Thesis (Ph. D.)--University of Wisconsin--Madison, 1969. / Typescript. Vita. eContent provider-neutral record in process. Description based on print version record. Includes bibliographical references.

Submitted by Marcelo Andrade Silva (marcelo.andradesilva@ufpe.br) on 2015-03-09T14:23:51Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO Catarina Fernandes de Freitas.pdf: 2589861 bytes, checksum: 3f587b558e8abc1410528aa38d8eeb1a (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-09T14:23:51Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO Catarina Fernandes de Freitas.pdf: 2589861 bytes, checksum: 3f587b558e8abc1410528aa38d8eeb1a (MD5) Previous issue date: 2014 / A crescente incidência de isolados de Klebsiella pneumoniae resistentes a carbapenêmicos e outras classes de antibióticos -lactâmicos, em casos de infecções relacionadas a assistência a saúde, tem sido amplamente relacionada com a produção de β-lactamases. A necessidade da utilização de dispositivos invasivos como cateteres, em pacientes hospitalizados pode favorecer a colonização destes por diferentes espécies bacterianas, propiciando a formação de biofilmes, o que pode agravar o estado clínico do paciente prejudicando a eficácia terapêutica. O objetivo deste estudo foi detectar a presença dos genes de resistência blaSHV, blaTEM, blaCTX-M, blaKPC; genes de virulência para produção de cápsula polissacarídica (cps), fímbrias do tipo 1 (fimH) e tipo 3 (mrkD); e a capacidade de formação de biofilme por isolados de K. pneumoniae multidroga-resistente (MDR) na ausência e presença de antibióticos. Foram analisados nove isolados de K. pneumoniae oriundos de pacientes hospitalizados na cidade de Recife-PE. A concentração inibitória mínima dos antibióticos cefotaxima, ceftazidima e amicacina foi determinada pelo método de macrodiluição. Foi feita a tipagem molecular através da técnica de amplificação de sequências intergênicas repetitivas de enterobactérias (ERIC-PCR). A determinação da presença dos genes foi realizada por PCR convencional. A formação de biofilme foi analisada após inoculação e incubação dos isolados em meio de cultura com um fragmento de catéter na presença e neumoni dos antibióticos cefotaxima, ceftazidima e amicacina, além da combinação da ceftazidima e amicacina para os que foram resistentes à amicacina. Os neumonia foram processados para microscopia eletrônica de varredura. A genotipagem por ERIC-PCR demonstrou perfis genéticos distintos para os nove isolados. Sete dos nove isolados foram positivos para os genes blaTEM, blaSHV e blaKPC e seis para o gene blaCTX-M. Todos os isolados foram positivos para o gene cps e mrkD e seis para o gene fimH. Todos os isolados formaram biofilme na ausência de antibióticos. Três isolados não formaram biofilme quando submetidos aos antibióticos testados. Em dois isolados a capacidade de formar biofilme melhorou quando submetidos aos antibióticos. Enquanto que sete dos nove isolados submetidos aos antibióticos, a formação de biofilme foi menor quando comparada com o controle. Embora os isolados sejam resistentes aos antibióticos foi possível observar diminuição do número de células aderidas e a diminuição da formação de biofilme por isolados de K. pneumoniae MDR portadores de diferentes β-lactamases e de fatores de virulência, os quais apresentaram comportamentos distintos em relação a formação de biofilme, dependendo do isolado e do antibiótico, podendo este inibir ou induzir uma melhor formação de biofilme.

Submitted by Ramon Santana (ramon.souza@ufpe.br) on 2015-03-10T14:37:00Z No. of bitstreams: 2 Dissertaçao Rita de Cassia Melo.pdf: 1049570 bytes, checksum: 2912f081df833939c5b2ca15a160932c (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-10T14:37:01Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertaçao Rita de Cassia Melo.pdf: 1049570 bytes, checksum: 2912f081df833939c5b2ca15a160932c (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013-03-15 / Klebsiella pneumoniae é um patógeno oportunista frequentemente associado a infecções hospitalares do trato respiratório e do trato urinário de indivíduos imunocomprometidos e neonatos, e podem produzir diferentes tipos de fatores de virulência, como adesinas fimbriais (genes fimH e mrkD ) e sideróforos, como a yersiniabactina (gene irp2), importantes no desenvolvimento da infecção. O objetivo do presente estudo foi determinar a ocorrência dos genes de virulência fimH, mrkD e irp2 em isolados de K. pneumoniae produtores e não produtores de KPC, provenientes de pacientes de diferentes hospitais de Recife-PE, como também a relação clonal, através da ERIC-PCR, e o perfil de susceptibilidade a antimicrobianos desses isolados bacterianos. Para esse estudo foram selecionados 23 isolados produtores de KPC e 23 isolados não produtores de KPC, todos da espécie K. pneumoniae. Os genes de virulência foram detectados através da PCR e sequenciamento de DNA. Analisando o perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos dos isolados selecionados, observamos que a amicacina (n=39/ 84,78%) e a polimixina (n=41/ 89,13%), foram os antimicrobianos de melhor atividade para inibir a K. pneumoniae, tanto KPC-positivas quanto negativas, onde observamos que 5 isolados apresentaram resistência a polimixina, sendo 3 no grupo KPC-positivo e 2 no grupo KPC-negativo. Esse é o primeiro relato da resistência de K. pneumoniae à polimixina. No grupo KPC-positivo foi observada uma alta taxa de resistência à cefalosporinas, seguidas dos carbapenêmicos. Ficou evidenciado que o ertapenem é o melhor antimicrobiano para detectar resistência fenotípica ao grupo dos carbapenêmicos. A tipagem pela ERIC-PCR gerou 37 perfis genéticos, demonstrando que houve Uma disseminação multiclonal de isolados de K. pneumoniae em Recife-PE, Brasil. Dentre os 46 isolados analisados pela ERIC-PCR, cincoperfis agruparam mais de um isolado bacteriano com relação clonal. No presente estudo não foi possível detectar a relação direta entre a presença do gene blaKPC com cada gene de virulência individualmente, visto que os grupos estudados, KPC-positivo e KPC-negativo, apresentaram presenças semelhantes dos genes de virulência. Por outro lado, foi observado que os genes de virulência irp2, mrkD e fimH apresentaram-se juntos com uma maior frequência no grupo KPC-positivo. O acúmulo de genes de virulência em isolados de K. pneumoniae KPC positivos, observado nesse estudo, juntamente com a multirresistência, impõe relevantes limitações terapêuticas no tratamento de infecções causadas por K. pneumoniae em Recife-PE, Brasil.

Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular. / En las últimas dos décadas se ha registrado un incremento significativo en la detección de cepas hipervirulentas y multi-resistentes del patógeno bacteriano Klebsiella pneumoniae, lo cual estaría ligado con el alto dinamismo y la rápida evolución de su genoma. Dentro de los elementos genéticos móviles (EGMs) que determinan dicho dinamismo se encuentran las islas genómicas (IGs), que corresponden a fragmentos de DNA de hasta 200 kb que se integran preferentemente en genes que codifican tRNAs (tDNAs). Se ha demostrado que las IGs de K. pneumoniae y otras enterobacterias portan una gran variedad de genes relacionados con virulencia y resistencia a antibióticos, por lo que su identificación y caracterización a partir del creciente número de genomas secuenciados de esta especie resulta altamente relevante. En esta dirección, el presente trabajo describe el desarrollo de una herramienta para identificar IGs asociadas a tDNAs que se basa en el análisis del contexto genómico de dichos genes, es decir, la organización e identidad de los genes que se encuentran adyacentes en el cromosoma. En una primera etapa, el programa identifica los tDNAs y su contexto para luego clasificarlos y nombrarlos. En una segunda etapa, el programa analiza la continuidad del contexto genómico conservado de cada tDNA y determina la presencia de IGs cuando una disrupción es identificada. El programa creado, se utilizó para analizar el genoma de 50 cepas de K. pneumoniae, donde los resultados obtenidos fueron comparados con la identificación de IGs realizada manualmente y curada en un estudio previo realizado por nuestro grupo. Como resultado, se logró identificar correctamente un 99,3% de todos los tDNAs presentes en dichas cepas, además de 303 IGs de un total de 308 IGs detectadas manualmente. Adicionalmente, el programa mostró un desempeño satisfactorio, aunque mejorable en la detección de integrasas y repetidos directos, detectando ambos elementos en 148 de las IGs identificadas. Finalmente, se comparó el desempeño del programa desarrollado y otros programas para la identificación de IGs en la detección y delimitación de la isla GIE492 caracterizada experimentalmente en un trabajo previo de nuestro grupo, determinando que la detección hecha por el programa desarrollado por nuestro grupo es más sensible y precisa que cualquiera de los otros programas utilizados. / In the last two decades, there has been a significant increase in the detection of hypervirulent and multi-resistant strains of the bacterial pathogen Klebsiella pneumoniae, which would be related to the high dynamism and rapid evolution of its genome. Within the mobile genetic elements (EGMs) that determine this dynamism are Genomic Islands (IGs), which correspond to DNA fragments up to 200 kb that are preferentially integrated into genes encoding tRNAs (tDNAs). It has been shown that IGs from K. pneumoniae and other species from Enterobacteriaceae carry a wide variety of genes related to virulence and antimicrobial drug resistance. Thus, their identification and characterization among the increasing number of sequenced genomes from this species is highly relevant. In this direction, this work describes the development of a bioinformatics tool intended to identify IGs associated to tDNAs based on the analysis of the genomic context of these genes, that is, the organization and identity of the genes that are adjacent to tDNAs in the chromosome. In the first step, the program identifies all the tDNAs and their contexts to classify and name them. In a second step, the program analyzes the continuity of the conserved genomic context for each tDNA, determining the presence of a putative IG when a disruption of such continuity is detected. Our program was used to analyze the genome of a set of 50 K. pneumoniae strains, where the results obtained were compared with the identification of IGs performed and cured manually in a previous study conducted by our group. As a result, 99.3% of all the tDNAs present in the strains were correctly identified. Also, the software predicted 303 IGs from a total of 308 IGs detected manually. Additionally, the program showed a good performance in the identification of integrases and direct repeats, detecting both elements in 148 of the IGs, although there is still room for improvement. Finally, we compared the performance of our software and other programs for the identification of IGs, in the detection and precise delimitation of the xi GIE492 island, which was characterized experimentally in a previous work of our group. We determined that the detection made by our program was more sensitive and precise than any of the other programs tested.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-08-26T13:01:30Z No. of bitstreams: 3 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) ElzaDissertação: 1942336 bytes, checksum: a9041b50df03d17a3c0538c97db03452 (MD5) ElzaDissertação: 1942336 bytes, checksum: a9041b50df03d17a3c0538c97db03452 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-26T13:01:30Z (GMT). No. of bitstreams: 3 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) ElzaDissertação: 1942336 bytes, checksum: a9041b50df03d17a3c0538c97db03452 (MD5) ElzaDissertação: 1942336 bytes, checksum: a9041b50df03d17a3c0538c97db03452 (MD5) Previous issue date: 2016-02-24 / CAPEs / Klebsiella pneumoniae e Enterobacter aerogenes têm se destacado como importantes agentes de infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS), causando principalmente infecções de feridas, dos tratos urinário e respiratório, além de sepse. Essas infecções são causadas por linhagens bacterianas geralmente multirresistentes. Genes que codificam as enzimas modificadoras de aminoglicosídeos (EMAs) e metiltransferases 16S RNAr podem estar presentes em isolados de enterobactérias também produtores de Klebsiella pneumoniae carbapapenemase (KPC). Portanto, o objetivo deste estudo foi investigar genes que codificam resistência aos aminoglicosídeos em 30 isolados de E. aerogenes e em 28 isolados de K. pneumoniae portadores do gene blaKPC resistentes a amicacina, tobramicina e/ou gentamicina, oriundos de colonização e infecção em pacientes de diferentes hospitais em Recife-PE, Brasil. A investigação dos genes armA, rmtB, rmtD, aac(3)Ia, aac(3)IIa, aac(6´)Ib, ant(2´)Ia e aph(3’)-VI foi realizada através de PCR, seguida de sequenciamento de DNA. Nos isolados de K. pneumoniae observou-se uma maior ocorrência dos genes ant(2´)Ia, seguidos de aac(3)IIa, aph(3’)-VI e aac(6´)Ib. O gene mais encontrado em E. aerogenes foi o aph(3’)-VI, seguidos de aac(3)-IIa e ant(2”)-Ia. Esse é o primeiro relato de aph(3’)-VI em E. aerogenes no Brasil. Os genes aac(3)-Ia, armA, rmtB e rmtD não foram encontrados. Esses achados ressaltam para a gravidade da alta ocorrência de isolados de K. pneumoniae e E. aerogenes portadores de genes para EMAs e gene blaKPC principalmente colonizando pacientes, visto que essas bactérias podem atuar na disseminação de mecanismos de resistência dentro da unidade hospitalar e limitar as opções de tratamento. / Klebsiella pneumoniae and Enterobacter aerogenes have been highlighted as important agents of healthcare-associated infections (HAIs), primarily causing wound, urinary and respiratory tracts infections, and sepsis. These infections are often caused by multiresistant bacterial strains. Genes encoding aminoglycoside modifying enzymes (AMEs) and 16S RNAr methyltransferases can also be present in Enterobacteriaceae isolates producing Klebsiella pneumoniae carbapapenemase (KPC). Therefore, the aim of this study was to investigate genes encoding resistance to aminoglycosides in 30 isolates of E. aerogenes and 28 K. pneumoniae isolates carrying the blaKPC gene and resistant to amikacin, tobramycin and / or gentamicin, from colonization and infection in patients from different hospitals in Recife-PE, Brazil. The investigation of the genes armA, rmtB, rmtD, aac(3)Ia, aac(3)IIa, aac(6´)Ib, ant(2´)Ia e aph(3’)-VI was performed by PCR followed DNA sequencing. In K. pneumoniae isolates there was a higher incidence of genes ant(2´)Ia, followed by aac(3)IIa, aph(3’)-VI e aac(6´)Ib. The gene most frequently found in E. aerogenes was aph(3’)-VI, followed by aac(3)-IIa e ant(2”)-Ia . This is the first report of aph (3 ') - VI in E. aerogenes in Brazil. The genes aac(3)-Ia, armA, rmtB e rmtD were not found. These findings points to the seriousness of the high incidence of isolates of K. pneumoniae and E. aerogenes carriers of AMEs and blaKPC gene, mainly colonizing patients, since these bacteria can act in the dissemination of resistance mechanisms within the hospital and to limit treatment options.

Dans la nature, les micro-organismes sont organisés en communautés agrégées dénommées biofilms, particulièrement adaptées à la survie en milieu hostile. Les difficultés pour prévenir la formation ou éliminer des biofilms matures par des stratégies conventionnelles ont encouragé le développement de nouvelles approches inspirées des mécanismes de compétition entre différents micro-organismes au sein de biofilms naturels. Au cours de ce travail, nous nous sommes intéressés à l'effet anti-biofilm de bactéries bénéfiques appartenant aux genres Lactobacillus et Bifidobacterium. Dans un premier temps, nous avons testé l'effet anti-biofilm de surnageants neutralisés vis-à-vis de deux pathogènes Klebsiella pneumoniae et Staphylococcus epidermidis dans un modèle expérimental statique. Si les extraits des quelques souches de Bifidobacterium testées stimulaient la formation de biofilm par K. pneumoniae sur surface abiotique, la majorité de ceux des 140 souches de Lactobacillus exerçait un effet inhibiteur et nous avons retenu une des souches dont le surnageant de culture entraînait une inhibition majeure (70%), Lactobacillus plantarum CIRM653. Cet extrait s'est également avéré capable de disperser des biofilms préformés à K. pneumoniae sur surface abiotique mais aussi d’inhiber la formation de biofilms sur surface biotique, et ce indépendamment d’un effet bactéricide. La formation de biofilms mixtes formés par L. plantarum et K. pneumoniae dans des modèles expérimentaux cinétiques a permis, comparativement à l'observation de biofilms mono-espèce à K. pneumoniae, de mettre en évidence des défauts de structuration du biofilm associés à une diminution de la biomasse de K. pneumoniae et une augmentation de celle de L. plantarum. Grâce à une approche transcriptionnelle ciblée, nous avons montré que L. plantarum induisait, par le biais de son surnageant, des modifications de l’expression de gènes impliqués dans la formation de biofilm chez K. pneumoniae. Quatre gènes impliqués dans le quorum-sensing (opérons lsr) étaient sous-exprimés et trois gènes de structure du pilus de type 3 étaient sur-exprimés. L'augmentation de la production de pili de type 3 fonctionnels a été validée par Western-blot et des tests d’hémagglutination. Cette surexpression est probablement responsable du niveau élevé des capacités d’adhésion sur surface abiotique d'agrégats de K. pneumoniae issus de la dispersion induite par L. plantarum.Le comportement des deux souches a également été testé in vivo, dans un modèle murin de colonisation intestinale par K. pneumoniae avec administration orale quotidienne de L. plantarum. Le dénombrement du pathogène dans les selles des animaux a montré qu'en présence de L. plantarum, K. pneumoniae maintient des niveaux de colonisation élevés, contrairement au contrôle (sans Lactobacillus) où une diminution graduelle est observée.Enfin, nous avons initié le développement d'un modèle expérimental tripartite permettant d'associer les deux partenaires bactériens avec des cellules épithéliales dans un système en flux continu. La réponse spécifique des cellules eucaryotes a également été abordée : nous avons pu mettre en évidence que L. plantarum exerçait un effet inhibiteur vis-à-vis de la réponse inflammatoire épithéliale pulmonaire induite par K. pneumoniae. En conclusion, la description d'une activité anti-biofilm in vitro ne serait pas synonyme d'une réduction in vivo de la colonisation de surfaces biotiques, mais à une plus grande capacité de dissémination. Ces observations démontrent l’importance d’une expertise précise de l’action des bactéries bénéfiques et de la maitrise du ratio bénéfice-risque pour leur utilisation. / In the natural environment microorganisms are organized in aggregated communities called biofilms, which are particularly adapted to the survival in harsh conditions. The difficulties to prevent the formation or elimination of mature biofilms by conventional strategies have encouraged the development of new approaches inspired by competition mechanisms occurring between microorganisms within natural biofilms.In this work, we looked for anti-biofilm effects of beneficial bacteria belonging to Lactobacillus and Bifidobacterium genus. We first tested the anti-biofilm effect of neutralized supernatants against both pathogens Klebsiella pneumoniae and Staphylococcus epidermidis in a static experimental model. The few Bifidobacterium extracts tested led to an increase in biofilm formation by K. pneumoniae on abiotic surface, whereas the majority of the 140 strains of Lactobacillus exerted an inhibitory effect. Lactobacillus plantarum CIRM653 was selected for further experiments because its culture supernatant displayed major inhibition (70%). This extract was also capable of dispersing preformed biofilms of K. pneumoniae on abiotic surface, but also able to inhibit biofilm formation on biotic surface, independently of a bactericidal effect. The formation of mixed biofilm containing L. plantarum and K. pneumoniae in kinetic experimental models highlighted the biofilm structure defects associated with a decrease of K. pneumoniae biomass and an increase of that of L. plantarum, compared to a monospecies K. pneumoniae biofilm. Targeted transcriptional approach was used to assess changes in the expression of genes involved in biofilm formation by K. pneumoniae after contact with L. plantarum supernatant. Four genes involved in quorum-sensing (operons lsr) were under-expressed and three type 3 pili structural genes were over-expressed. The increase of functional surface located type 3 pili was validated by Western blotting and hemagglutination tests. This overexpression was probably responsible for the observed high level of adhesion capacity to abiotic surfaces of K. pneumoniae aggregates recovered after dispersion induced by L. plantarum.The behavior of the two strains was also tested in vivo in a K. pneumoniae murine intestinal colonization model with daily oral administration of L. plantarum. Viable cells counting of the pathogen in the animals’ feces showed that K. pneumoniae maintained high levels of colonization in the presence of L. plantarum, unlike the control (without Lactobacillus) where a gradual decrease was observed.Finally, we initiated the development of a tripartite experimental model allowing the combination of the two bacterial partners with epithelial cells in a continuous flow system. In parallel, the specific response of eukaryotic cells to these bacteria was addressed: L. plantarum exerted an inhibitory effect on the pulmonary epithelial inflammatory response induced by K. pneumoniae.In conclusion, these results highlight the discrepancy between in vitro anti-biofilm activity of L. plantarum and its in vivo behavior leading to increased dissemination of the pathogen. Substantial expertise of beneficial bacteria is therefore necessary to fully assess their benefit-risk ratio.

Objetivo: Avaliar mortalidade nas infecções por K. pneumoniae produtora de β- lactamase de espectro ampliado (KpESBL) em pacientes internados em unidades de terapia intensiva(UTI). Delineamento do estudo: Estudo de coorte histórico exposto-controlado, no período de janeiro de 2005 a outubro de 2007. Ambiente: UTIs do Hospital Nossa Senhora da Conceição (HNSC) em Porto Alegre /RS, Brasil. Pacientes: Adultos, maiores de 18 anos, internados nas UTIs e selecionados para completar 70 casos e 140 controles. Método: Os pacientes casos apresentavam infecção hospitalar por KpESBL e foram comparados aos pacientes controle que poderiam apresentar infecção por outro germe ou nenhuma infecção hospitalar (IH) na relação 1:2. Seguimento de 30 dias em ambos os grupos. As curvas de mortalidade foram realizadas pelo método de Kaplan-Meier. Resultados: Em ambos os grupos, o maior desfecho foi a cura. A taxa de mortalidade foi de 42,9% nos casos e 48,6% nos controles. O presente estudo não demonstrou diferença estatística na mortalidade entre os pacientes com infecção por KpESBL e o grupo controle, tanto na análise univariada (risco relativo ( RR)= 0,8 e intervalo de confiança (IC) de 95%, 0,52-1,23), como na regressão de Cox com fatores ajustados (RR= 0,86; IC95%= 0,54-1,35). Conclusões: Os pacientes com infecção por KpESBL não apresentaram maior mortalidade que os demais pacientes da UTI. Os pacientes com infecção por KpESBL que apresentaram infecção urinária e tiveram a terapia empírica adequada demonstraram menor mortalidade. / Objective: To evaluate mortality rate due to infections by extended-spectrum β-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae (ESBL-Kp) among patients in intensive care unit (ICU). Study design: Historical exposed-control cohort study conducted from January 2005 to October 2007. Setting: ICUs of Hospital Nossa Senhora da Conceição (HNSC) in Porto Alegre, Brazil. Patients: Adult patients older than 18 years hospitalized in ICU and enrolled up to 70 cases and 140 controls. Method: The patients in the case group, who had nosocomial infection by ESBL-Kp, were compared with control patients, who had infections by other organisms or no nosocomial infection (NI), at a 1:2 ratio. Both groups were followed up for 30 days. Mortality curves were estimated using the Kaplan-Meier method. Results: In both groups, the most frequent outcome was the cure. Mortality rate was 42.9% in the case group and 48.6% in the control group. There were no statistic differences in mortality between patients with ESBL-Kp infection and the control group in univariate analysis (Hazard ratio (HR = 0.8; 95% confidence interval( CI), 0.52 – 1.23) or in Cox regression with adjusted factors (HR = 0.86; 95%CI, 0.54 – 1.35). Conclusions: Patients with ESBL-Kp infection did not have higher mortality rates than the control patients in the ICUs. Patients with ESBL-Kp infection, urinary infection or who received adequate empirical therapy had lower mortality rates.

Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular. / En las últimas dos décadas, la especie bacteriana Klebsiella pneumoniae se ha convertido en uno de los principales focos de atención de las autoridades mundiales de salud, debido principalmente a la rápida aparición de cepas hipervirulentas y multiresistentes. La aparición de estas cepas estaría relacionada con el gran dinamismo del genoma de K. pneumoniae, promovido por una alta frecuencia de adquisición y pérdida de elementos genéticos móviles, entre los cuales las Islas Genómicas (GIs) jugarían un rol fundamental. Las GIs son segmentos de DNA que presentan un contenido GC distinto al del resto del cromosoma, y que pueden escindirse o integrarse en distintas posiciones de éste, normalmente en genes que codifican RNAs de transferencia (tDNAs). No obstante la importancia propuesta de las GIs en la evolución de K. pneumoniae, hasta ahora el número de GIs conocidas en esta especie es bajo, y poco se conoce respecto al uso de los tDNAs como sitios de integración de estos elementos en ésta y otras especies bacterianas. En este trabajo se caracterizó el set completo de tDNAs presentes en el cromosoma de 50 cepas de K. pneumoniae, identificando las GIs insertadas en dichos loci. Así, se identificaron y anotaron 97 clases de GIs, las que codifican sobre un 50% de proteínas con función desconocida. Además, se observó que solo un grupo reducido de tDNAs son ocupados como sitios de integración de GIs en esta especie, proponiendo y sometiendo a prueba posibles mecanismos o patrones que podrían explicar en parte este sesgo. Los resultados muestran que la dinámica de integración de GIs en K. pneumoniae es un área de investigación poco explorada, y que la evaluación del rol de las GIs en la hipervirulencia y resistencia a antibióticos de K. pneumoniae requerirá caracterizar una gran cantidad de proteínas codificadas en las mismas, cuya función se desconoce. / In the last two decades, the bacterial species Klebsiella pneumoniae has attracted the attention of global health authorities, mainly due to the dissemination of hypervirulent and multi-resistant strains, which are responsible for more severe infections and are more difficult to treat with the available antibiotics. The rapid development of these strains would be explained by the high dynamism of the K. pneumoniae genome, promoted by a high frequency of gain and loss of mobile genetic elements. Among them, genomic islands (GIs) were proposed to play a major role. GIs are DNA segments harboring a GC content that differs from the average for the host chromosome, and that can excise from and integrate into different locations, mainly into genes encoding transfer RNAs (tDNAs). In spite of the proposed role of GIs in K. pneumoniae evolution, a small number of these elements have been described in this species. Moreover, little is known regarding the usage of tDNAs as integration sites for these elements in bacteria. In this work we characterized the whole set of tDNAs typically present in the K. pneumoniae chromosome, searching for GIs integrated at each of them among 50 K. pneumoniae strains. This way, we identified a total of 97 classes of GIs, where more than 50% of the encoded genes have no predicted function. Additionally, we observed that only a small subset of tDNAs are used as integration sites for GIs in this species, and tested possible hypotheses explaining, at least partially, this bias in the selection of the integration site. Our results indicate that the dynamics of GIs integration in bacteria is an underexplored field, and that evaluating the impact of GIs over K. pneumoniae virulence and drug resistance will require efforts directed to address the functions of a high number of proteins encoded in their GIs.

Objetivo: Avaliar mortalidade nas infecções por K. pneumoniae produtora de β- lactamase de espectro ampliado (KpESBL) em pacientes internados em unidades de terapia intensiva(UTI). Delineamento do estudo: Estudo de coorte histórico exposto-controlado, no período de janeiro de 2005 a outubro de 2007. Ambiente: UTIs do Hospital Nossa Senhora da Conceição (HNSC) em Porto Alegre /RS, Brasil. Pacientes: Adultos, maiores de 18 anos, internados nas UTIs e selecionados para completar 70 casos e 140 controles. Método: Os pacientes casos apresentavam infecção hospitalar por KpESBL e foram comparados aos pacientes controle que poderiam apresentar infecção por outro germe ou nenhuma infecção hospitalar (IH) na relação 1:2. Seguimento de 30 dias em ambos os grupos. As curvas de mortalidade foram realizadas pelo método de Kaplan-Meier. Resultados: Em ambos os grupos, o maior desfecho foi a cura. A taxa de mortalidade foi de 42,9% nos casos e 48,6% nos controles. O presente estudo não demonstrou diferença estatística na mortalidade entre os pacientes com infecção por KpESBL e o grupo controle, tanto na análise univariada (risco relativo ( RR)= 0,8 e intervalo de confiança (IC) de 95%, 0,52-1,23), como na regressão de Cox com fatores ajustados (RR= 0,86; IC95%= 0,54-1,35). Conclusões: Os pacientes com infecção por KpESBL não apresentaram maior mortalidade que os demais pacientes da UTI. Os pacientes com infecção por KpESBL que apresentaram infecção urinária e tiveram a terapia empírica adequada demonstraram menor mortalidade. / Objective: To evaluate mortality rate due to infections by extended-spectrum β-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae (ESBL-Kp) among patients in intensive care unit (ICU). Study design: Historical exposed-control cohort study conducted from January 2005 to October 2007. Setting: ICUs of Hospital Nossa Senhora da Conceição (HNSC) in Porto Alegre, Brazil. Patients: Adult patients older than 18 years hospitalized in ICU and enrolled up to 70 cases and 140 controls. Method: The patients in the case group, who had nosocomial infection by ESBL-Kp, were compared with control patients, who had infections by other organisms or no nosocomial infection (NI), at a 1:2 ratio. Both groups were followed up for 30 days. Mortality curves were estimated using the Kaplan-Meier method. Results: In both groups, the most frequent outcome was the cure. Mortality rate was 42.9% in the case group and 48.6% in the control group. There were no statistic differences in mortality between patients with ESBL-Kp infection and the control group in univariate analysis (Hazard ratio (HR = 0.8; 95% confidence interval( CI), 0.52 – 1.23) or in Cox regression with adjusted factors (HR = 0.86; 95%CI, 0.54 – 1.35). Conclusions: Patients with ESBL-Kp infection did not have higher mortality rates than the control patients in the ICUs. Patients with ESBL-Kp infection, urinary infection or who received adequate empirical therapy had lower mortality rates.

O glicerol é gerado em grandes quantidades durante a produção de biodiesel e tem se tornado um substrato potencialmente atrativo para a produção microbiana de produtos de valor agregado como 1,3-propanodiol (1,3-PD). O presente trabalho teve como objetivo estudar a produção de 1,3-PD por células imobilizadas de K. pneumoniae BLh-1, utilizando glicerol residual como fonte de carbono. Primeiramente, foi estudado o efeito da concentração celular e do diâmetro das esferas no sistema de imobilização. Os resultados mostraram que a melhor combinação foi 100 mg de biomassa por mL de suporte e o diâmetro de 3,40 mm, pois apresentaram a maior produtividade. Em experimentos realizados para comparar a produção de 1,3-PD com células imobilizadas e em suspensão, a produção de 1,3-PD foi similar nos dois experimentos. Mas o uso de células imobilizadas levou à obtenção de maior produtividade de 1,3-PD, devido à alta densidade celular utilizada, uma das vantagens da utilização desta técnica. Foram realizados experimentos de reutilização das células imobilizadas, para avaliar a estabilidade de produção de 1,3-PD durante cinco bateladas, nos experimentos com intervalo de tempo entre as bateladas à produção de 1,3-PD foi mais estáveis em relação ao uso das esferas sem intervalo entre as bateladas e no final da quinta batelada as esferas de alginato de cálcio estavam com sua estrutura danificadas. Para os experimentos em biorreatores melhorias na imobilização foram realizadas, para aumentar a durabilidade e a resitência das esferas. Nos experimentos em biorreatores a produção de 1,3-PD foi aproximadamente de 25 g L-1 em batelada, os biorreatores contínuos atingiram o regime estacionário, após 40 h de cultivo. Este resultado foi influenciado pela queda do pH do meio de cultivo, que dificulta a produção de 1,3-PD. O controle de pH, é essencial na produção de 1,3-PD por K. pneumoniae BLh1, mas este desestabiliza a estrutura das esferas de alginato de cálcio. Para trabalhos futuros haverá a necessidade de buscar novas alternativas de suportes de imobilização, para que se possa controlar o pH dos experimentos, pois a imobilização celular mostrou ser uma alternativa biotecnológica viável na produção de 1,3-PD. / Glycerol is generated in large amounts during the production of biodiesel and it is becoming a potentially attractive susbstrate for microbial production of value-added products such as 1,3-propanediol (1,3-PD). This research aimed at studying the production of 1,3-PD using immobilized cells of K. pneumoniae BLh-1 on residual glycerol as the carbon source. First, we studied the effect of cell concentration and the diameter of the beads in the immobilization system. The results showed that the best combination is 100 mg biomass by mL of support and diameter of 3.40 mm, as presented in increased productivity. In the experiments to compare the production of 1,3-PD with immobilized cells and suspension cells the production of 1,3-PD was similar in both experiments. But the use of immobilized cells led to obtaining greater productivity 1,3-PD, due to the high cell density used, one of the advantages of using this technique. Experiments were conducted reuse of immobilized cells, to assess the stability of production of 1,3-PD for five batches, in the experiments with interval between batches to the production of 1,3-PD was more stable in relation the use of beads without interval between batches and at the end of the fifth batch of the calcium alginate beads were with its damaged structure. In experiments in bioreactors the production of 1,3-PD was approximately of 25 g L-1 in batch, continuous bioreactors reached steady state after 40 h of cultivation. The control of pH is essential in the production of 1,3-PD K. pneumoniae BLh-1, but this destabilizes the structure of the spheres of calcium alginate. Future studies will be necessary to seek new alternatives supports of the immobilization, for can control the pH of the experiments, because the immobilization cellular proved to be a viable alternative biotechnological production of 1,3-PD.