todos os isolados resistentes aos carbapenêmicos reitera a importância desses elementos na disseminação de determinantes da resistência entre isolados de A. baumannii.

Acinetobacter baumannii é um patógeno nosocomial que está envolvido em um amplo espectro de infeções hospitalares. A maior preocupação atual é devido a sua alta capacidade de adquirir mecanismos de resistência, principalmente aos carbapenêmicos, fármacos utilizados normalmente para o tratamento dessas infecções. Desta forma, as opções terapêuticas tornam-se restritas e por isso, as polimixinas (polimixina B e colistina) voltaram a serem utilizadas na prática clínica. A heterorresistência a colistina já foi descrita em estudos recentes com isolados de A. baumannii e outros estudos detectaram a presença de resistência adaptativa as polimixinas. O objetivo deste estudo foi investigar a presença do fenômeno de heterorresistência e resistência adaptativa a polimixina B, e avaliar sua estabilidade. A pesquisa foi feita em isolados pertencentes a 15 clones diferentes de A. baumannii resistentes aos carbapenênicos e sensíveis a polimixina B. A avaliação da heterorresistência foi feita através da análise do perfil da população (PAP) para 29 isolados, selecionados aleatoriamente (pelo menos um de cada clone). A indução da resistência foi avaliada para 22 isolados, selecionados aleatoriamente (pelo menos um de cada clone), submetendo os isolados ao cultivo em concentrações crescentes de polimixina B. A determinação da estabilidade das subpopulações e da indução da resistência foi feita através de passagens, em dias consecutivos, em meio livre de antibiótico. Foram consideradas subpopulações heterogêneas aquele isolado que possuía colônias com uma CIM maior do que a população original para polimixina B. A CIM foi reavaliada após 75 e 60 dias de estocagem em -80ºC para os isolados que apresentaram subpopulação heterogênea ou indução da resistência para a polimixina B, respectivamente. Dos 29 isolados, submetidos a avaliação da heterorresistência, 26 (90%) apresentaram subpopulações heterogêneas para polimixina B. Nenhum isolado apresentou subpopulação superior a 2 μg/mL para polimixina B, ou seja, não foi encontrado neste estudo subpopulações heterorresistentes. As CIMs das subpopulações heterogêneas permaneceram iguais após os subcultivos em meio livre de antibiótico, mas quando a CIM foi reavaliada depois da estocagem, os valores obtidos foram os mesmos da população original. Dos 22 isolados submetidos a indução de resistência, 12 (55%) apresentaram algum crescimento até a concentração de 64 μg/mL de polimixina B. Após as passagens em meio livre de antibiótico a CIM diminuiu, voltando a CIM original na reavaliação após a estocagem a -80ºC. Este estudo mostra pela primeira vez a avaliação da heterorresistência e indução da resistência para polimixina B em isolados de A. baumannii resistentes aos carbapenêmicos. O fenômeno de heterorresistência não foi encontrado neste estudo, no entanto, subpopulações com uma CIM maior do que a original foram identificadas em 90% dos isolados. As CIMs das subpopulações permaneceram estáveis após 4 dias de passagens em meio livre de antibiótico, mas retornaram a CIM original após estocagem, o que sugere o envolvimento de mecanismos moleculares neste fenômeno. A presença da resistência induzida a polimixina B foi detectada em 55% dos isolados, sugerindo que este fenômeno pode ser comum entre os isolados de A. baumannii resistentes aos carbapenêmicos, frente a polimixina B. Embora a presença de subpopulações heterogêneas e a indução da resistência a polimixina B tenha sido comum neste estudo, mais estudos são necessários para um melhor entendimento do significado clínico e das implicações terapêuticas destes dois fenômenos.

Acinetobacter baumannii é considerado um dos patógenos de maior importância clínica atualmente, sendo responsável por uma variedade de infeções nosocomiais como, bacteremias, infecções no trato urinário, pneumonias associadas a ventilação mecânica, meningites secundárias e infecções em feridas. Desde a última década o tratamento de infecções por Acinetobacter spp. vem sendo dificultado pela emergência de cepas multirresistentes. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi determinar a dinâmica populacional e as características moleculares envolvidas na resistência de Acinetobacter spp. Foram avaliados isolados de Acinetobacter spp. provenientes de seis hospitais da cidade de Porto Alegre coletados entre janeiro de 2013 e março de 2014. A espécie Acinetobacter baumannii foi identificada pela presença do gene blaOXA-51, além de PCR multiplex para o gene gyrB. Carbapenemases (blaNDM, blaOXA-23-like, blaOXA-24/40-like, blaOXA-58-like e blaOXA-143-like), além dos integrons de classe 1 e 2 foram pesquisados por PCR. Um total de 524 isolados de Acinetobacter spp. foram coletados, e a maioria (487/92,9%) foram identificados como A. baumannii, seguidos pelas espécies A. nosocomialis (9/1,7%), A. pittii (3/0,6%), A. calcoaceticus (3/0,6%) e por fim, 22 (4,2%) isolados não pertenciam ao complexo A. baumannii-calcoaceticus. Quanto ao perfil de sensibilidade, 83% dos isolados demonstraram não ser sensíveis aos carbapenêmicos (imipenem e meropenem). Dos isolados de A. baumannii, 429 (88,1%) continham o gene blaOXA-23, além disso, foram observados dois isolados de A. nosocomialis contendo o gene blaOXA-23. Foi possível identificar dois isolados de A. baumannii produtores de blaOXA24/40 (0,8%) pela primeira vez na região Sul do país. A análise do gene por sequenciamento caracterizou como sendo a variante blaOXA-72, e a tipagem por MLST caracterizou os isolados como pertencentes a ST730 (CC79). Também foram analisados por MLST, isolados produtores de OXA-72 do estado de São Paulo e do Paraná. A análise dos dados demonstrou que estes isolados estão associados aos complexos clonais epidêmicos CC15 e CC79. A pesquisa para o gene blaNDM foi positiva para um isolado de A. pittii, sendo o primeiro isolado de Acinetobacter não baumannii produtor de NDM-1 no Brasil. A análise do contexto genético de blaNDM-1 demonstrou a presença de ISAba125 upstream ao gene, além disso, o gene demonstrou estar localizado no cromossomo da bactéria. Foi observada uma maior prevalência de integrons de classe 2 nos isolados avaliados (134/25,5%), quando comparada aos integrons de classe 1 (72/13,7%). Raros (2/0,4%) isolados apresentaram ambas as classes de integrons. Um total 244 isolados de A. baumannii resistentes aos carbapenêmicos foram submetidos à tipagem por REP-PCR, que demonstrou a presença de 20 grupos clonais entre os isolados analisados. Isolados de diferentes grupos clonais foram selecionados para a tipagem por MLST. Com o objetivo de realizarmos uma análise longitudinal dos clones circulantes desde o primeiro surto de Acinetobacter baumannii resistente aos carbapenêmicos (CRAB) na cidade de Porto Alegre, também foram selecionados para análise por MLST isolados de A. baumannii pertencentes ao nosso banco de dados com diferentes perfis clonais, coletados entre 2007 e 2008. Através da análise dos dados gerados pelo MLST no banco de dados do Instituto Pasteur, foram descritas 13 novas STs: ST883 (CC32), ST884 (CC221), ST885 (CC79), ST886, ST887, ST888, ST889 (CC464), ST892 (CC15), ST899, ST902 (CC1), ST903 (CC79), ST904 (CC15) e ST905 (CC32). A avaliação da dinâmica populacional de A. baumannii nos dois períodos avaliados demonstrou a permanência de isolados pertencentes aos complexos clonais CC15 e CC79 desde o período do primeiro surto de CRAB da cidade de Porto Alegre até o ano de 2014, demonstrando a capacidade desses clones de se manter por longos períodos no ambiente hospitalar. Além disso, estes CCs apresentaram uma elevada prevalência durante o primeiro período avaliado (2007-2008). Este dado que nos permite inferir que o primeiro surto de CRAB produtor de OXA-23 da cidade de Porto Alegre foi relacionado a disseminação de CC15 e CC79. / Acinetobacter baumannii is considered one of the main pathogens of clinical importance currently, being responsible for a wide range of nosocomial infections such as, bacteremias, urinary tract infections, ventilator-associated pneumonia, secondary meningitis and wound infections. Since the last decade the treatment of these infections has been impaired by the emergence of multiresistant strains. In this context, the aim of this study was to determine the population dynamic and the molecular characteristics involved in Acinetobacter spp. resistance. A total of 524 Acinetobacter spp. isolates were collected from six Porto Alegre hospitals from January 2013 to March 2014. A. baumannii species were identified by the presence of blaOXA-51 gene and by the gyrB multiplex PCR. Carbapenemase genes (blaNDM, blaOXA-23-like, blaOXA-24/40-like, blaOXA-58-like and blaOXA-143-like) as well as class 1 and 2 integrons were investigated by PCR. As expected, the majority (487/92.9%) of isolates were identified as A. baumannii, followed by A. nosocomialis (9/1.7%), A. pittii (3/0.6%), and A. calcoaceticus (3/0.6%). A total of 22 (4.2%) isolates were not identified as A. baumannii-calcoaceticus complex. Analysis of the susceptibility profile demonstrated that 83% of the isolates were not susceptible to carbapenems (imipenem e meropenem). Among the A. baumannii isolates, 429/487 (88.1%) presented blaOXA-23 gene. Two A. nosocomialis isolates also presented the blaOXA-23 gene. We also found, for the first time in Southern Brazil, two A. baumannii isolates containing blaOXA24/40 (0.8%). The sequencing of blaOXA24/40 identified the variant blaOXA-72, and MLST analysis characterized both isolates as ST730 (CC79). In addition, OXA-72-producing A. baumannii isolates from the states of São Paulo and Paraná were analyzed by MLST. Data analysis demonstrated that the isolates were associated to the clonal complexes CC15 and CC79. The screening of blaNDM gene was positive for an A. pittii isolate. Therewith, in the present study we described for the first time a Acinetobacter non-baumannii producing NDM-1 in Brazil. Analysis of the genetic environment of blaNDM-1 gene demonstrated the presence of ISAba125 upstream of the gene and that the gene was chromosome-located in A. pittii. It was observed an increased prevalence of class 2 integrons (134/25.5%) compared to class 1 integrons (72/13.7%). Only a few isolates presented both classes (2/0.4%). A total of 244 carbapenem-resistant A. baumannii isolates were typed by REP-PCR, which demonstrated the presence of 20 clonal groups. Isolates belonging to different clonal groups were selected for MLST typing. In order to conduct a longitudinal analysis of circulating clones from the first CRAB outbreak in the city of Porto Alegre, we also selected A. baumannii isolates with different clonal profiles collected between 2007 and 2008. According to MLST database from Pasteur Institute, we identified 13 new STs: ST883 (CC32), ST884 (CC221), ST885 (CC79), ST886, ST887, ST888, ST889 (CC464), ST892 (CC15), ST899, ST902 (CC1), ST903 (CC79), ST904 (CC15) and ST905 (CC32). The analysis of A. baumannii population dynamics in the two periods of the study demonstrated the persistence of the clonal complexes CC15 and CC79 from the first CRAB outbreak in Porto Alegre city, up to the year of 2014. Besides, these CCs presented a high prevalence during the first period (2007-2008) evaluated. These data allow us to infer that the first CRAB OXA-23-producing outbreak in Porto Alegre city was related to the dissemination of CC15 and CC79.

Orientador: Prof. Dr. Felipe F. Tuon / Co-orientadora: Drª. Sueli M. Nakatani / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Medicina Interna. Defesa : Curitiba, 27/06/2014 / Inclui referências / Área de concentração: Doenças infecciosas / Resumo: A disseminação de micro-organismos resistentes, produtores de KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase) é um problema de saúde pública emergente. A disseminação rápida e a crescente lista de patógenos em qual o gene blaKPC é devida a presença do gene em um elemento móvel, denominado transposon, Tn4401. Este estudo teve como objetivo avaliar as características dos isolados suspeitos de produção de carbapenemase KPC e realizar a caracterização epidemiológica, fenotípica e genotípica dos isolados enviados de outubro de 2009 a maio de 2012. De um total de 1028 isolados analisados, foram encontrados 770 positivos para KPC (75%) e 258 foram negativas (25%). A maioria das amostras recebidas foram de swab de vigilância 334 (32%), seguidas de amostras de urina 232 (22%), amostras respiratórias 134 (13%), sangue 99 (10%) dentre outras menos prevalentes. Para a determinação dos perfis clonais foi utilizada a técnica do repPCR e para a determinação da variante KPC foi realizado sequenciamento do gene da enzima. Foi avaliado também o valor da técnica fenotípica do teste de Hodge modificado em comparação com o padrão ouro PCR em tempo real. A tipagem molecular da enzima KPC foi compatível com a variante KPC-2, uma variante frequentemente reportada nas Américas. A análise dos perfis clonais pelo Diversilab mostrou 8 perfis clonais com 2 predominantes para o micro-organismo Klebsiella pneumoniae, 7 perfis clonais para Enterobacter spp com um predominante. Não foi observada clonalidade para os isolados de Escherichia coli, sugerindo que esta pode ter recebido o transposon Tn4401 por conjugação. A sensibilidade e especificidade do teste de Hodge modificado para a detecção de KPC utilizando ertapenem e meropenem como substratos foram 99,61% e 97,83% respectivamente. Este estudo mostrou que a técnica do teste de Hodge é sensível e específica e pode ser utilizada para a detecção de KPC quando esta enzima é endêmica e outras carbapenemases não são prevalentes por ser acessível a qualquer laboratório e de fácil realização pelos laboratórios clínicos. Palavras chave: KPC, carbapenêmicos, epidemiologia. / Abstract: The spread of carbapenem-resistant microorganisms harboring KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase) carbapenemase is an emerging public health threat. The rapid spread and growing list of pathogens in which gene blaKPC is reported is due to its carriage in a mobile element, a transposon, called Tn4401. This study aims to evaluate the characteristics of isolates suspected of harboring KPC carbapenemase and perform molecular and phenotypic characterization of these bacterial isolates. The period of analysis was from October 2009 to May 2012.An amount of 1028 isolates analyzed, 770 were KPC producing (75%) and 258 were not KPC producing (25%). Isolates was recovered mostly of vigilance swabs 334 (32%), followed by urinary samples 232 (22%), respiratory tract 134 (13%) and blood 99 (10%) among others less prevalent. We used repPCR for determination of clonal profiles, sequence the enzyme gene for detection of KPC's variant. We also evaluate the value of phenotypic technique modified Hodge test by comparing it to the gold standard technique PCR. Molecular typing of KPC enzyme was compatible with KPC-2 gene, a variant frequently reported in Americas. Cluster analysis from Diversilab fingerprints showed 8 clonal profiles with 2 predominant for Klebsiella pneumoniae, 7 clonal profiles for Enterobacter spp with one predominant. No clonal similarity was observed in Escherichia coli, suggesting that it may have received transposon Tn4401 through conjugation. The sensitivity and specificity of modified Hodge test for the detection of KPC, when using ertapenem and meropenem, were respectively 99.61% and 97.83%. This study showed that MHT technique is highly sensitive for detecting KPC producers when this enzyme is endemic, and has its value for being affordable and easy to perform by clinical laboratories. Keywords: KPC, carbapenem, epidemiology