Acinetobacter baumannii é considerado um dos patógenos de maior importância clínica atualmente, sendo responsável por uma variedade de infeções nosocomiais como, bacteremias, infecções no trato urinário, pneumonias associadas a ventilação mecânica, meningites secundárias e infecções em feridas. Desde a última década o tratamento de infecções por Acinetobacter spp. vem sendo dificultado pela emergência de cepas multirresistentes. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi determinar a dinâmica populacional e as características moleculares envolvidas na resistência de Acinetobacter spp. Foram avaliados isolados de Acinetobacter spp. provenientes de seis hospitais da cidade de Porto Alegre coletados entre janeiro de 2013 e março de 2014. A espécie Acinetobacter baumannii foi identificada pela presença do gene blaOXA-51, além de PCR multiplex para o gene gyrB. Carbapenemases (blaNDM, blaOXA-23-like, blaOXA-24/40-like, blaOXA-58-like e blaOXA-143-like), além dos integrons de classe 1 e 2 foram pesquisados por PCR. Um total de 524 isolados de Acinetobacter spp. foram coletados, e a maioria (487/92,9%) foram identificados como A. baumannii, seguidos pelas espécies A. nosocomialis (9/1,7%), A. pittii (3/0,6%), A. calcoaceticus (3/0,6%) e por fim, 22 (4,2%) isolados não pertenciam ao complexo A. baumannii-calcoaceticus. Quanto ao perfil de sensibilidade, 83% dos isolados demonstraram não ser sensíveis aos carbapenêmicos (imipenem e meropenem). Dos isolados de A. baumannii, 429 (88,1%) continham o gene blaOXA-23, além disso, foram observados dois isolados de A. nosocomialis contendo o gene blaOXA-23. Foi possível identificar dois isolados de A. baumannii produtores de blaOXA24/40 (0,8%) pela primeira vez na região Sul do país. A análise do gene por sequenciamento caracterizou como sendo a variante blaOXA-72, e a tipagem por MLST caracterizou os isolados como pertencentes a ST730 (CC79). Também foram analisados por MLST, isolados produtores de OXA-72 do estado de São Paulo e do Paraná. A análise dos dados demonstrou que estes isolados estão associados aos complexos clonais epidêmicos CC15 e CC79. A pesquisa para o gene blaNDM foi positiva para um isolado de A. pittii, sendo o primeiro isolado de Acinetobacter não baumannii produtor de NDM-1 no Brasil. A análise do contexto genético de blaNDM-1 demonstrou a presença de ISAba125 upstream ao gene, além disso, o gene demonstrou estar localizado no cromossomo da bactéria. Foi observada uma maior prevalência de integrons de classe 2 nos isolados avaliados (134/25,5%), quando comparada aos integrons de classe 1 (72/13,7%). Raros (2/0,4%) isolados apresentaram ambas as classes de integrons. Um total 244 isolados de A. baumannii resistentes aos carbapenêmicos foram submetidos à tipagem por REP-PCR, que demonstrou a presença de 20 grupos clonais entre os isolados analisados. Isolados de diferentes grupos clonais foram selecionados para a tipagem por MLST. Com o objetivo de realizarmos uma análise longitudinal dos clones circulantes desde o primeiro surto de Acinetobacter baumannii resistente aos carbapenêmicos (CRAB) na cidade de Porto Alegre, também foram selecionados para análise por MLST isolados de A. baumannii pertencentes ao nosso banco de dados com diferentes perfis clonais, coletados entre 2007 e 2008. Através da análise dos dados gerados pelo MLST no banco de dados do Instituto Pasteur, foram descritas 13 novas STs: ST883 (CC32), ST884 (CC221), ST885 (CC79), ST886, ST887, ST888, ST889 (CC464), ST892 (CC15), ST899, ST902 (CC1), ST903 (CC79), ST904 (CC15) e ST905 (CC32). A avaliação da dinâmica populacional de A. baumannii nos dois períodos avaliados demonstrou a permanência de isolados pertencentes aos complexos clonais CC15 e CC79 desde o período do primeiro surto de CRAB da cidade de Porto Alegre até o ano de 2014, demonstrando a capacidade desses clones de se manter por longos períodos no ambiente hospitalar. Além disso, estes CCs apresentaram uma elevada prevalência durante o primeiro período avaliado (2007-2008). Este dado que nos permite inferir que o primeiro surto de CRAB produtor de OXA-23 da cidade de Porto Alegre foi relacionado a disseminação de CC15 e CC79. / Acinetobacter baumannii is considered one of the main pathogens of clinical importance currently, being responsible for a wide range of nosocomial infections such as, bacteremias, urinary tract infections, ventilator-associated pneumonia, secondary meningitis and wound infections. Since the last decade the treatment of these infections has been impaired by the emergence of multiresistant strains. In this context, the aim of this study was to determine the population dynamic and the molecular characteristics involved in Acinetobacter spp. resistance. A total of 524 Acinetobacter spp. isolates were collected from six Porto Alegre hospitals from January 2013 to March 2014. A. baumannii species were identified by the presence of blaOXA-51 gene and by the gyrB multiplex PCR. Carbapenemase genes (blaNDM, blaOXA-23-like, blaOXA-24/40-like, blaOXA-58-like and blaOXA-143-like) as well as class 1 and 2 integrons were investigated by PCR. As expected, the majority (487/92.9%) of isolates were identified as A. baumannii, followed by A. nosocomialis (9/1.7%), A. pittii (3/0.6%), and A. calcoaceticus (3/0.6%). A total of 22 (4.2%) isolates were not identified as A. baumannii-calcoaceticus complex. Analysis of the susceptibility profile demonstrated that 83% of the isolates were not susceptible to carbapenems (imipenem e meropenem). Among the A. baumannii isolates, 429/487 (88.1%) presented blaOXA-23 gene. Two A. nosocomialis isolates also presented the blaOXA-23 gene. We also found, for the first time in Southern Brazil, two A. baumannii isolates containing blaOXA24/40 (0.8%). The sequencing of blaOXA24/40 identified the variant blaOXA-72, and MLST analysis characterized both isolates as ST730 (CC79). In addition, OXA-72-producing A. baumannii isolates from the states of São Paulo and Paraná were analyzed by MLST. Data analysis demonstrated that the isolates were associated to the clonal complexes CC15 and CC79. The screening of blaNDM gene was positive for an A. pittii isolate. Therewith, in the present study we described for the first time a Acinetobacter non-baumannii producing NDM-1 in Brazil. Analysis of the genetic environment of blaNDM-1 gene demonstrated the presence of ISAba125 upstream of the gene and that the gene was chromosome-located in A. pittii. It was observed an increased prevalence of class 2 integrons (134/25.5%) compared to class 1 integrons (72/13.7%). Only a few isolates presented both classes (2/0.4%). A total of 244 carbapenem-resistant A. baumannii isolates were typed by REP-PCR, which demonstrated the presence of 20 clonal groups. Isolates belonging to different clonal groups were selected for MLST typing. In order to conduct a longitudinal analysis of circulating clones from the first CRAB outbreak in the city of Porto Alegre, we also selected A. baumannii isolates with different clonal profiles collected between 2007 and 2008. According to MLST database from Pasteur Institute, we identified 13 new STs: ST883 (CC32), ST884 (CC221), ST885 (CC79), ST886, ST887, ST888, ST889 (CC464), ST892 (CC15), ST899, ST902 (CC1), ST903 (CC79), ST904 (CC15) and ST905 (CC32). The analysis of A. baumannii population dynamics in the two periods of the study demonstrated the persistence of the clonal complexes CC15 and CC79 from the first CRAB outbreak in Porto Alegre city, up to the year of 2014. Besides, these CCs presented a high prevalence during the first period (2007-2008) evaluated. These data allow us to infer that the first CRAB OXA-23-producing outbreak in Porto Alegre city was related to the dissemination of CC15 and CC79.

Acinetobacter baumannii é um dos principais patógenos associados a infecções nosocomiais, incluindo pneumonias, meningites secundárias, infecções urinárias e bacteremias. Esse microrganismo apresenta uma grande capacidade de se disseminar, além de adquirir novos mecanismos de resistência. Devido a essas propriedades, numerosos surtos de Acinetobacter baumannii multirresistente têm sido relatados em diversos países, inclusive no Brasil. O objetivo deste estudo foi analisar mecanismos envolvidos na resistência em Acinetobacter baumannii, avaliando a relação de elementos promotores com o aumento da resistência aos carbapenêmicos, além de analisar a presença de integrons envolvidos na disseminação de genes de resistência. Este foi um estudo transversal experimental no qual foram incluídas amostras provenientes de cinco hospitais da cidade de Porto Alegre obtidas no período de julho de 2007 a junho de 2008. Foram selecionados 41 isolados resistentes aos carbapenêmicos representantes de diferentes clones determinados por pulsed field gel eletrophoresis (PFGE) além de 17 amostras sensíveis aos carbapenêmicos, totalizando 58 isolados no estudo. Todos os isolados analisados apresentaram o gene blaOXA-51-like, caracterizando a espécie A. baumannii. Integrons de classe 2 foram os mais prevalentes (50; 86.2%) nos isolados testados, entretanto, integrons de classe 1 (15; 25.9%) também foram detectados. O elemento de inserção ISAba1 foi evidenciado em associação com o gene blaOXA-23-like em 36 isolados resistentes, e demonstrou uma significativa relação (p<0,001) com o aumento das concentrações inibitórias mínimas (MICs) dos carbapenêmicos imipenem e meropenem. A associação de ISAba1 com blaOXA-51-like não apresentou relação com aumento das MICs para os carbapenêmicos. A partir dos dados mostrados nesse trabalho, demonstramos a importância do elemento ISAba1, quando associado ao gene blaOXA-23-like, no aumento dos níveis de resistência aos carbapenêmicos meropenem e imipenem. A presença de integrons em todos os isolados resistentes aos carbapenêmicos reitera a importância desses elementos na disseminação de determinantes da resistência entre isolados de A. baumannii.

Acinetobacter baumannii é um patógeno nosocomial que está envolvido em um amplo espectro de infeções hospitalares. A maior preocupação atual é devido a sua alta capacidade de adquirir mecanismos de resistência, principalmente aos carbapenêmicos, fármacos utilizados normalmente para o tratamento dessas infecções. Desta forma, as opções terapêuticas tornam-se restritas e por isso, as polimixinas (polimixina B e colistina) voltaram a serem utilizadas na prática clínica. A heterorresistência a colistina já foi descrita em estudos recentes com isolados de A. baumannii e outros estudos detectaram a presença de resistência adaptativa as polimixinas. O objetivo deste estudo foi investigar a presença do fenômeno de heterorresistência e resistência adaptativa a polimixina B, e avaliar sua estabilidade. A pesquisa foi feita em isolados pertencentes a 15 clones diferentes de A. baumannii resistentes aos carbapenênicos e sensíveis a polimixina B. A avaliação da heterorresistência foi feita através da análise do perfil da população (PAP) para 29 isolados, selecionados aleatoriamente (pelo menos um de cada clone). A indução da resistência foi avaliada para 22 isolados, selecionados aleatoriamente (pelo menos um de cada clone), submetendo os isolados ao cultivo em concentrações crescentes de polimixina B. A determinação da estabilidade das subpopulações e da indução da resistência foi feita através de passagens, em dias consecutivos, em meio livre de antibiótico. Foram consideradas subpopulações heterogêneas aquele isolado que possuía colônias com uma CIM maior do que a população original para polimixina B. A CIM foi reavaliada após 75 e 60 dias de estocagem em -80ºC para os isolados que apresentaram subpopulação heterogênea ou indução da resistência para a polimixina B, respectivamente. Dos 29 isolados, submetidos a avaliação da heterorresistência, 26 (90%) apresentaram subpopulações heterogêneas para polimixina B. Nenhum isolado apresentou subpopulação superior a 2 μg/mL para polimixina B, ou seja, não foi encontrado neste estudo subpopulações heterorresistentes. As CIMs das subpopulações heterogêneas permaneceram iguais após os subcultivos em meio livre de antibiótico, mas quando a CIM foi reavaliada depois da estocagem, os valores obtidos foram os mesmos da população original. Dos 22 isolados submetidos a indução de resistência, 12 (55%) apresentaram algum crescimento até a concentração de 64 μg/mL de polimixina B. Após as passagens em meio livre de antibiótico a CIM diminuiu, voltando a CIM original na reavaliação após a estocagem a -80ºC. Este estudo mostra pela primeira vez a avaliação da heterorresistência e indução da resistência para polimixina B em isolados de A. baumannii resistentes aos carbapenêmicos. O fenômeno de heterorresistência não foi encontrado neste estudo, no entanto, subpopulações com uma CIM maior do que a original foram identificadas em 90% dos isolados. As CIMs das subpopulações permaneceram estáveis após 4 dias de passagens em meio livre de antibiótico, mas retornaram a CIM original após estocagem, o que sugere o envolvimento de mecanismos moleculares neste fenômeno. A presença da resistência induzida a polimixina B foi detectada em 55% dos isolados, sugerindo que este fenômeno pode ser comum entre os isolados de A. baumannii resistentes aos carbapenêmicos, frente a polimixina B. Embora a presença de subpopulações heterogêneas e a indução da resistência a polimixina B tenha sido comum neste estudo, mais estudos são necessários para um melhor entendimento do significado clínico e das implicações terapêuticas destes dois fenômenos.

A capacidade de adquirir, com facilidade, resistência à terapia antimicrobiana torna-se uma das características mais estudadas em Acinetobacter sp., mundialmente conhecido por estar relacionado a surtos de infecções associadas à assistência a saúde (IAAS) e por ser apontado como um grave problema de saúde pública. Embora isolados clínicos desse gênero sejam extensivamente estudados quanto à presença e a diversidade de genes do tipo OXA-carbapenemases,existem poucos estudos sobre essa relação em isolados ambientais. Este trabalho teve como objetivo determinar a presença de carbapenemases do tipo OXA (e sua diversidade), de ISAba1 e de sua relação com as carbapenemases em isolados clínicos e de esgoto hospitalar de Acinetobacter sp. na cidade de Porto Alegre, Rio Grande do Sul. Um total de 310 isolados (145 clínicos e 165 ambientais) foram submetidos a análise por PCR das regiões genéticas de interesse. A diversidade dos genes do tipo blaOXA-51 foi realizada por DGGE. Os resultados indicam a presença do gene blaOXA-58 em um isolado, pela primeira vez no Brasil. A sequência ISAba1 foi frequentemente encontrada (92,9%), porém, a sua associação com blaOXA-51 foi baixa e encontrada em 9,8% dos isolados clínicos e em 6,5% dos isolados ambientais. A análise de diversidade revelou uma baixa freqüência de alelos de OXA-51 entre os isolados estudados, sendo blaOXA-65 a variante mais encontrada. Contudo, podemos afirmar que o esgoto hospitalar analisado constitui-se de uma fonte de contaminação de bactérias patogênicas e que as precárias políticas de saneamento podem proporcionar a disseminação de multirresistência para o meio ambiente. / The ability of easily acquiring resistance to antimicrobial therapy becomes one of the most studied features in Acinetobacter sp., world renowned for being related to outbreaks of infection associated with health care and for being appointed as a serious public health problem. Although clinical isolates of this genus are extensively studied for the presence and diversity of OXAcarbapenemase genes, there are few studies about this relationship in environmental isolates. This study aimed to determine the presence of OXAtype carbapenemases (and yours diversity), of ISAba1 and its relationship with carbapenemases in clinical and hospital sewage isolates of Acinetobacter sp. in Porto Alegre, Rio Grande do Sul. A total of 310 strains (145 of clinical origin and 165 of environmental origin) were subjected to PCR analysis of genetic regions of interest. The diversity of blaOXA-51-like genes was performed by DGGE. The results indicate the presence of the gene blaOXA-58 in an isolated, for the first time in Brazil. ISAba1 was frequently found (92.9%) but its association with blaOXA-51-like was low and was found in 9.8% of clinical isolates and in 6.5% of environmental isolates. The diversity analysis showed that there is a low frequency of alleles of OXA-51 among the studied isolates being blaOXA-65 variant the most often found. However, we can state that the hospital sewage is considered to be a source of pathogenic bacteria contamination and that the poor sanitation politics contributes to the spread of multidrug resistance in the environment.

Acinetobacter baumannii é um dos principais patógenos associados a infecções nosocomiais, incluindo pneumonias, meningites secundárias, infecções urinárias e bacteremias. Esse microrganismo apresenta uma grande capacidade de se disseminar, além de adquirir novos mecanismos de resistência. Devido a essas propriedades, numerosos surtos de Acinetobacter baumannii multirresistente têm sido relatados em diversos países, inclusive no Brasil. O objetivo deste estudo foi analisar mecanismos envolvidos na resistência em Acinetobacter baumannii, avaliando a relação de elementos promotores com o aumento da resistência aos carbapenêmicos, além de analisar a presença de integrons envolvidos na disseminação de genes de resistência. Este foi um estudo transversal experimental no qual foram incluídas amostras provenientes de cinco hospitais da cidade de Porto Alegre obtidas no período de julho de 2007 a junho de 2008. Foram selecionados 41 isolados resistentes aos carbapenêmicos representantes de diferentes clones determinados por pulsed field gel eletrophoresis (PFGE) além de 17 amostras sensíveis aos carbapenêmicos, totalizando 58 isolados no estudo. Todos os isolados analisados apresentaram o gene blaOXA-51-like, caracterizando a espécie A. baumannii. Integrons de classe 2 foram os mais prevalentes (50; 86.2%) nos isolados testados, entretanto, integrons de classe 1 (15; 25.9%) também foram detectados. O elemento de inserção ISAba1 foi evidenciado em associação com o gene blaOXA-23-like em 36 isolados resistentes, e demonstrou uma significativa relação (p<0,001) com o aumento das concentrações inibitórias mínimas (MICs) dos carbapenêmicos imipenem e meropenem. A associação de ISAba1 com blaOXA-51-like não apresentou relação com aumento das MICs para os carbapenêmicos. A partir dos dados mostrados nesse trabalho, demonstramos a importância do elemento ISAba1, quando associado ao gene blaOXA-23-like, no aumento dos níveis de resistência aos carbapenêmicos meropenem e imipenem. A presença de integrons em todos os isolados resistentes aos carbapenêmicos reitera a importância desses elementos na disseminação de determinantes da resistência entre isolados de A. baumannii.

De acordo com a Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO, 2013), o consumo mundial de carne de frango tem aumentado de maneira significativa nas últimas décadas. Por outro lado, a preocupação dos produtores de alimentos, com a inocuidade de seus produtos também tem aumentado na mesma proporção. Durante as etapas da operação de abate de maneira geral, as contaminações cruzadas são as principais causas de disseminação de microrganismos patogênicos nos produtos obtidos e causadores de gastroenterites no consumidor. Espécies da enterobactéria Salmonella se enquadram como um dos maiores riscos desse tipo de doença devido a sua associação com os inúmeros surtos ocorridos a nível mundial, após o consumo desses produtos. Algumas enterobactérias possuem um gene blaKPC, que codifica a enzima carbapenemase, que confere resistência a antibióticos carbapenêmicos, agravando mais a situação. Alguns fatores de virulência encontrados nesse gênero de bactéria podem ainda estar associados a capacidade de adesão e formação de biofilmes em superfícies inertes, dificultando operações de higienização nas linhas de processamento. Assim sendo, a presente pesquisa objetivou a verificação da capacidade de estirpes de Salmonella spp isoladas de aviário e linha de abate de frangos de um frigorífico no estado do Rio Grande do Sul produzirem biofilmes e apresentarem resistência a antibióticos carbapenêmicos. Na avaliação da produção de biofilme, foi empregada a técnica de microplacas de polietileno e produção de cápsula segundo Stepanovic et al. (2004) e Rodrigues et al. (2006), respectivamente.Foram pesquisados os fatores de virulência de salmonelas, representados pelos genes IpfA, agfA, sefA, invA, hilA, avrA, sopE, sivH,e spvC, utilizando o método de Reação de cadeia de Polimerase (PCR), descrita por Borges et al. (2013). As estirpes foram submetidas ao teste de resistência a antibióticos carbapenêmicos pelo método de disco difusão com carbapenêmicos segundo Clinical and Laboratory Standards Institute-CLSI (2010) e pesquisa do gene de resistência a carbapenêmicos blaKCP, pela técnica de PCR, segundo NAAS et al. (2007). Obteve-se quatro perfis genéticos das estirpes de Salmonella spp.: perfil 1: genes ifpA, agfA, invA e avrA; perfil2: genes ifpA, agfA, sefA, invA e avrA; perfil 3: genes invA e avrA; perfil4: genes ifpA,agfA e invA. Observou-se a resistência das estirpes somente ao antibiótico imipenen. Entre as 36 estirpes de Salmonella spp. isoladas, todas foram consideradas produtoras de biofilme in vitro, sendo que 69% destas, apresentaram-se como fortes produtoras, 25% como moderadas, e apenas 6% como fracas produtoras. O método Agar Vermelho Congo não se mostrou eficiente para teste presuntivo de produção de biofilme para estirpes de Salmonella spp. Não foi evidenciado o gene blaKPC nas estirpes de Salmonella spp. isoladas na presente pesquisa. / According to Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO, 2013), the world consumption of meat of chicken has been higher significantly in the last decades. On the other hand, the concern of the food producers with the safety of their products also has increased in the same proportion. During the steps of the slaughter operation in general, cross contamination are the main causes of pathogenic microorganisms dissemination in the obtained products and the causes of gastroenteritis in the consumer. Species of the Enterobacter Salmonella fall as the highest risks of this kind of disease, due to their association with countless outbreaks which occurred worldwide, after the consumption of these products. Some enterobacter have a blaKPC gene, which codes for the carbapenemase enzyme that confers resistance to carbapenems antibiotics, aggravating the situation. Some virulence factors found in this bacteria genes can also be associated to the ability of adherence and the formation of biofilms in inert surfaces, making it difficult the operations of sanitation in the processing lines. Thus, the present research aimed to verify the capacity of Salmonella spp. strains isolated from aviary and slaughter line of chicken in a fridge of Rio Grande do Sul state to produce biofilms and be resistant to carbapenems antibiotics. In the evaluation of biofilm production, it was used the polyethylene microplates and capsule production technique according to Stepanovic et al. (2004) and Rodrigues et al. (2006), respectively. The virulence factors of salmonella were researched, represented by the genes IpfA, agfA, sefA, invA, hilA, avrA, sopE, sivH, e spvC, using the Polymerase Chain Reaction (PCR) method described by Borges et al. (2013). The lineages were submitted to the carbapenems antibiotic resistence test by the disk diffusion method with carbapenems according to the Clinical and Laboratory Standards Institute-CLSI (2010), and the research of the resistance to carbapenems gene blaKCP, by the strains Salmonella spp.: profile 1: genes ifpA, agfA, invA and avrA.; profile 2: genes ifpA, agfA, sefA, invA and avrA; profile 3: genes invA and avrA; profile 4: genes ifpA, agfA and invA. It was observed the resistance of the strains only to the imipenen antibiotic. Among the other 36 cultures of Salmonella spp. isolated, all were considered to produce biofilm in vitro, of which 69% were strong producers, 25% moderate, and only 6% were low producers. The method Congo Red Agar was not efficient to the presumptive test of biofilm production for the Salmonella spp. strains. It was not evidenced the gene blaKPC in Salmonella spp. strains isolates in this research.

As metalo-beta-lactamases (MBL) são carbapenemases pertencentes à classe B de Ambler e ao grupo 3 de Bush-Jacoby, as duas classificações mais utilizadas atualmente. Essas enzimas conferem, às bactérias, resistência às cefalosporinas, penicilinas e carbapenêmicos, mas não conferem resistência ao monobactam aztreonam. Além disso, não são inibidas por inibidores de -lactamases comercialmente disponíveis, porém possuem sensibilidade ao ácido etileno diamino tetracético (EDTA) e ácido mercaptopropiônico (MPA). Atualmente são conhecidas nove subclasses de MBL: IMP,VIM, SPM, GIM, SIM, AIM, KHM, NDM e DIM. Essas MBL têm se tornado clinicamente importantes, principalmente, em Pseudomonas spp., Acinetobacter spp., e alguns gêneros da família Enterobacteriaceae. O principal objetivo desse trabalho foi a caracterização genética e epidemiológica de P. aeruginosa resistentes aos carbapêmicos, produtoras de MBL, isoladas no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo no período de abril a agosto de 2007. Das 54 P. aeruginosa estudadas, 24 foram positivas na triagem fenotípica para MBL e 5 apresentaram o gene blaSPM-1 detectado por PCR e confirmado pelo seqüenciamento. O inibidor mais eficiente na triagem fenotípica foi o EDTA. A baixa correlação entre o teste fenotípico e molecular pode ser explicada pela capacidade que o EDTA possui de aumentar a permeabilidade da membrana celular e assim tornar a bactéria sensível a baixas concentrações do antibiótico. Além disso, a diferença entre o número de isolados resistentes aos carbapenêmicos e/ou ceftazidima e os que apresentaram a MBL podem ser explicados pela associação de outros mecanismos de resistência, como hiperprodução de AmpC, redução da expressão de porinas e/ou aumento do efluxo de antibióticos. De acordo com o perfil de macrorrestrição obtido por eletroforese em campo pulsado as 5 linhagens produtoras de SPM-1 estão agrupadas em 3 perfis clonais distribuídos em diferentes clínicas no hospital não sendo identificado nenhum clone predominante. Finalizando, entre os isolados resistentes aos carbapenêmicos e/ou à ceftazidima a freqüência de P. aeruginosa produtoras de SPM-1 foi de 9,3%, indicando que as medidas aplicadas pela Comissão de Controle de Infecção Hospitalar (CCIH) desta instituição estão sendo eficientes, porém mesmo assim é necessário que a CCIH esteja sempre atenta a relatos de resistência aos carbapenêmicos pois, linhagens produtoras de MBL restringem muito as opções terapêuticas para infecções causas por elas. / Metallo-beta-lactamase (MBL) are carbapenemases which belong to the Bush-Jacoby-Medeiros group 3 and to the molecular class B, according Ambler. These two classifications are the most used nowadays. These enzymes confer microorganisms resistant to cephalosporins, penicillins and carbapenems, but not to aztreonam, a monobactam. Moreover, they are not inhibited by commercially available -lactamases inhibitors, but they are susceptible to EDTA and MPA. Currently this is known nine subclasses of MBL: IMP, VIM, SPM, GIM, SIM, AIM, KHM, NDM and DIM. These MBL became clinically important, especially in microorganisms such as Pseudomonas spp., Acinetobacter spp. and genera of the family Enterobacteriaceae. The main objective of this study was genetic and epidemiologic characterization of MBL-producing-P. aeruginosa, isolated in the Hospital of the Faculty of Medicine of Ribeirão Preto - University of São Paulo in the period from April to August 2007. Among the 54 P. aeruginosa studied, 24 were positive for phenotypic MBL screening and 5 presented blaSPM-1 gene, detected by PCR and confirmed by sequencing. The most efficient inhibitor in phenotypic screening was EDTA. The low correlation between phenotypic and molecular testing can be explained by the ability of EDTA to increase the permeability of cell membranes and rendering the bacteria as sensitive to low concentrations of antibiotic. Furthermore, the difference between number of isolates carbapenem resistant and / or ceftazidime resistant and the number of MBL-producing-P. aeruginosa can be explained by the association with other resistance mechanisms, such as AmpC overproduction, reduced expression of porins and / or increased antibiotics efflux. According to profile of macrorestriction after pulsed-field gel electrophoresis, five SPM-1-producing-P. aeruginosa are grouped in three different clonal profiles. These clonal strains were proceeded from different clinics at the hospital and no predominant clone was identified. Finally, among the carbapenems and/or ceftazidime resistant isolates the frequency of SPM-1-producing-P. aeruginosa was 9.3%, suggesting that the hospital care of infection control has being effective.

Os isolados do complexo Enterobacter cloacae estão entre os principais patógenos causadores de infecções hospitalares. Embora os carbapenêmicos sejam considerados a última opção terapêutica no tratamento de infecções graves por Enterobacter spp, existem evidências indicando o aumento da resistência deste gênero aos carbapenêmicos. Esta resistência é normalmente mediada pela hidrólise dos carbapenêmicos por β-lactamases (carbapenemases). A resistência aos carbapenêmicos se apresenta de forma homogênea numa população bacteriana, no entanto, eventualmente a resistência pode ocorrer em apenas parte da população. Heteroresistência pode ser definida como a expressão de resistência de uma subpopulação dentro de uma população considerada sensível em testes de susceptibilidade in vitro e pode ser considerada um estágio precursor, o qual pode ou não levar a emergência de uma população homogeneamente resistente. A não detecção destas subpopulações resistentes pode levar ao fracasso no tratamento. O objetivo deste trabalho foi avaliar a heteroresistência aos carbapenêmicos em isolados do complexo Enterobacter cloacae. Trinta e um isolados foram selecionados de acordo com seu perfil de suscetibilidade aos carbapenêmicos (imipenem e meropenem sensíveis e ertapenem resistente) e a presença de OXA-370 (5 positivas para blaOXA-370). A heteroresistência foi avaliada por análise de perfil populacional (PAP). Isolados com subpopulações que apresentaram crescimento em concentrações de carbapenêmicos ≥ 4μg/ml foram considerados heteroresistentes e isolados contendo subpopulações que cresceram em concentrações de carbapenêmicos pelo menos duas vezes maior do que o MIC original, mas < 4 μg/ml foram considerados heterogêneos. A estabilidade da heteroresistência foi determinada por sub-cultivo sete dias em meio isento de antibiótico. Um total de 6 (19,4%) isolados apresentaram subpopulações heteroresistentes e 15 (48,4%) subpopulações heterogêneas ao imipenem. Em relação ao meropenem foi encontrado apenas 1 (3,2%) isolado heteroresistente e 5 (16,13%) isolados com subpopulações heterogêneas. Todos os isolados positivos para blaOXA-370 foram classificados como heteroresistentes ou heterogêneos ao imipenem. Apenas 2/21 (9,5%) e 2/6 (33,3%) subpopulações heterogêneos/heteroresistentes para imipenem e meropenem, respectivamente, mantiveram os mesmos MICs após sete dias de sub-cultivo em meio isento de antibiótico. Nossos resultados indicam que subpopulações heterogêneas/heteroresistentes ao imipenem são comuns entre isolados do complexo Enterobacter cloacae (21/31; 67,7%). Os isolados de OXA-370 foram classificados como heterogêneo/heteroresistente e, portanto, a presença de blaOXA-370 pode estar associada ao aumento de heteroresistência a imipenem. Já a estabilidade da heteroresistência e heterogeneidade aos carbapenêmicos demonstrou-se baixa. / Enterobacter cloacae complex isolates are major pathogens in hospital infections. Although carbapenems are considered the last resort in the treatment of severe infections caused by Enterobacter spp, there are several reports indicating increase of resistance to carbapenems among isolates of this genus. This resistance is usually mediated by hydrolysis of carbapenems by β-lactamases (carbapenemases). Carbapenem-resistance is usually a homogeneous feature in a bacterial population but, eventually, the resistance may occur in only a small proportion of the population. Heteroresistance can be defined as resistance to certain antibiotics expressed by a subset of a microbial population that is generally considered to be susceptible to these antibiotics according to traditional in vitro susceptibility testing. Lack to detect heteroresistance may lead to the therapeutic failure. The aim of this study was to evaluate the heteroresistance to carbapenems among Enterobacter cloacae complex isolates. Thirty-one isolates of Enterobacter cloacae complex were selected according to their susceptibility profile as follow: resistance to ertapenem and susceptibility to imipenem and meropenem. Among these, five isolates presented the blaOXA-370 gene. Heteroresistance was evaluated by population analysis profile (PAP). Isolates that grew at concentrations ≥4μg/mL of carbapenem were considered heteroresistant, while those that grew at concentration with at least two dilutions higher than the original MIC, but <4μg/mL were considered heterogeneous. Heteroresistance stability was determined after seven day sub-culture in antibiotic-free medium. A total of 6 (19.4%) isolates presented heteroresistant subpopulations and 15 (48.4%) heterogeneous subpopulations to imipenem. Only 1 (3.2%) isolate was heteroresistant and 5 (16.1%) heterogeneous to meropenem. All positive isolates for blaOXA-370 were classified as heteroresistant or heterogeneous to imipenem. Only 2/21 (9.5%) and 2/6 (33.3%) heterogeneous/heteroresistant subpopulations to imipenem and meropenem, respectively, kept the same MIC of the subpopulation after seven days in antibiotic free medium. Our results indicate that heterogeneous/heteroresistant subpopulations were common among Enterobacter cloacae complex (21/31 - 67.7%) to imipenem and less common to meropenem. Noteworthy, that all OXA-370 producing isolates were classified as heterogeneous/heteroresistant. Therefore, the presence of blaOXA-370 may be associated with increase heteroresistance to imipenem. The stability of heteroresistance was low in antibiotic-free medium after seven days.

Introdução. Pseudomonas aeruginosa é um patógeno clinicamente importante. Existem diversos mecanismos de resistência aos antimicrobianos em P. aeruginosa, dentre eles a produção de enzimas (β-lactamases) e sistemas de efluxo se destacam, uma vez que são capazes de conferir resistência aos carbapenêmicos. Objetivo. Avaliar os sistemas de efluxo MexAB-OprM e MexXY em isolados clínicos de P.aeruginosa de pacientes atendidos no Hospital de Clínicas de Porto Alegre-RS e relacionar a expressão destes sistemas com a CIM de meropenem em isolados produtores e não produtores de metalo-beta-lactamases (MBL). Metodologia. Um total de 86 isolados de P. aeruginosa com suscetibilidade reduzida aos carbapenêmicos foram avaliados. A hiperexpressão dos sistemas MexAB e MexXY foi determinada fenotipicamente utilizando inibidor seletivo da bomba (PAβN). MBLs foi determinada por PCR utilizando primers específicos. Resultados. O fenótipo de hiperexpressão dos sistemas de efluxo estudados foi observado em 34 (47,8%) dos 71 isolados negativos para a produção de MBL e em 14 (93.3%) dos 15 isolados MBL positivos. Na presença de PaβN, todos os isolados não produtores de MBL apresentaram uma redução da CIM para meropenem para valores na faixa de suscetibilidade. Entretanto, das 13 P. aeruginosa produtoras de MBL que diminuíram a CIM, essa redução não foi para valores dentro da faixa de sensibilidade. Conclusão. Os isolados de P. aeruginosa não produtores de MBL apresentam resistência ao meropenem devido a hiperexpressão de MexAB-OprM. Na presença de PaβN, independente de apresentarem produção de MBL, o CIM de meropenem reduziu para valores ≤ 8 mg/L. Contudo, quando isolados não apresentavam MBL, a CIM de meropenem reduziu para níveis de sensibilidade. / Introduction. Bacterial efflux pump systems are resistance mechanisms which may lead to therapeutic failure of antibiotic treatment since many antimicrobial agents are substrate for these mechanisms. The aim of the study was to evaluate the expression of the MexAB, MexXY pump efflux and to determine its influence on meropenem MIC in carbapenemase producing and non-producing P. aeruginosa. Methods. A total of 86 non-repetitive clinical isolates of P. aeruginosa with reduced susceptibility to carbapenems were evaluated. Overexperession of MexAB and MexXY efflux systems were evaluated phenotypically using the PAβN selective inhibitor. Metallo-β-lactamases (MBL) were detected by PCR using specific primers. Results. The efflux pump-overexpressed phenotype was observed in 34 (47.8%) MBL-negative and in 14 (93.3%) MBL-positive isolates. In the presence of the PaβN, all non-producers of MBL presented a reduction of meropenem MICs to the range of susceptibility. In contrast, the 13 P. aeruginosa MBL-producing isolates decreased meropenem MICs at least 16-fold but this reduction did not reach the range of susceptibility. Conclusion. P. aeruginosa non-MBL-producing showed resistance to meropenem due to overexpression of MexAB-OprM. In the presence of PaβN, the isolates harboring or not MBL genes, the meropenem MICs were reduced to values ≤8 mg/L. However, when the isolates harbor MBL genes, the meropenem MIC values were reduced to the susceptibility.

Introdução: P. aeruginosa é o principal agente causador de infecção hospitalar sendo a primeira causa de pneumonia nosocomial em hospitais brasileiros. Os carbapenêmicos são geralmente o tratamento empírico de escolha para infecções graves causadas por esta bactéria. Entretanto, seu uso tem sido limitado pelas elevadas taxas de resistência entre os isolados de P. aeruginosa principalmente os produtores de metalo-β-lactamases (Mβla). Objetivos: Caracterizar e avaliar a produção de metalo-β-lactamase em amostras de Pseudomonas aeruginosa resistentes a ceftazidima e/ou imipenem em dois hospitais universitários de Porto Alegre. Métodos: O método de disco difusão padronizado pelo NCCLS foi utilizado para avaliar o perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos. Um teste de aproximação de discos utilizando ceftazidima com ácido 2-mercaptopropiônico foi utilizado para triagem de amostras produtoras de Mβla. A fita de Etest combinada imipenem com EDTA também foi utilizada como teste fenotípico. Os resultados destes dois testes foram comparados à PCR para pesquisa dos genes blaSPM-1, blaIMP-1 e blaVIM-2 .Os isolados produtores de Mβla foram submetidos a tipagem molecular pela técnica de macrorestrição de DNA seguida de pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). O perfil de hidrólise para o imipenem foi avaliado nas amostras produtoras de Mβla através da variação de absorção medida a 298 nm. Resultados: Dos 92 isolados clínicos analisados, 33 foram positivos no teste de aproximação de discos. Destes, 18 foram produtores de SPM-1 e 5 de IMP-1. Todas as amostras produtoras de SPM-1 apresentaram razão de IP/IPI na fita combinada ≥ 8. Os 18 isolados de SPM-1 foram classificados como um único padrão de PFGE que foi o predominante. Seis isolados pertenciam a um segundo padrão de PFGE, sendo que cinco destes eram IMP-1. O perfil de hidrólise mostrou que os isolados produtores de SPM-1 degradam mais efetivamente o imipenem quando comparado aos produtores de IMP-1 e aos não produtores de Mβla. Conclusões: Há uma alta prevalência de Mβla entre isolados de P. aeruginosa resistentes a imipenem e/ou ceftazidima. O gene SPM-1 é o elemento genético mais prevalente entre as amostras de P. aeruginosa Mβla positivas e a disseminação clonal têm contribuído para os elevados níveis de resistência aos carbapenêmicos entre os isolados de P. aeruginosa nos hospitais deste estudo.