Introdução: P. aeruginosa é o principal agente causador de infecção hospitalar sendo a primeira causa de pneumonia nosocomial em hospitais brasileiros. Os carbapenêmicos são geralmente o tratamento empírico de escolha para infecções graves causadas por esta bactéria. Entretanto, seu uso tem sido limitado pelas elevadas taxas de resistência entre os isolados de P. aeruginosa principalmente os produtores de metalo-β-lactamases (Mβla). Objetivos: Caracterizar e avaliar a produção de metalo-β-lactamase em amostras de Pseudomonas aeruginosa resistentes a ceftazidima e/ou imipenem em dois hospitais universitários de Porto Alegre. Métodos: O método de disco difusão padronizado pelo NCCLS foi utilizado para avaliar o perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos. Um teste de aproximação de discos utilizando ceftazidima com ácido 2-mercaptopropiônico foi utilizado para triagem de amostras produtoras de Mβla. A fita de Etest combinada imipenem com EDTA também foi utilizada como teste fenotípico. Os resultados destes dois testes foram comparados à PCR para pesquisa dos genes blaSPM-1, blaIMP-1 e blaVIM-2 .Os isolados produtores de Mβla foram submetidos a tipagem molecular pela técnica de macrorestrição de DNA seguida de pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). O perfil de hidrólise para o imipenem foi avaliado nas amostras produtoras de Mβla através da variação de absorção medida a 298 nm. Resultados: Dos 92 isolados clínicos analisados, 33 foram positivos no teste de aproximação de discos. Destes, 18 foram produtores de SPM-1 e 5 de IMP-1. Todas as amostras produtoras de SPM-1 apresentaram razão de IP/IPI na fita combinada ≥ 8. Os 18 isolados de SPM-1 foram classificados como um único padrão de PFGE que foi o predominante. Seis isolados pertenciam a um segundo padrão de PFGE, sendo que cinco destes eram IMP-1. O perfil de hidrólise mostrou que os isolados produtores de SPM-1 degradam mais efetivamente o imipenem quando comparado aos produtores de IMP-1 e aos não produtores de Mβla. Conclusões: Há uma alta prevalência de Mβla entre isolados de P. aeruginosa resistentes a imipenem e/ou ceftazidima. O gene SPM-1 é o elemento genético mais prevalente entre as amostras de P. aeruginosa Mβla positivas e a disseminação clonal têm contribuído para os elevados níveis de resistência aos carbapenêmicos entre os isolados de P. aeruginosa nos hospitais deste estudo.

Introdução: P. aeruginosa é o principal agente causador de infecção hospitalar sendo a primeira causa de pneumonia nosocomial em hospitais brasileiros. Os carbapenêmicos são geralmente o tratamento empírico de escolha para infecções graves causadas por esta bactéria. Entretanto, seu uso tem sido limitado pelas elevadas taxas de resistência entre os isolados de P. aeruginosa principalmente os produtores de metalo-β-lactamases (Mβla). Objetivos: Caracterizar e avaliar a produção de metalo-β-lactamase em amostras de Pseudomonas aeruginosa resistentes a ceftazidima e/ou imipenem em dois hospitais universitários de Porto Alegre. Métodos: O método de disco difusão padronizado pelo NCCLS foi utilizado para avaliar o perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos. Um teste de aproximação de discos utilizando ceftazidima com ácido 2-mercaptopropiônico foi utilizado para triagem de amostras produtoras de Mβla. A fita de Etest combinada imipenem com EDTA também foi utilizada como teste fenotípico. Os resultados destes dois testes foram comparados à PCR para pesquisa dos genes blaSPM-1, blaIMP-1 e blaVIM-2 .Os isolados produtores de Mβla foram submetidos a tipagem molecular pela técnica de macrorestrição de DNA seguida de pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). O perfil de hidrólise para o imipenem foi avaliado nas amostras produtoras de Mβla através da variação de absorção medida a 298 nm. Resultados: Dos 92 isolados clínicos analisados, 33 foram positivos no teste de aproximação de discos. Destes, 18 foram produtores de SPM-1 e 5 de IMP-1. Todas as amostras produtoras de SPM-1 apresentaram razão de IP/IPI na fita combinada ≥ 8. Os 18 isolados de SPM-1 foram classificados como um único padrão de PFGE que foi o predominante. Seis isolados pertenciam a um segundo padrão de PFGE, sendo que cinco destes eram IMP-1. O perfil de hidrólise mostrou que os isolados produtores de SPM-1 degradam mais efetivamente o imipenem quando comparado aos produtores de IMP-1 e aos não produtores de Mβla. Conclusões: Há uma alta prevalência de Mβla entre isolados de P. aeruginosa resistentes a imipenem e/ou ceftazidima. O gene SPM-1 é o elemento genético mais prevalente entre as amostras de P. aeruginosa Mβla positivas e a disseminação clonal têm contribuído para os elevados níveis de resistência aos carbapenêmicos entre os isolados de P. aeruginosa nos hospitais deste estudo.

Introdução: P. aeruginosa é o principal agente causador de infecção hospitalar sendo a primeira causa de pneumonia nosocomial em hospitais brasileiros. Os carbapenêmicos são geralmente o tratamento empírico de escolha para infecções graves causadas por esta bactéria. Entretanto, seu uso tem sido limitado pelas elevadas taxas de resistência entre os isolados de P. aeruginosa principalmente os produtores de metalo-β-lactamases (Mβla). Objetivos: Caracterizar e avaliar a produção de metalo-β-lactamase em amostras de Pseudomonas aeruginosa resistentes a ceftazidima e/ou imipenem em dois hospitais universitários de Porto Alegre. Métodos: O método de disco difusão padronizado pelo NCCLS foi utilizado para avaliar o perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos. Um teste de aproximação de discos utilizando ceftazidima com ácido 2-mercaptopropiônico foi utilizado para triagem de amostras produtoras de Mβla. A fita de Etest combinada imipenem com EDTA também foi utilizada como teste fenotípico. Os resultados destes dois testes foram comparados à PCR para pesquisa dos genes blaSPM-1, blaIMP-1 e blaVIM-2 .Os isolados produtores de Mβla foram submetidos a tipagem molecular pela técnica de macrorestrição de DNA seguida de pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). O perfil de hidrólise para o imipenem foi avaliado nas amostras produtoras de Mβla através da variação de absorção medida a 298 nm. Resultados: Dos 92 isolados clínicos analisados, 33 foram positivos no teste de aproximação de discos. Destes, 18 foram produtores de SPM-1 e 5 de IMP-1. Todas as amostras produtoras de SPM-1 apresentaram razão de IP/IPI na fita combinada ≥ 8. Os 18 isolados de SPM-1 foram classificados como um único padrão de PFGE que foi o predominante. Seis isolados pertenciam a um segundo padrão de PFGE, sendo que cinco destes eram IMP-1. O perfil de hidrólise mostrou que os isolados produtores de SPM-1 degradam mais efetivamente o imipenem quando comparado aos produtores de IMP-1 e aos não produtores de Mβla. Conclusões: Há uma alta prevalência de Mβla entre isolados de P. aeruginosa resistentes a imipenem e/ou ceftazidima. O gene SPM-1 é o elemento genético mais prevalente entre as amostras de P. aeruginosa Mβla positivas e a disseminação clonal têm contribuído para os elevados níveis de resistência aos carbapenêmicos entre os isolados de P. aeruginosa nos hospitais deste estudo.

Objetivos: Padronizar uma técnica molecular, Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para detectar os genes blaSPM-1 , blaVIM-2 e blaIMP-1 que conferem a Pseudomonas aeruginosa resistência a carbapenêmicos (imipenem e meropenem) através da produção das metalo-β-lactamases (MBL) SPM-1, VIM-2 e IMP-1. Comparar os resultados obtidos com a técnica de PCR com os obtidos através de uma técnica fenotípica para detecção desse mecanismo enzimático de resistência. Descrever a prevalência dos genes de MBL. Metodologia: Utilizando 48 amostras clínicas de P. aeruginosa resistentes a ceftazidima e/ou imipenem sendo 37 caracterizadas como produtoras de MBL através de uma técnica fenotípica (aproximação de disco) e 11 como não produtoras pela mesma técnica. Esses isolados foram testados com três primers específicos para os seguintes genes: blaSPM-1 , blaVIM-2 e blaIMP-1 Resultados e Discussão: Dos 37 isolados produtores de metalo-β-lactamase, 29 tiveram resultado positivo na PCR sendo 27 positivos para o gene blaSPM-1 e 2 positivos para o gene blaIMP-1 . Em nenhum isolado foi detectado o gene blaVIM-2 .Oito isolados caracterizados como produtores de MBL não tiveram nenhum produto amplificado com os três pares de primers. Os 11 isolados caracterizados como não produtores de MBL não tiveram produto amplificado. Assim, a sensibilidade da técnica molecular foi de 78,40% e a especificidade 100,0% considerando a técnica fenotípica de aproximação de disco como padrão ouro Conclusões: Foi possível a padronização da técnica de PCR para a detecção dos genes blaSPM-1 , blaVIM-2 e blaIMP-1 bem como foi possível a comparação entre a técnica de PCR e a técnica fenotípica, sendo que a metodologia molecular apresentou 100% de especificidade e 78,40% de sensibilidade. O gene de MBL mais prevalente foi blaSPM-1 encontrado em 27/29 amostras de P. aeruginosa resistentes ao imipenem. O gene blaIMP-1 foi detectado em apenas 2/29 amostras de P. aeruginosa resistentes ao imipenem. O gene blaVIM-2 e não foi detectado nas amostras de P.aeruginosa analisadas neste estudo.

A presença de Pseudomonas aeruginosa resistentes a antimicrobianos no esgoto hospitalar contribui para sua disseminação em corpos d´água e possibilita o estabelecimento de reservatórios ambientais de resistência bacteriana. Os objetivos deste estudo foram comparar isolados de P. aeruginosa de amostras de esgoto hospitalar e água superficial quanto ao perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos, a presença e diversidade de genes de metalo β-lactamases (MBLs) e a similaridade genética entre os isolados. Para isso, as amostras de esgoto hospitalar foram coletadas de cinco hospitais, localizados em Passo Fundo e Porto Alegre, RS, Brasil. As amostras de água superficial foram coletadas dos corpos d´água que recebem os esgotos de dois hospitais estudados. Os isolados foram identificados por provas bioquímicas clássicas e pela amplificação de um fragmento do rDNA 16S. O perfil de susceptibilidade foi avaliado pela técnica de disco-difusão. Os genes blaSPM-1, blaVIM e blaIMP foram pesquisados por PCR. A relação clonal entre os isolados foi avaliada pela ERIC-PCR e PFGE. A diversidade nos genes de MBLs encontrados foi avaliada pela DGGE. Foram analisados 614 isolados de P. aeruginosa, dos quais somente 5,0% apresentaram o gene blaSPM-1. Todos os isolados com este gene apresentaram fenótipo de multirresistência. A análise de similaridade genética pela ERIC-PCR e PFGE não mostrou relação clonal entre isolados de água superficial e esgoto hospitalar ou entre isolados provenientes de amostras de diferentes esgotos hospitalares. A presença de isolados resistentes e com o gene blaSPM-1, em amostras de esgoto hospitalar, atenta para o risco de disseminação ambiental de resistência bacteriana. / The presence of Pseudomonas aeruginosa resistant to antimicrobials in hospital sewage contributes to its dissemination into water bodies and may lead to the establishment of environmental reservoirs of bacterial resistance. The objectives of this study were to compare P. aeruginosa strains isolated from hospital sewage and superficial water samples, about the susceptibility profile to antimicrobials, the presence and diversity of the metallo β-lactamases (MBLs) genes and the genetic similarity among the strains. For this purpose, hospital sewage samples were collected from five hospitals located in Passo Fundo and Porto Alegre, RS, Brazil. The superficial water samples were collected from the water bodies where the sewage from two of the analyzed hospitals were discharged. The isolates were identified by classical biochemical tests and amplification of 16S rDNA fragment. The susceptibility was determined by the disk-diffusion method. The blaSPM-1, blaVIM e blaIMP genes were screened by PCR. The clonal relationship among the strains was evaluated by ERIC-PCR and PFGE. The diversity on MBL genes found was analyzed by DGGE. A total of 614 P. aeruginosa strains were analyzed, of which only 5,0 % showed the blaSPM-1 gene. All isolates with this gene showed the multirresistance phenotype. The genetic similarity analysis by ERIC-PCR and PFGE didn´t show clonal relationship between the strains from superficial water and hospital sewage or between the strains from samples of different hospital sewages. The presence of resistant isolates and isolates with the blaSPM-1 gene in hospital sewage samples call attention to the risk of environmental dissemination of bacterial resistance.

A presença de Pseudomonas aeruginosa resistentes a antimicrobianos no esgoto hospitalar contribui para sua disseminação em corpos d´água e possibilita o estabelecimento de reservatórios ambientais de resistência bacteriana. Os objetivos deste estudo foram comparar isolados de P. aeruginosa de amostras de esgoto hospitalar e água superficial quanto ao perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos, a presença e diversidade de genes de metalo β-lactamases (MBLs) e a similaridade genética entre os isolados. Para isso, as amostras de esgoto hospitalar foram coletadas de cinco hospitais, localizados em Passo Fundo e Porto Alegre, RS, Brasil. As amostras de água superficial foram coletadas dos corpos d´água que recebem os esgotos de dois hospitais estudados. Os isolados foram identificados por provas bioquímicas clássicas e pela amplificação de um fragmento do rDNA 16S. O perfil de susceptibilidade foi avaliado pela técnica de disco-difusão. Os genes blaSPM-1, blaVIM e blaIMP foram pesquisados por PCR. A relação clonal entre os isolados foi avaliada pela ERIC-PCR e PFGE. A diversidade nos genes de MBLs encontrados foi avaliada pela DGGE. Foram analisados 614 isolados de P. aeruginosa, dos quais somente 5,0% apresentaram o gene blaSPM-1. Todos os isolados com este gene apresentaram fenótipo de multirresistência. A análise de similaridade genética pela ERIC-PCR e PFGE não mostrou relação clonal entre isolados de água superficial e esgoto hospitalar ou entre isolados provenientes de amostras de diferentes esgotos hospitalares. A presença de isolados resistentes e com o gene blaSPM-1, em amostras de esgoto hospitalar, atenta para o risco de disseminação ambiental de resistência bacteriana. / The presence of Pseudomonas aeruginosa resistant to antimicrobials in hospital sewage contributes to its dissemination into water bodies and may lead to the establishment of environmental reservoirs of bacterial resistance. The objectives of this study were to compare P. aeruginosa strains isolated from hospital sewage and superficial water samples, about the susceptibility profile to antimicrobials, the presence and diversity of the metallo β-lactamases (MBLs) genes and the genetic similarity among the strains. For this purpose, hospital sewage samples were collected from five hospitals located in Passo Fundo and Porto Alegre, RS, Brazil. The superficial water samples were collected from the water bodies where the sewage from two of the analyzed hospitals were discharged. The isolates were identified by classical biochemical tests and amplification of 16S rDNA fragment. The susceptibility was determined by the disk-diffusion method. The blaSPM-1, blaVIM e blaIMP genes were screened by PCR. The clonal relationship among the strains was evaluated by ERIC-PCR and PFGE. The diversity on MBL genes found was analyzed by DGGE. A total of 614 P. aeruginosa strains were analyzed, of which only 5,0 % showed the blaSPM-1 gene. All isolates with this gene showed the multirresistance phenotype. The genetic similarity analysis by ERIC-PCR and PFGE didn´t show clonal relationship between the strains from superficial water and hospital sewage or between the strains from samples of different hospital sewages. The presence of resistant isolates and isolates with the blaSPM-1 gene in hospital sewage samples call attention to the risk of environmental dissemination of bacterial resistance.

Objetivos: Padronizar uma técnica molecular, Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para detectar os genes blaSPM-1 , blaVIM-2 e blaIMP-1 que conferem a Pseudomonas aeruginosa resistência a carbapenêmicos (imipenem e meropenem) através da produção das metalo-β-lactamases (MBL) SPM-1, VIM-2 e IMP-1. Comparar os resultados obtidos com a técnica de PCR com os obtidos através de uma técnica fenotípica para detecção desse mecanismo enzimático de resistência. Descrever a prevalência dos genes de MBL. Metodologia: Utilizando 48 amostras clínicas de P. aeruginosa resistentes a ceftazidima e/ou imipenem sendo 37 caracterizadas como produtoras de MBL através de uma técnica fenotípica (aproximação de disco) e 11 como não produtoras pela mesma técnica. Esses isolados foram testados com três primers específicos para os seguintes genes: blaSPM-1 , blaVIM-2 e blaIMP-1 Resultados e Discussão: Dos 37 isolados produtores de metalo-β-lactamase, 29 tiveram resultado positivo na PCR sendo 27 positivos para o gene blaSPM-1 e 2 positivos para o gene blaIMP-1 . Em nenhum isolado foi detectado o gene blaVIM-2 .Oito isolados caracterizados como produtores de MBL não tiveram nenhum produto amplificado com os três pares de primers. Os 11 isolados caracterizados como não produtores de MBL não tiveram produto amplificado. Assim, a sensibilidade da técnica molecular foi de 78,40% e a especificidade 100,0% considerando a técnica fenotípica de aproximação de disco como padrão ouro Conclusões: Foi possível a padronização da técnica de PCR para a detecção dos genes blaSPM-1 , blaVIM-2 e blaIMP-1 bem como foi possível a comparação entre a técnica de PCR e a técnica fenotípica, sendo que a metodologia molecular apresentou 100% de especificidade e 78,40% de sensibilidade. O gene de MBL mais prevalente foi blaSPM-1 encontrado em 27/29 amostras de P. aeruginosa resistentes ao imipenem. O gene blaIMP-1 foi detectado em apenas 2/29 amostras de P. aeruginosa resistentes ao imipenem. O gene blaVIM-2 e não foi detectado nas amostras de P.aeruginosa analisadas neste estudo.

Objetivos: Padronizar uma técnica molecular, Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para detectar os genes blaSPM-1 , blaVIM-2 e blaIMP-1 que conferem a Pseudomonas aeruginosa resistência a carbapenêmicos (imipenem e meropenem) através da produção das metalo-β-lactamases (MBL) SPM-1, VIM-2 e IMP-1. Comparar os resultados obtidos com a técnica de PCR com os obtidos através de uma técnica fenotípica para detecção desse mecanismo enzimático de resistência. Descrever a prevalência dos genes de MBL. Metodologia: Utilizando 48 amostras clínicas de P. aeruginosa resistentes a ceftazidima e/ou imipenem sendo 37 caracterizadas como produtoras de MBL através de uma técnica fenotípica (aproximação de disco) e 11 como não produtoras pela mesma técnica. Esses isolados foram testados com três primers específicos para os seguintes genes: blaSPM-1 , blaVIM-2 e blaIMP-1 Resultados e Discussão: Dos 37 isolados produtores de metalo-β-lactamase, 29 tiveram resultado positivo na PCR sendo 27 positivos para o gene blaSPM-1 e 2 positivos para o gene blaIMP-1 . Em nenhum isolado foi detectado o gene blaVIM-2 .Oito isolados caracterizados como produtores de MBL não tiveram nenhum produto amplificado com os três pares de primers. Os 11 isolados caracterizados como não produtores de MBL não tiveram produto amplificado. Assim, a sensibilidade da técnica molecular foi de 78,40% e a especificidade 100,0% considerando a técnica fenotípica de aproximação de disco como padrão ouro Conclusões: Foi possível a padronização da técnica de PCR para a detecção dos genes blaSPM-1 , blaVIM-2 e blaIMP-1 bem como foi possível a comparação entre a técnica de PCR e a técnica fenotípica, sendo que a metodologia molecular apresentou 100% de especificidade e 78,40% de sensibilidade. O gene de MBL mais prevalente foi blaSPM-1 encontrado em 27/29 amostras de P. aeruginosa resistentes ao imipenem. O gene blaIMP-1 foi detectado em apenas 2/29 amostras de P. aeruginosa resistentes ao imipenem. O gene blaVIM-2 e não foi detectado nas amostras de P.aeruginosa analisadas neste estudo.

A presença de Pseudomonas aeruginosa resistentes a antimicrobianos no esgoto hospitalar contribui para sua disseminação em corpos d´água e possibilita o estabelecimento de reservatórios ambientais de resistência bacteriana. Os objetivos deste estudo foram comparar isolados de P. aeruginosa de amostras de esgoto hospitalar e água superficial quanto ao perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos, a presença e diversidade de genes de metalo β-lactamases (MBLs) e a similaridade genética entre os isolados. Para isso, as amostras de esgoto hospitalar foram coletadas de cinco hospitais, localizados em Passo Fundo e Porto Alegre, RS, Brasil. As amostras de água superficial foram coletadas dos corpos d´água que recebem os esgotos de dois hospitais estudados. Os isolados foram identificados por provas bioquímicas clássicas e pela amplificação de um fragmento do rDNA 16S. O perfil de susceptibilidade foi avaliado pela técnica de disco-difusão. Os genes blaSPM-1, blaVIM e blaIMP foram pesquisados por PCR. A relação clonal entre os isolados foi avaliada pela ERIC-PCR e PFGE. A diversidade nos genes de MBLs encontrados foi avaliada pela DGGE. Foram analisados 614 isolados de P. aeruginosa, dos quais somente 5,0% apresentaram o gene blaSPM-1. Todos os isolados com este gene apresentaram fenótipo de multirresistência. A análise de similaridade genética pela ERIC-PCR e PFGE não mostrou relação clonal entre isolados de água superficial e esgoto hospitalar ou entre isolados provenientes de amostras de diferentes esgotos hospitalares. A presença de isolados resistentes e com o gene blaSPM-1, em amostras de esgoto hospitalar, atenta para o risco de disseminação ambiental de resistência bacteriana. / The presence of Pseudomonas aeruginosa resistant to antimicrobials in hospital sewage contributes to its dissemination into water bodies and may lead to the establishment of environmental reservoirs of bacterial resistance. The objectives of this study were to compare P. aeruginosa strains isolated from hospital sewage and superficial water samples, about the susceptibility profile to antimicrobials, the presence and diversity of the metallo β-lactamases (MBLs) genes and the genetic similarity among the strains. For this purpose, hospital sewage samples were collected from five hospitals located in Passo Fundo and Porto Alegre, RS, Brazil. The superficial water samples were collected from the water bodies where the sewage from two of the analyzed hospitals were discharged. The isolates were identified by classical biochemical tests and amplification of 16S rDNA fragment. The susceptibility was determined by the disk-diffusion method. The blaSPM-1, blaVIM e blaIMP genes were screened by PCR. The clonal relationship among the strains was evaluated by ERIC-PCR and PFGE. The diversity on MBL genes found was analyzed by DGGE. A total of 614 P. aeruginosa strains were analyzed, of which only 5,0 % showed the blaSPM-1 gene. All isolates with this gene showed the multirresistance phenotype. The genetic similarity analysis by ERIC-PCR and PFGE didn´t show clonal relationship between the strains from superficial water and hospital sewage or between the strains from samples of different hospital sewages. The presence of resistant isolates and isolates with the blaSPM-1 gene in hospital sewage samples call attention to the risk of environmental dissemination of bacterial resistance.

Introdução: Isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa multirresistentes estão associados a elevadas taxas de mortalidade. A resistência ao imipenem é uma urgência global, uma vez que é considerado o tratamento de escolha para infecções associadas a bactérias Gram negativas multirresistentes. Assim, elucidar os mecanismos de resistência é de vital importância para realizar um controle epidemiológico efetivo da disseminação deste tipo de isolado. Objetivos: Caracterizar os principais mecanismos de resistência ao imipenem em 76 isolados clínicos brasileiros de Pseudomonas aeruginosa, recuperados em 2004/2007, de 4 centros hospitalares do Estado de São Paulo. Material e métodos: Foram investigados: i) o perfil de resistência com determinação da CIM do imipenem; ii) a detecção de metalo-betalactamases (MBL) através de métodos fenotípicos e genotípicos; iii) a sensibilidade e especificidade do método de dupla difusão do disco na detecção de MBL; iv) a presença de genes codificadores de metilases 16S RNAr e sua associação com fenótipos aminoglicosídeo resistentes; v) alterações da permeabilidade por perda da porina OprD; vi) a presença ou ausência do gene oprD por PCR; vii) triagem fenotípica para expressão de bombas de efluxo através da determinação da CIM de quinolonas, cefalosporinas e carbapenêmicos na presença/ausência de inibidores específicos, realizando uma análise comparativa com o método de disco combinado; viii) os genes associados às bombas de efluxo mexA e mexE, através de PCR; ix) caracterizar a expressão das bombas de efluxo MexAB-OprM e MexEF-OprN, x) a clonalidade dos isolados por tipagem genotípica, através de ERIC-PCR, avaliando a relação genética (dendrograma) e sua associação com o predomínio de um determinado mecanismo de resistência. Resultados: Dentre os isolados de P. aeruginosa resistentes ao imipenem estudados (n=76, CIM50 e CIM90 = 32 µg/mL e > 512 µg/mL, respectivamente) 82% apresentaram um fenótipo de multirresistência. O principal mecanismo de resistência ao imipenem foi a produção de MBL, detectada em 74% dos isolados, e destes, 62% carregavam o gene blaSPM-1 e 12% carregavam o gene blaVIM-like. O método de dupla difusão do disco identificou a produção de MBL em 61% dos isolados. A combinação CAZ/MAA apresentou maior sensibilidade na detecção de MBL associada à SPM-1 (89%), mostrando uma especificidade de 86%. A presença do gene rmtD foi confirmada em 66% das amostras resistentes aos aminoglicosídeos, sendo que a presença concomitante do gene rmtD e do gene blaSPM-1 foi confirmada em 61% dos isolados. A deleção da porina OprD foi observada em 71% dos isolados. Dentre os isolados MBL positivos, 66% apresentaram ausência desta porina e, dentre as amostras MBL negativas, 85% não apresentaram OprD. Assim, para a resistência ao imipenem foi confirmada a contribuição de dois mecanismos, mediados pela presença de MBL e ausência de porina OprD. Em 13% (10/76) isolados, a deleção da porina OprD esteve associada à presença de seqüências de inserção (SI) em uma região anterior ao gene oprD. Por outro lado, a ausência de amplificação da região 736/1394 do gene oprD, em 11% (9/76) dos isolados, sugeriu a presença de polimorfismos. O gene mexA esteve presente em 92% dos isolados, enquanto que o gene mexE esteve presente em 82% dos isolados. A triagem de bombas de efluxo por disco combinado e análise da CIM na presença de reserpina, CCCP e PAβN, utilizando levofloxacina, meropenem, aztreonam, imipenem ou levofloxacina, não teve correlação com a superexpressão dos sistemas MexAB-OprM e MexEF-OprN. Ambos os métodos careceram de especificidade e sensibilidade quando comparados ao PCR em tempo real. A superexpressão dos sistemas mexA e mexE foi confirmada em 35% (7/20) isolados MBL negativos, enquanto que 11% (6/56) isolados MBL positivos apresentaram superexpressão do gene mexA ou mexE, sendo que 7% (4/56) isolados MBL positivos superexpressaram ambos os genes. A superexpressão dos sistemas MexAB-OprM e MexEFOprN como único mecanismo de resistência ao meropenem e imipenem foi confirmada em 10% (2/20) dos isolados MBL negativos. Nos 76 isolados, a tipagem genotípica por ERIC-PCR, identificou a presença de 24 clusters (considerando 90% de similaridade na análise do dendrograma). Conclusão: A convergência de múltiplos mecanismos de resistência em P. aeruginosa parece ser um evento favorável para a seleção de clones endêmicos multirresistentes disseminados na região Sudeste do Brasil. / Introduction: Clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa are associated with high mortality rates. Resistance to imipenem is a global concern, since it is a drug of choice for the treatment of infections produced by multidrug-resistant Gram-negative bacteria. Thus, research on resistance mechanisms is crucial to carry out an effective program for infection control and epidemiology of imipenem-resistant strains. Objective: to characterize the major mechanisms of imipenem resistance in 76 clinical isolates of P. aeruginosa recovered from clinical samples collected, from 2004 to 2007, in four hospitals in the State of São Paulo, Brazil. Material and methods: Isolates were screened for: i) resistance profile to antibacterial agents, determining the MIC of imipenem; ii) the detection of metallo-beta-lactamase (MBL) by phenotypic and genotypic methods, iii) MBL detection by using a double-disk diffusion test (D-test), determining the sensitivity and specificity of the assay; iv) the presence of genes encoding 16S rRNA methylases and their association with aminoglycoside-resistant phenotypes, v) changes in the bacterial permeability due to porin (OprD) loss; vi) the presence or absence of the oprD gene by using PCR; vii) phenotypic expression of efflux pumps by determining the MIC of quinolones, cephalosporins and carbapenems in the presence/absence of specific inhibitors, performing a comparative analysis with a combined-disk method, viii) genes encoding efflux pumps proteins (mexC and mexX) by PCR; ix) MexAB-OprM and MexEF efflux pumps expression; x) clonal relatedness, by ERIC-PCR genotyping, regarding the predominance of major resistance genotypes. Results: Among imipenem-resistant P. aeruginosa strains (n=76, MIC50 e MIC90 = 32 µg/mL e > 512 µg/mL, respectively) 82% showed a multidrug-resistant phenotype. The main mechanism of imipenem resistance was the MBL production detected in 74% strains, of which 62% harbored the blaSPM-1 gene, and 12% harbored the blaVIM-like gene. The D-test identified MBL production in 61% strains. In this regard, CAZ/MAA was the most sensitive combination for MBL detection associated to SPM-1 enzyme (89%), exhibiting 86% specificity. The presence of the rmtD 16S rRNA methylase gene was confirmed in 66% aminoglycoside-resistant strains. Moreover, presence of both rmtD and blaSPM-1 genes was identified in 61% strains. Loss of OprD porins was observed in 71% strains. In this regard, 66% MBL positive strains and 85% MBL negative strains showed OprD loss. Thus, MBL production and OprD loss contributed to imipenem resistance in P. aeruginosa. Most likely, in 13% (10/76) strains the porin loss was associated to insertion sequences (SI) inserted upstream of the oprD gene. On the other hand, in 11% (9/76) strains the absence of a PCR product targeting the 736/1394 region of the oprD gene, suggested the presence of polymorphisms. The mexA gene was identified in 92% strains, whereas the mexE gene was identified in 82% strains. Results obtained from efflux pump screening by using a combined-disk assay and MIC determination in the presence of reserpine, CCCP e PABN (using levofloxacin, meropenem, aztreonam or imipenem) was not correlated with results obtained from MexAB-OprM and MexEF-OprN overexpression analysis by RT-PCR. In this regard, both combined-disk and MIC assay showed lack of specificity and sensitivity in comparison to RT-PCR. Overexpression of mexA and mexE genes was confirmed in 35% (7/20) MBL-negative and 11% (6/56) MBL-positive strains, respectively, being 7% (4/56) MBL-positive strains overexpressed both genes. The overexpression of MexAB-OprM and MexEF-OprN efflux pumps, as only mechanism of resistance to meropenem and imipenem was observed in 10% (2/20) MBL-negative strains. ERICPCR typing revealed the presence of 24 clusters among 76 imipenem-resistant P. aeruginosa strains (≥ 90% similarity). Conclusion: The convergence of multiple mechanisms of resistance in Pseudomonas aeruginosa seems to be a favorable event for the selection of multiresistant clones endemic in the southeastern region of Brazil.