Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells, which display an extraordinary capacity to induce T-cell responses. Recent findings revealed that DCs also play a crucial role in the activation of natural killer (NK) cells representing important effectors in the innate immune defense against viruses and tumors. Here, we summarize various studies investigating the bidirectional crosstalk between human DCs and NK cells. In this context, it has been reported that DCs efficiently enhance CD69 expression, proliferation, interferon (IFN)-γ secretion and cytotoxic activity of NK cells. Cell membrane-associated molecules as well as soluble factors such as interleukin-12, tumor necrosis factor-α and type I IFNs contributed to DC-mediated NK cell activation. Reciprocally, the ability of human NK cells to enhance the immunostimulatory capacity of DCs was shown. Thus, NK cells promoted the maturation of DCs and markedly augmented their capacity to produce proinflammatory cytokines and to stimulate T-cell responses. The NK cell-mediated effects on DCs were dependent on cell membrane-associated molecules such as NKp30 and soluble factors such as tumor necrosis factor-α and IFN-γ. In conclusion, the reciprocal activating interaction between human DCs and NK cells may play a pivotal role in the immune defense against viruses and tumors. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Trotz intensiver Forschungsbemühungen ist bisher eine Heilung für Glioblastom (GBM)-Patienten nicht möglich gewesen. Selbst mit der üblichen aggressiven Standardtherapie wird lediglich eine mediane Überlebenszeit von 15 Monaten erreicht. Kommt es zusätzlich nach der Behandlung zur Rezidivbildung, so gibt es hierfür keine etablierte Standardtherapie. Es herrscht somit ein dringender Bedarf an neuen Behandlungsansätzen. Immuntherapien rücken immer mehr in den Fokus der Forschung und bergen oftmals ein hohes Potential. Vor-rangig wurden dabei bisher meist T-Zellen eingesetzt, allerdings bieten Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) ebenfalls vielversprechende Perspektiven. Insbesondere die Subpopulation der NKG2C-positiven NK-Zellen ist dabei von Interesse. Diese NK-Zellsubpopulation, welche in Patienten nach einer akuten humanen Cytomegalievirus (hCMV)-Infektion entdeckt wurde, zeichnet sich durch einen NKG2A-negativen sowie NKG2C-, KIR- und CD57-positiven Phänotyp aus. Zusätzlich besitzt sie eine erhöhte anti-tumorale Zytotoxizität. Der aktivierende NK-Zellrezeptor CD94/NKG2C bindet an das nichtklassische HLA-Klasse I-Molekül HLA-E. Es ist nach wie vor strittig, inwiefern eine hCMV-Infektion die Entstehung von GBMs begünstigt, allerdings wurde eine verstärkte Expression von HLA-E und HLA-G auf GBMs beobachtet. Somit stellen GBMs ein mögliches Ziel für die NKG2C-positiven NK-Zellen dar. Um die NKG2C-single positiven NK-Zellen in einer adjuvanten Behandlung von GBMs einzusetzen, müssen diese aufgrund ihrer geringen Anzahl im peripheren Blut zunächst mit einer geeigneten Methode expandiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine modifizierte PC3-Feederzelllinie – PC3PSCA-IL 2-mIL 15d-HLA-E*spUL40 zur selektiven Expansion von NKG2C-positiven NK-Zellen verwendet. Nach der erfolgreichen Verifizierung der verwendeten PC3-Feederzelllinie wurde diese eingesetzt, um primäre NK-Zellen von historisch hCMV-seropositiven Spendern zu expandieren. Die Expansion der NK-Zellen erfolgte für den ersten Teil der Arbeit im 24-Well-Format. Der Einsatz der modifizierten PC3-Feederzelllinie führte dabei zu einer selektiven Expansion NKG2C-single positiver NK-Zellen. Die NKG2C-single positiven NK-Zellen entstanden dabei de novo aus zuvor NKG2C-negativen NK-Zellen. Das Expansionsvermögen der einzelnen Spender wurde allerdings von dem initialen Anteil an NKG2C-single positiven NK-Zellen beeinflusst. Es zeigte sich, dass ein initialer Anteil von > 4 % NKG2C-single positiven NK-Zellen zu einer hoch signifikanten Steigerung der selektiven Expansion führte. Für die weiteren Auswertungen wurden daher lediglich solche Spender berücksichtigt. Daraus ergab sich für die NKG2C-single positiven NK-Zellen ein medianer Anteil von 93,3 % mit einem medianen selektiven Expansionsfaktor von 115,5 am Ende der Expansion. Im Verlauf der Expansion blieb die Expression aktivierender und inhibierender Rezeptoren erhalten. Durch die bestehende Expression inhibitorischer KIRs auf den NK-Zellen ist die Selbsttoleranz der expandierten NKG2C-positiven NK-Zellen gewährleistet. Da im 24-Well-Format eine Expansion im großen Maßstab nicht möglich war (mediane Zell-zahl 1,4 × 107 NK-Zellen), wurde die etablierte Expansionsmethode auf ein skalierbares System übertragen und entsprechend angepasst. Durch den Einsatz einer G-Rex 6M Well-Platte mit einem PC3-Feederzell-zu-NK-Zell-Verhältnis von 1:10 und einer verkürzten Expansionsdauer von 10 Tagen wurde für die NKG2C-single positiven NK-Zellen ein medianer Anteil von 57,7 % mit einem medianen selektiven Expansionsfaktor von 261,0 erreicht. Die mediane Zellzahl betrug 1,9 × 108 NK-Zellen. Neben dem initialen Anteil an NKG2C-single positiven NK-Zellen hat auch der NKG2C-Status einen Einfluss auf das Expansionsvermögen. Die vorhandene Deletion eines NKG2C-Allels resultierte in einem hoch signifikant geringeren An-teil an NKG2C-positiven NK-Zellen am Ende der Expansion. Die Expression verschiedener aktivierender und inhibierender Rezeptoren verhielt sich vergleichbar zum 24-Well-Format. Die so expandierten NKG2C-positiven NK-Zellen wurden anschließend für Zytotoxizitätsversuche verwendet. Es zeigte sich, dass eine Überexpression von HLA-E auf verschiedenen primären Glioblastom-Zellkulturen zu einer verstärkten Lyse durch die NKG2C-positiven NK-Zellen führte. Die minimale Stimulation der NK-Zellen mit 50 IU/ml IL-2 bewirkte eine zusätzliche Steigerung der spezifischen Lyse. Eine Sekretion von IFN-γ bzw. TNF-α wurde nach Kontakt mit den Zielzellen jedoch nicht beobachtet. Weiterhin wurde durch den Einsatz modifizierter K562-Zelllinien gezeigt, dass ein KIR-HLA-C-Mismatch die Degranulation der expandierten NKG2C-positiven NK-Zellen hoch signifikant begünstigt. Die Analyse des Sekretionsprofils zeigte hierbei ebenfalls, dass ein KIR-HLA-C-Mismatch tendenziell zu einer stärkeren Sekretion führte. Die Menge an sekretierten Proteinen war jedoch größtenteils gering. Iden-tisch zu den primären Glioblastom-Zellkulturen wurde keine Sekretion von IFN-γ bzw. TNF-α nach Kontakt mit den Zielzellen beobachtet. Für den weiterführenden Einsatz in einem klinischen Setting kann dies einen Vorteil darstellen, sollte jedoch noch detaillierter untersucht werden. Mithilfe der modifizierten PC3-Feederzelllinie – PC3PSCA-IL 2-mIL 15d-HLA-E*spUL40 ist es gelungen, selektiv NKG2C-positive NK-Zellen zu expandieren. Durch die Übertragung auf ein skalierbares System ist es zusätzlich möglich gewesen, große Mengen an NKG2C-positiven NK-Zellen zu generieren und erste Zytotoxizitätsversuche durchzuführen. Im Rahmen dieser zeigten sich die expandierten NKG2C-positiven NK-Zellen reaktiv gegenüber HLA-E-positiven Tumorzelllinien, besonders bei Zugabe geringer Mengen an IL-2 und im KIR-HLA-C-Mismatch-Setting. Aufgrund der hohen Spenderindividualität werden jedoch zur Validierung die Daten von zusätzlichen Spendern benötigt. Zusammenfassend kann man konstatieren, dass diese Arbeit eine solide Grundlage für den weiterführenden Einsatz von NKG2C-positiven NK-Zellen bzw. die Translation in die Klinik geschaffen hat. / In spite of intensive research efforts, a cure for glioblastoma (GBM) patients is not yet possible. Treating patients with the current highly aggressive standard therapy only results in a median survival time of 15 months. For patients suffering from a relapse after treatment no established standard therapy is available. Therefore, there is an urgent need for new treatment approaches. Immunotherapies more and more move into the spotlight of current research due to often holding great potential. So far, T cells have been used primarily, but natural killer cells (NK cells) also offer promising prospects. The subpopulation of NKG2C-positive NK cells is particularly interesting. This NK cell subpopulation, which was discovered in patients after an acute human cytomegalovirus (hCMV) infection, is characterized by a NKG2A-negative as well as NKG2C-, KIR- and CD57-positive phenotype. It also exhibits increased anti-tumor cytotoxicity. The activating NK cell receptor CD94/NKG2C binds to the non-classical HLA class I molecule HLA-E. The extent to which hCMV infection promotes the development of GBMs is still controversial, but an increased expression of HLA-E and HLA-G on GBMs has been observed. Thus, GBMs represent a potential target for NKG2C-positive NK cells. In order to use the NKG2C-single positive NK cells in an adjuvant treatment of GBMs, they must first be expanded using a suitable method due to their low frequency in peripheral blood. In this study, a modified PC3 feeder cell line – PC3PSCA-IL 2-mIL 15d-HLA-E*spUL40 was used for the selective expansion of NKG2C-positive NK cells. After successful verification of the PC3 feeder cell line it was used to expand primary NK cells from historically hCMV-seropositive donors. The expansion of the NK cells was carried out in a 24-well format for the first part of the work. The use of the modified PC3 feeder cell line led to a selective expansion of NKG2C-single positive NK cells. The NKG2C-single positive NK cells were generated de novo from previously NKG2C-negative NK cells. However, the expansion capacity of individual donors was affected by the initial proportion of NKG2C-single positive NK cells. It was found that an initial proportion of > 4 % NKG2C-single positive NK cells led to a highly significant increase in their selective expansion. Therefore, only these donors were considered for subsequent evaluations. This resulted in a median proportion of 93.3 % NKG2C-single positi-ve NK cells achieving a median selective expansion factor of 115.5 at the end of the expansion. The expression of activating and inhibitory receptors was maintained during the course of the expansion. The existing expression of inhibitory KIRs on the NK cells ensures the self-tolerance of the expanded NKG2C-positive NK cells. As a large-scale expansion was not feasible using the 24-well format (median cell count 1.4 × 107 NK cells), the established expansion method was transferred to a scalable system and adapted accordingly. By using a G-Rex 6M well plate with a PC3 feeder cell to NK cell ratio of 1:10 and a shortened expansion time of just 10 days, a median proportion of 57.7 % NKG2C-single positive NK cells with a median selective expansion factor of 261.0 was achieved. The median cell count was 1.9 × 108 NK cells. In addition to the initial proportion of NKG2C-single positive NK cells, the NKG2C status also had an impact on the expansion capacity. The presence of an NKG2C allele deletion led to a highly significant lower proportion of NKG2C-positive NK cells at the end of the expansion. The expression of various activating and inhibitory receptors was comparable to what was seen in the 24-well format. The NKG2C-positive NK cells expanded in this way were then used for subsequent cytotoxicity assays. The results showed that overexpression of HLA-E on various primary glioblastoma cell cultures led to an increased lysis through the NKG2C-positive NK cells. A minimal stimulation of the NK cells using 50 IU/ml IL-2 caused an additional increase of the specific lysis. However, no secretion of IFN-γ or TNF-α was observed after target cell contact. Furthermore, the use of modified K562 cell lines showed that a KIR-HLA-C mismatch favored the degranulation of expanded NKG2C-positive NK cells in a highly significant manner. The analysis of the secretion profile also showed that a KIR-HLA-C mismatch tended to lead to greater secretion. However, the amount of secreted proteins was mostly low. Identical to the primary glioblastoma cell cultures, no secretion of IFN-γ or TNF-α was observed after target cell contact. This may represent an advantage for further use in a clinical setting, but should be investigated in more detail. Using the modified PC3 feeder cell line – PC3PSCA-IL 2-mIL 15d-HLA-E*spUL40 it was possible to selectively expand NKG2C-positive NK cells. By transferring the cells to a scalable system, it was also possible to generate large quantities of NKG2C-positive NK cells and carry out initial cytotoxicity assays. In these assays, the expanded NKG2C-positive NK cells were reactive towards HLA-E-positive tumor cell lines, especially when small amounts of IL-2 were added as well as in a KIR-HLA-C mismatch setting. However, due to high donor individuality, data from additional donors is needed for validation. In summary, this work has created a solid basis for the further use of NKG2C-positive NK cells and their translation into the clinic.

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells, which display an extraordinary capacity to induce T-cell responses. Recent findings revealed that DCs also play a crucial role in the activation of natural killer (NK) cells representing important effectors in the innate immune defense against viruses and tumors. Here, we summarize various studies investigating the bidirectional crosstalk between human DCs and NK cells. In this context, it has been reported that DCs efficiently enhance CD69 expression, proliferation, interferon (IFN)-γ secretion and cytotoxic activity of NK cells. Cell membrane-associated molecules as well as soluble factors such as interleukin-12, tumor necrosis factor-α and type I IFNs contributed to DC-mediated NK cell activation. Reciprocally, the ability of human NK cells to enhance the immunostimulatory capacity of DCs was shown. Thus, NK cells promoted the maturation of DCs and markedly augmented their capacity to produce proinflammatory cytokines and to stimulate T-cell responses. The NK cell-mediated effects on DCs were dependent on cell membrane-associated molecules such as NKp30 and soluble factors such as tumor necrosis factor-α and IFN-γ. In conclusion, the reciprocal activating interaction between human DCs and NK cells may play a pivotal role in the immune defense against viruses and tumors. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Die Implantation eines linksventrikulären Herzunterstützungssystems (LVADs) hat sich in den letzten Jahren als eine vielversprechende Therapieoption für die terminale Herzinsuffizienz etabliert. Obwohl Infektionen nach LVAD-Implantation eine der häufigsten Komplikationen darstellen, sind die Veränderungen immunologischer Parameter vor und nach LVAD-Implantation unzureichend untersucht. Ein Großteil der Patienten mit LVAD-Implantation leidet unter Adipositas und weist damit zusätzliche Risikofaktoren in Bezug auf die Ausbildung von Komplikationen, insbesondere Infektionen auf. Deshalb wurde in der vorliegenden Studie untersucht, welche Veränderungen sich in Bezug auf ausgewählte immunologische Zellparameter in Abhängigkeit vom Body-Mass-Index (BMI) im ersten Jahr nach LVAD-Implantation ergeben. Die Patienten wurden anhand ihres BMI zum Zeitpunkt der LVAD-Implantation einer von drei Gruppen (Gruppe A, Normalgewicht: BMI von 18,5-24,9 kg/m2; n = 17; Gruppe B, Präadipositas: 25,0-29,9 kg/m2; n = 24; Gruppe C, Adipositas: ≥ 30,0 kg/m2; n = 27) zugeordnet. Die Gruppen wurden anhand der Erhebung demografischer Daten, vor Implantation bestehender Komorbiditäten, im postoperativen Verlauf auftretender Komplikationen sowie klinischer Laborparameter verglichen. An vier Messzeitpunkten (vor Implantation, 3 Monate, 6 Monate und 12 Monate nach LVAD-Implantation) wurden Vollblut- und Serumproben entnommen. Diese wurden mittels Durchflusszytometrie auf zelluläre Immunzellpopulationen, wie T- und B-Zellen, regulatorische T-Zellen (Tregs), dendritische Zellen (DCs) sowie Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) untersucht. Mittels Multiplex-Analyse wurde das Zytokinprofil analysiert. In der vorliegenden Studie waren die Gruppen in Bezug auf ihre demografischen Daten, vor Implantation bestehender Komorbiditäten und nicht-infektiöser Komplikationen im Verlauf nach LVAD-Implantation vergleichbar. Die Analyse der T-Zellen und ausgewählter T-Zell-Subpopulationen zeigte zum einen eine stärkere Erhöhung der T-Zellen bei präadipösen Patienten, geringere Anteile der CD8+ T-Zellen bei adipösen Patienten ein Jahr nach LVAD-Implantation sowie geringere Anteile von Tregs bei präadipösen Patienten ab sechs Monaten nach LVAD-Implantation. Ein Jahr nach LVAD-Implantation wiesen adipöse Patienten einen höheren Anteil an DCs auf als normalgewichtige und präadipöse Patienten. Eine vertiefende Analyse der Subpopulationen von mDCs und pDCs anhand der BDCA-Oberflächenmoleküle ergab, dass normalgewichtige und präadipöse Patienten im Verlauf des ersten Jahres nach LVAD-Implantation eine Erhöhung der Anteile BDCA1+ und BDCA3+ mDCs aufwiesen. Die Anteile der BDCA4+ pDCs waren bei den präadipösen und adipösen Patienten im Vergleich zu den normalgewichtigen Patienten drei Monate nach LVAD-Implantation reduziert. Es konnten keine Unterschiede der Anteile von NK-Zellen zwischen normalgewichtigen, präadipösen und adipösen Patienten detektiert werden, jedoch zeigte sich bei adipösen LVAD-Patienten im Vergleich zu den Normalgewichtigen zum ersten Messzeitpunkt nach LVAD-Implantation ein erhöhter Anteil der CD56bright NK-Zellen und ein reduzierter Anteil der CD56dim NK-Zellen. Zusammenfassend lässt sich mit dieser Studie ein deutlicher Einfluss des BMI auf immunologische Veränderungen nach LVAD-Implantation nachweisen. Neben den adipösen LVAD-Patienten zeigten auch präadipöse LVAD-Patienten weitreichende Änderungen immunologischer Zellparameter, die NK-Zellen, Tregs, DCs sowie CD4+ und CD8+ T-Zellen betrafen. Die Betrachtung aller nachgewiesenen immunologischen Veränderungen präadipöser und adipöser Patienten deutet auf eine eingeschränkte antivirale und antibakterielle Immunreaktivität und damit auf ein erhöhtes Risikoprofil für Infektionen nach LVAD-Implantation hin.:1. Inhaltsverzeichnis II 2. Abbildungsverzeichnis IV 3. Tabellenverzeichnis VII 4. Abkürzungsverzeichnis IX 5. Einführung 1 5.1 Herzinsuffizienz und linksventrikuläre Herzunterstützungssysteme 1 5.2 Infektionen als Komplikation nach LVAD-Implantation 4 5.3 Immunologische Parameter bei Herzinsuffizienz und nach LVAD-Implantation 6 5.3.1 T-Zellen 6 5.3.2 B-Zellen 8 5.3.3 Dendritische Zellen 9 5.3.4 Natürliche Killerzellen 10 5.3.5 Zytokine 10 5.4 Einfluss einer Adipositas auf das Outcome nach LVAD-Implantation und auf immunologische Parameter 12 6. Aufgabenstellung 14 7. Materialien und Methoden 15 7.1 Studiendesign und Probenentnahme 15 7.2 Probenaufarbeitung 17 7.3 Durchflusszytometrie 17 7.3.1 Messung der Immunzellpopulationen 19 7.3.2 Auswertung der durchflusszytometrischen Daten 22 7.4 Multiplexanalyse 26 7.5 Demografische Datenerhebung 28 7.6 Statistik 28 8 Ergebnisse 29 8.1 Demografische Daten und Komorbiditäten 29 8.2 Medikation im Zeitraum von sechs Wochen vor LVAD-Implantation 31 8.3 Gesundheitlicher Verlauf im Zeitraum von einem Jahr nach LVAD-Implantation 33 8.3.1 Gesundheitlicher Verlauf ohne Betrachtung eines Infektionsgeschehens 33 8.3.2 Infektionsgeschehen im Zeitraum von einem Jahr nach LVAD-Implantation 33 8.4 Flussraten des LVADs im Zeitraum von einem Jahr nach LVAD-Implantation 36 8.5 Vergleich ausgewählter Laborparameter 36 8.5.1 Hämatokrit, Erythrozyten- und Hämoglobinkonzentration 36 8.5.2 Thrombozytenkonzentration 39 8.5.3 Leukozytenkonzentration 40 8.5.4 CRP-Konzentration 40 8.5.5 Quick-Wert und die INR 41 8.6 Durchflusszytometrische Analyse 43 8.6.1 CD3+ T-Zellen 43 8.6.2 CD3+ CD8+ T-Zellen 44 8.6.3 CD3+ CD4+ T-Zellen 46 8.6.4 Regulatorische T-Zellen 49 8.6.5 B-Zellen 50 8.6.6 Zirkulierende DCs 50 8.6.7 Plasmazytoide DCs 51 8.6.8 Myeloide DCs 53 8.6.9 NK-Zellen 55 8.6.10 CD56bright und CD56dim/- NK-Zellen 56 8.7 Analyse der Immunbalance 58 9 Diskussion 60 10 Zusammenfassung der Arbeit 69 11 Literaturverzeichnis 71 12 Anhang 83 13 Selbstständigkeitserklärung 97 15 Danksagung 98

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Die vorliegende Arbeit beinhaltet die Generierung und Evaluation von Natürlichen Killerzellen, die EGFRvIII-positive und SDF-1alpha sekretierende primäre Glioblastomzellen aufspüren, erkennen und effizient abtöten können. Die Kombination der gelenkten Zytotoxizität mit einer optimierten Migration von Effektorzellen des Immunsystems wird auf Grundlage der in dieser Arbeit gewonnenen Daten als ein vielversprechender Ansatz für eine zukünftige Therapie des primären Glioblastoms vorgeschlagen.

Clinical application of natural killer (NK) cells against leukemia is an area of intense investigation. In human leukocyte antigen-mismatched allogeneic hematopoietic stem cell transplantations (HSCT), alloreactive NK cells exert powerful anti-leukemic activity in preventing relapse in the absence of graft-versus-host disease, particularly in acute myeloid leukemia patients. Adoptive transfer of donor NK cells post-HSCT or in non-transplant scenarios may be superior to the currently widely used unmanipulated donor lymphocyte infusion. This concept could be further improved through transfusion of activated NK cells. Significant progress has been made in good manufacturing practice (GMP)-compliant large-scale production of stimulated effectors. However, inherent limitations remain. These include differing yields and compositions of the end-product due to donor variability and inefficient means for cryopreservation. Moreover, the impact of the various novel activation strategies on NK cell biology and in vivo behavior are barely understood. In contrast, reproduction of the thirdparty NK-92 drug from a cryostored GMP-compliant master cell bank is straightforward and efficient. Safety for the application of this highly cytotoxic cell line was demonstrated in first clinical trials. This novel ‘off-theshelf’ product could become a treatment option for a broad patient population. For specific tumor targeting chimeric-antigen-receptor-engineered NK-92 cells have been designed.

Die vorliegende Arbeit beinhaltet die Generierung und Evaluation von Natürlichen Killerzellen, die EGFRvIII-positive und SDF-1alpha sekretierende primäre Glioblastomzellen aufspüren, erkennen und effizient abtöten können. Die Kombination der gelenkten Zytotoxizität mit einer optimierten Migration von Effektorzellen des Immunsystems wird auf Grundlage der in dieser Arbeit gewonnenen Daten als ein vielversprechender Ansatz für eine zukünftige Therapie des primären Glioblastoms vorgeschlagen.

Die genaue Implikation natürlicher Killer(NK)-zellen und Neutrophile in Autoimmunerkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS) ist nach wie vor ungeklärt und wurde daher im Mausmodell der multiplen Sklerose (MS), der experimentellen Autoimmunenzephalomyelitis (EAE), sowie bei MS und Neuromyelitis optica (NMO) Patienten untersucht. Bei MS Patienten konnte eine mit der Krankheitsaktivität korrelierende, reduzierte Zahl zirkulierender CX3CR1+NK Zellen festgestellt werden. Daher wurden die NK Zell-Dynamiken und der Einfluss von CX3CR1 auf diese im EAE Mausmodell untersucht. Hierbei konnte in Wildtyp(WT) sowie auch CX3CR1-defizienten EAE Mäusen eine Rekrutierung peripherer NK Zellen in das ZNS beobachtet werden. Anders als bei WT EAE Mäusen wiesen die NK Zellen bei CX3CR1-defizienten Mäusen einen primär unreifen Phänotyp auf, der möglicherweise als ursächlich für die erhöhte Krankheitsaktivität dieser Tiere gemutmaßt werden kann. Der Transfer reifer NK Zellen vor Immunisierung CX3CR1-defizienter Tiere zeigte folglich protektive Effekte und lässt schlussfolgern, dass die CX3CR1-vermittelte Rekrutierung reifer NK Zellen die EAE Neuroinflammation limitiert. Die Diskriminierung der MS von der klinisch ähnlichen NMO stellt nach wie vor eine Herausforderung dar. Neutrophile in ZNS-Läsionen und der Cerebrospinalflüssigkeit(CSF) können bei NMO, nicht aber MS Patienten nachgewiesen werden, weshalb Neutrophile aus dem Blut von NMO und MS Patienten hier vergleichend untersucht wurden. Die Neutrophile beider Patientengruppen wiesen einen aktivierten Phänotyp im Vergleich zu gesunden Kontrollen auf. Im Gegensatz dazu zeigte sich eine von Medikation und neurologischen Defiziten der Patienten unabhängige, kompromittierte Funktionalität der NMO verglichen mit MS Neutrophilen im Hinblick auf Migration, oxidativen Burst und Degranulierung. Die Neutrophilenfunktionalität könnte entsprechend potentiell als diagnostisches Diskriminierungskriterium zwischen der MS und der NMO dienen. / The implication of natural killer (NK) cells and neutrophils in autoimmune disorders of the central nervous system (CNS) remains elusive, and therefore was investigated in a mouse model for multiple sclerosis (MS), experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), and in patients with MS and neuromyelitis optica (NMO), respectively. In MS, a decreased frequency of circulating CX3CR1+NK cells correlating with the patient disease activity has been reported. Therefore, the pattern of NK cell mobilization and the contribution of CX3CR1 to NK cell dynamics in response to neuroinflammatory insult were investigated in the EAE model. Here, NK cells similarly mobilized from the periphery and accumulated in the CNS in both wild-type (WT) and CX3CR1-deficient mice during EAE. However, in mice lacking CX3CR1 the infiltrated NK cells displayed an immature phenotype contrasting with the mature infiltrates in the WT counterparts, apparently contributing to EAE exacerbation in those animals since transfer of mature WT NK cells prior to immunization of CX3CR1-deficient mice exerted a protective effect. Together, these data suggest that the CX3CR1-mediated recruitment of mature CX3CR1+NK cells limits EAE neuroinflammation. Due to clinical similarities, the discrimination between MS and NMO is still challenging. In contrast to MS, neutrophil accumulations were found in CNS lesions and the cerebrospinal fluid (CSF) of NMO patients wherefore a comparative analysis of peripheral blood neutrophils in NMO and MS patients was performed. The results revealed an activated neutrophil phenotype in NMO and MS when compared to healthy individuals. In contrast, analysis of neutrophil migration, oxidative burst activity and degranulation showed a compromised neutrophil functionality in NMO compared to MS, which was not influenced by the treatment regime and clinical parameters of the patients. Thus, neutrophil functionality may represent a new diagnostic tool to discriminate between NMO and MS.

Die spezifische adoptive Immuntherapie ist ein hoffnungsvoller Ansatz zur Behandlung von Tumoren. Die aufwendige individuelle Bereitstellung primärer Effektorlymphozyten könnte durch den Einsatz etablierter tumorantigenspezifischer Effektorzellinien vermieden werden. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob sich ein Tumortargeting der humanen Natürlichen Killer-(NK)-Zellinie YT durch den Gentransfer chimärer Immunglobulin-T-Zellrezeptoren (cIgTCRs) erreichen läßt. Die cIgTCR-Konstrukte wurden aus single-chain-Fv-Fragmenten (scFv), dem IgG1-Fc-Teil und der CD3-Zeta-Signalkette erzeugt. Die scFv-Fragmente wurden aus den humanisierten Antikörpern BW431/26 und HuM195, die spezifisch für das karzinoembryonale Antigen (CEA) bzw. CD33 sind, konstruiert und zeigten als scFv-hFc-Fusionsproteine eine spezifische Bindung an Tumorzellen. Die YT-Zellen wurden mit den cIgTCR-Genkonstrukten über Elektroporation transfiziert und über immunologische Verfahren angereichert. In-vitro-Studien ergaben eine spezifische Lyse von CEA+ Kolonkarzinomzellinien durch die scBW431/26-hFcZeta+ YT-Zellen. Die Zytotoxizität korrelierte mit der Expression des cIgTCR-Antigens auf den Tumorzellen und wurde durch zirkulierendes CEA nicht gehemmt. Die scHuM195-hFcZeta+ YT-Zellen zeigten eine spezifische Lyse der CD33+ myeloischen Leukämiezellinie KG1. Die Bestrahlung wurde zur Wachstumsbegrenzung der YT-Zellen eingesetzt. Die spezifische Zytotoxizität der scBW431/26-hFcZeta+ YT-Zellen gegenüber CEA+ Tumorzellen war einen Tag nach Bestrahlung unverändert. Die Koinjektion von CEA+ Tumorzellen mit bestrahlten scBW431/26-hFcZeta+ YT-Zellen führte zu einer signifikanten Hemmung des Tumorwachstums in NOD/SCID-Mäusen. Die cIgTCR+ YT-Zellen zeigten in vitro eine geringe Sensibilität gegenüber allogenen Blutlymphozyten. Die Ergebnisse zeigen, daß die Zytotoxizität der NK-Zellinie YT tumorantigenspezifisch durch cIgTCR-Gentransfer erweitert wird und ein Potential zur Behandlung minimaler Tumorerkrankungen besteht. / The specific adoptive immunotherapy is a promising strategy for cancer treatment. The utilization of established tumor antigen specific effector cell lines could bypass the expendable individual preparation and often limited specificity of primary effector lymphocytes. This study investigated the tumor targeting of the human Natural Killer (NK) cell line YT by gene transfer of chimeric immunoglobulin T cell receptors (cIgTCRs). The cIgTCR constructs were generated of single chain antibody fragments (scFv), the IgG1 Fc part and the CD3 Zeta chain. The scFv fragments were constructed of the humanized antibodies BW431/26 and HuM195 with specificity for the carcinoembryonic antigen (CEA) and CD33, respectively, and showed as scFv-Fc fusion proteins a specific binding to tumor cells. YT cells were transfected with the cIgTCR gene constructs by electroporation and enriched by immunological cell separation. In vitro studies revealed a specific lysis of CEA+ colon carcinoma cell lines by scBW431/26-hFcZeta+ YT cells. The cytotoxicity correlated with the expression of the cIgTCR antigen on the tumor cells and was not inhibited in the presence of soluble CEA. The scHuM195-hFcZeta+ YT cells mediated a specific lysis of the CD33+ myeloic leukemia cell line KG1. The irradiation was used to limit the growth of the YT cell line. The specific cytotoxicity of the scBW431/26-hFcZeta+ YT cells against CEA+ tumor cells was unaltered one day after irradiation. The coinjection of CEA+ tumor cells and irradiated scBW431/26-hFcZeta+ YT cells led to a significant growth inhibition in NOD/SCID mice. The cIgTCR+ YT cells showed a low susceptibility to the cytotoxicity of allogeneic blood lymphocytes in vitro. The results demonstrated that the cytotoxicity of the human NK cell line YT can be specifically extended to tumor antigens by cIgTCR gene transfer. The employment of receptor gene modified YT cells could be a useful tool for the adoptive immunotherapy of minimal tumor diseases.