Der humane, monoklonale IgG Antikörper BARB-4 konnte mit Hilfe der Hybridomatechnologie aus einem an Magenkarzinom erkrankten Patienten isoliert werden. BARB-4 stellt aufgrund seiner Keimbahnkodierung einen Bestandteil der innaten Immunität dar und ist eines der wenigen tumorspezifischen IgG Immunglobuline, die diesem Teil des Immunsystems zugeordnet werden können. Innerhalb dieser Arbeit konnte die Zielstruktur des Antikörpers identifiziert und näher charakterisiert werden. Das BARB-4 Antigen wurde hierbei über ein affinitätschromatographisches Verfahren aus Tumorzellmembranextrakten aufgereinigt und anschließend mittels MALDI-MS über die Peptidmassen-Fingerprint Methode analysiert. Das dabei isolierte Protein konnte eindeutig als humanes TAF15 identifiziert werden. Diese auf der Zellmembran von Tumoren exprimierte TAF15 Variante besitzt ein Molekulargewicht von etwa 78 kDa. Sie kommt im Gegensatz zum Wildtyp exklusiv in Tumorzellen vor und konnte nicht in Normalgewebe nachgewiesen werden. Immunhistochemische Untersuchungen mit BARB-4 und Anti-TAF15 Antikörper auf Tumor- und Normalgewebe deuteten dabei auf eine Koexistenz von Wildtyp und tumorspezifischer TAF15-Variante in malignem Gewebe hin und legten somit eine tumorspezifische Modifikation des TAF15BARB-4 nahe. Ein Carbohydrat-Epitop, wie es sehr häufig bei den natürlichen IgM Antikörpern vorkommt, konnte hier jedoch ausgeschlossen werden. In funktionellen Analysen konnte gezeigt werden, dass die Bindung des BARB-4 Antikörpers auf Tumorzellen einen Einfluss auf diverse zelluläre Prozesse ausübt. Durch die Bindung hemmte der Antikörper das Zellwachstum von Tumorzellen und induzierte deren Apoptose. Weitere interessante Eigenschaften des BARB-4, die bei Tumorzellen beobachtet werden konnten, sind vor allem für metastasierende Zellen von Bedeutung. Nach erfolgter Antikörperinkubation konnte bei Tumorzellen eine Inhibierung der Zelladhäsion und der Zellbeweglichkeit nachgewiesen werden. Diese beiden zellulären Prozesse sind wichtig für sich im Körper ausbreitende, maligne Zellen. In allen durchgeführten Analysen handelte es sich um vom Antikörper direkt vermittelte Effekte. Weitere Untersuchungen wurden durchgeführt, um das Bindungsverhalten des Antikörpers genauer charakterisieren zu können. Immunfluoreszenzanalysen zeigten dabei, dass der Antikörper BARB-4 nach der Bindung an die Tumorzellmembran internalisiert wird. Die Erforschung des BARB-4 Antikörpers und seiner Zielstruktur TAF15BARB-4 auf Krebszellen ermöglicht sowohl neue Einblicke in die Funktionsweise der innaten Immunität als auch neue Optionen für die zielgerichtete Tumortherapie. Die Identifizierung einer extrazellulären, tumorspezifischen TAF15 Variante bietet eine neue Möglichkeit für Diagnostik- und Therapieansätze. Durch die exklusive Expression auf Tumorzellen ermöglicht diese TAF15-Variante gezielt maligne Zellen zu attackieren ohne dabei gesunde Zellen zu beeinflussen. Durch das Vorkommen des TAF15BARB-4 in den verschiedensten Tumorentitäten könnte diese Zielstruktur für die Therapie vieler unterschiedlicher, maligner Erkrankungen genutzt werden. Aufgrund seiner funktionellen Eigenschaften, wie der Hemmung der Tumorzellmotilität und Tumorzelladhäsion, könnte der BARB-4 Antikörper besonders für die Prävention einer Metastasierung von Bedeutung sein. / BARB-4, a human monoclonal IgG antibody originally isolated from a stomach cancer patient using human hybridoma technology, is a germ-line encoded and innate immunity-related antibody, as are only few other tumor-specific IgG immunoglobulins. In this study, the antigen of the BARB-4 antibody was identified and characterized. The potential target was isolated from tumor cell membrane extracts using affinity chromatography and further analyzed by a peptide mass fingerprint method (MALDI-MS). By this approach, we identified a human TAF15 protein with a molecular weight of approximately 78 kDa. In contrast to the wild-type TAF15 protein, this TAF15 variant is exclusively present in tumor cells and could not be detected in normal tissue. Immunohistochemical stainings revealed a coexistence of wild-type TAF15 and tumor-specific TAF15BARB-4 in malignant tissue suggesting a tumor-specific modification of BARB-4 antigen. Importantly, a carbohydrate as potential epitope, typical for natural IgM antibodies, could be excluded. Functional analyses demonstrated that BARB-4 inhibits proliferation of tumor cells and induces apoptosis. In addition, incubation of tumor cells with BARB-4 diminished cell adhesion and motility, which are crucial steps during formation of metastases. We applied additional assays to obtain more detailed information about the binding properties of the antibody. Specifically, immunofluorescence approaches confirmed binding of BARB-4 to the tumor cell surface and its subsequent internalisation by endocytosis. All these findings appear to be directly antibody-mediated effects. The characterization of the BARB-4 antibody and its target TAF15BARB-4 may lead to deeper insights into the function of the innate immune system. Moreover, the identification of a tumor-specific antibody offers novel opportunities for the diagnosis of malignant tumors and may foster the development of novel, antibody-based therapeutic approaches. Based on the exclusive expression of TAF15BARB-4 on tumor cell surface, BARB-4 enables the discrimination of malignant and normal tissues, and the expression of TAF15BARB-4 in various cancer entities might be the basis for the development of tumor-specific therapies. By arresting tumor cell adhesion and tumor cell motility, BARB-4 could be especially useful for the prevention of metastases in malignant tumors.

The human-bacterial pathogen interaction is a complex process that results from a prolonged evolutionary arms race in the struggle for survival. The pathogen employs virulence strategies to achieve host colonization, and the latter counteracts using defense programs. The encounter of both organisms results in drastic physiological changes leading to stress, which is an ancient response accompanying infection. Recent evidence suggests that the stress response in the host converges with the innate immune pathways and influences the outcome of infection. However, the contribution of stress and the exact mechanism(s) of its involvement in host defense remain to be elucidated. Using the model bacterial pathogen Shigella flexneri, and comparing it with the closely related pathogen Salmonella Typhimurium, this study investigated the role of host stress in the outcome of infection. Shigella infection is characterized by a pronounced pro-inflammatory response that causes intense stress in host tissues, particularly the intestinal epithelium, which constitutes the first barrier against Shigella colonization. In this study, inflammatory stress was simulated in epithelial cells by inducing oxidative stress, hypoxia, and cytokine stimulation. Shigella infection of epithelial cells exposed to such stresses was strongly inhibited at the adhesion/binding stage. This resulted from the depletion of sphingolipidrafts in the plasma membrane by the stress-activated sphingomyelinases. Interestingly, Salmonella adhesion was not affected, by virtue of its flagellar motility, which allowed the gathering of bacteria at remaining membrane rafts. Moreover, the intracellular replication of Shigella lead to a similar sphingolipid-raft depletion in the membrane across adjacent cells inhibiting extracellular bacterial invasion. Additionally, this study shows that Shigella infection interferes with the host stress granule-formation in response to stress. Interestingly, infected cells exhibited a nuclear depletion of the global RNA-binding stress-granule associated proteins TIAR and TIA-1 and their accumulation in the cytoplasm. Overall, this work investigated different aspects of the host stress-response in the defense against bacterial infection. The findings shed light on the importance of the host stress-pathways during infection, and improve the understanding of different strategies in host-pathogen interaction. / Die Interaktion von Mensch und bakteriellem Krankheitserreger ist ein komplexer Prozess, der aus dem anhaltenden evolutionären Wettrüsten im Kampf ums Überleben resultiert. Der Erreger setzt Virulenzstrategien zur Kolonisierung des Wirtes ein und dieser nutzt Verteidigungsprogramme um dem entgegenzuwirken. Die Begegnung der beiden Organismen resultiert in drastischen physiologischen Veränderungen, welche zu Stress führen, der eine klassische infektionsbegleitende Reaktion ist. Neuere Untersuchungen deuten darauf hin, dass die Stressantwort des Wirtes mit den Signalwegen der angeborenen Immunantwort konvergiert und im Ergebnis die Infektion beeinflusst. Jedoch bleiben die Bedeutung des Stresses und der exakte Mechanismus wie Stress an der Verteidigung des Wirtes beteiligt ist, noch zu klären. In dieser Studie dienten der bakterielle Krankheitserreger Shigella flexneri und vergleichend dazu der nah verwandte Erreger Salmonella Typhimurium als Modellorganismen, um die Rolle von Wirtszellstress für den Ausgang der Infektion zu untersuchen. Die Infektion mit Shigellen ist durch eine ausgeprägte pro-inflammatorische Reaktion gekennzeichnet. Diese versursacht in den Wirtsgeweben, insbesondere im Darmepithel, einen starken Stress, der die erste Barriere gegen die Besiedelung mit Shigellen darstellt. In der vorliegenden Arbeit wurde entzündlicher Stress in Epithelzellen durch die Induktion von oxidativem Stress, Hypoxie und Zytokinstimulation simuliert. Die Shigelleninfektion von Epithelzellen, die solchen Belastungen ausgesetzt waren, war stark im Adhäsions-/ Bindungsstadium gehemmt. Dies resultierte aus der Verarmung von Sphingolipidflößen in der Plasmamembran durch stressaktivierte Sphingomyelinasen. Interessanterweise wurde die Adhäsion von Salmonellen, aufgrund ihrer Flaggellenvermittelten Beweglichkeit, nicht beeinträchtigt und ermöglichte so die Ansammlung von Bakterien an den verbleibenden Membranflößen. Darüber hinaus führte die intrazelluläre Replikation von Shigellen zu einer ähnlichen Verminderung von Sphingolipidflößen in der Membran benachbarter Zellen, wodurch die extrazelluläre bakterielle Invasion gehemmt wurde. Zusätzlich zeigt diese Studie, dass eine Infektion mit Shigellen mit der Bildung von Stressgranula in der Wirtszelle interferiert. Interessanterweise zeigten infizierte Zellen eine nukleäre Depletion der globalen RNA-bindenden und Stressgranula assoziierten Proteine TIAR und TIA-1 sowie deren Akkumulation im Zytoplasma. Insgesamt untersuchte diese Arbeit verschiedene Aspekte der Stressreaktion der Wirtszelle bei der Verteidigung gegen bakterielle Infektionen. Die Ergebnisse beleuchten die Bedeutung der Stresssignalwege im Wirt während der Infektion und verbessern das Verständnis der verschiedenen Strategien in der Interaktion von Wirt und Krankheitserreger.

The epithelial layer of the gastrointestinal (GI) tract provides a barrier between the environment and the body. Dysfunction of the epithelium, including changes of the innate immune response facilitated by pattern recognition receptors (PRRs), plays a major role in the development of GI disorders. However, the organization of innate immune sensing, the expression and activity of PRRs and the factors contri¬buting to such possible organization along the GI tract are unclear. In recent years, stem cell-derived organoids gained increasing attention as promising tissue models. Here, a biobank of human and murine organoids comprising three lines from each GI segment; corpus, pylorus, duodenum, jejunum, ileum, colon was generated. RNA sequencing of 42 lines confirmed the preservation of tissue identity and revealed an extensive organization of innate immune signaling components along the cephalocaudal axis, giving each segment a specific innate immune profile. Comple-menting the region-specific expression analysis, several PRRs in human and murine organoids showed region- and species-specific function. To investigate the factors contributing to the patterning of innate immunity in the GI tract, the impact of microbial components was analyzed using murine embryo-derived, never colonized gastric and proximal intestinal organoids. Transcriptional profiling of embryo-derived organoids showed that while expression of some PRRs may depend on environmental cues as expected, an unexpectedly large part of segment-specific expression of PRR signaling components is independent of prior contact with microbial products. Further, analysis of published RNA-seq data as well as in vitro experiments using directed differentiation of organoids into specific cell types showed that expression of innate immune gene also depended on cellular differentiation along the crypt-villus axis. This underlined the importance of cellular differentiation rather than contact to microbial compounds for expression of PRRs. Lastly, analysis of published datasets of RNA-seq and ATAC-seq after knockout of the intestinal transcription factor Cdx2 demonstrated that Cdx2 is likely important for the expression of Nlrp6 and Naip1 in the murine intestine. Future experiments have to support these preliminary findings. Taken together, the expression of a large part of epithelial innate immunity is develop¬mentally defined and conserved in tissue-resident stem cells. The identification of mechanisms governing expression of genes related to immunity will provide further insights into the mechanisms that play a role in the progress of inflammatory diseases. / Das Epithel des gastrointestinalen (GI) Traktes fungiert als Barriere zwischen der Umwelt und dem Körperinneren. Störungen des Epithels, darunter Veränderungen in der angeborenen Immunantwort, welche über „Pattern Recognition Receptors“(PRRs) ermöglicht wird, spielen eine bedeutende Rolle in der Entstehung gastrointestinaler Krankheiten. Auf welche Weise die angeborene Immunantwort im gastrointestinalen Trakt zwischen symbiotischen und schädlichen Mikroben unterscheidet, wie die Expression und Aktivität von PRRs organisiert sind, und die Faktoren die zu einer möglichen Organization beitragen sind bisher allerdings nicht bekannt. In den letzten Jahren haben aus Stammzellen gewonnene Organoide als vielversprechende Gewebemodelle steigende Aufmerksamkeit erregt. In dieser Arbeit wurde eine „Biobank“ humaner und muriner Organoide, jeweils bestehend aus 3 Linien jedes der gastrointestinalen Segmente Korpus, Pylorus, Duodenum, Jejunum, Ileum und Kolon generiert. Die RNA Sequenzierung von 42 Linien bestätigte den Erhalt der Gewebsidentität und zeigte eine umfangreiche Organization innerhalb der Signalkomponenten des angeborenen Immunsystems entlang der kraniokaudalen Achse, wodurch jedes Segment ein spezifisches Immunprofil erhält. Ergänzend zur regions-spezifischen Expressionsanalyse zeigten einige PRRs sowohl in humanen als auch in murinen Organoiden eine regions- und spezies-spezifische Funktion. Zur Untersuchung der Faktoren, die zur Strukturierung des angeborenen Immunsystems im GI-Trakt beitragen, wurde der Einfluss mikrobieller Komponenten untersucht. Hierfür wurden aus embryonalem Gewebe gewonnene Organoide des Magens und des proximalen Dünndarms verwendet, welche noch nicht mit dem Mikrobiom in Kontakt waren. Transkriptionsprofile embryonaler Organoide zeigten, dass die Expression einiger PRRs wie erwartet wahrscheinlich von Umweltfaktoren abhängt, dass ein unerwartet großer Anteil der segment-spezifischen Expression von Komponenten der PRR-induzierten Signalwege sich allerdings unabhängig vom Kontakt mit mikrobiellen Komponenten entwickelt. Des Weiteren zeigte die Analyse von bereits publizierten RNA Sequenzierungsdaten und in vitro Experimenten bei denen durch gezielte Differenzierung von Organoiden spezifische Zelltypen generiert wurden, dass die Expression von Genen des angeborenen Immunsystems auch von der zellulären Differenzierung entlang der Krypten-Zotten-Achse abhängt. Dies unterstreicht die Bedeutung von zellulärer Differenzierung für die Expression von PRRs, anstelle des Kontaktes zu mikrobiellen Komponenten. Auch konnte durch die Analyse bereits publizierter RNA- und ATAC-Sequenzierungsdaten nach knockout des im Dünndarm exprimierten Transkriptionsfaktors Cdx2 nachgewiesen werden, dass Cdx2 mit hoher Wahrscheinlichkeit wichtig für die Expression von Nlrp6 und Naip1 im murinen Dünndarm ist. Diese Erkenntnisse müssen in zukünftigen Experimenten validiert werden. Zusammengenommen zeigen die Ergebnisse, dass die Expression eines Großteils der angeborenen Immunität entwicklungsbiologisch festgelegt und in gewebe-spezifischen Stammzellen konserviert ist. Die zukünftige Identifikation von Mechanismen die die Expression von zur Immunität zugehörigen Genen steuern, wird weitere Erkenntnisse über die Mechanismen die eine Rolle in der Entwicklung entzündlicher Erkrankungen spielen bringen.

Endothelzellen sind ein aktiver Bestandteil der angeborenen Immunabwehr des Menschen gegen mikrobielle Pathogene. Unter ungünstigen Bedingungen kann die Abwehrreaktion sogar zu einer lebensbedrohlichen Sepsis führen. Hier wurde die bislang wenig bekannte Endothelantwort auf den fakultativ humanpathogenen Hefepilz Candida albicans, einem der häufigsten Verursacher von letaler Sepsis beim Menschen, näher untersucht. Mittels Oligonukleotid-Mikroarray-Analyse von HUVEC nach Exposition mit C. albicans konnten 56 hochregulierte Gene identifiziert werden, während 69 Gene herunterreguliert wurden. Ein bedeutender Anteil der regulierten Gene ist an Prozessen der angeborenen Immunantwort beteiligt und dient hauptsächlich der Rekrutierung von Neutrophilen. Weitere Untersuchungen ergaben eine zentrale Rolle des proinflammatorischen NF-kappaB-Weges bei der Regulation des Candida-induzierten Transkriptoms von Endothelzellen. Es konnte gezeigt werden, dass C. albicans diesen Signalweg sequenziell aktiviert. Zusätzlich konnte durch die Expression einer dominant-negativen Mutante einer Signalkomponente des NF-kappaB-Signalwegs die Candida-vermittelte Induktion von kappaB-abhängigen Genen gehemmt werden. Mit einem pharmakologischen Ansatz wurde der p38 MAP Kinase-Signalweg als weiterer bedeutsamer Signalweg identifiziert, der die Expression einzelner Candida-Zielgene wie CXCL8/IL-8 moduliert. Schließlich wurde gezeigt, dass die Candida-induzierte NF-kappaB-Aktivierung im untersuchten endothelialen Zellsystem unabhängig von den Toll-like Rezeptoren TLR2 und TLR4 geschieht, die üblicherweise an der Erkennung mikrobieller Pathogene beteiligt sind. Durch RNA-Interferenz-Experimente konnte jedoch dargelegt werden, dass das Adaptermolekül MyD88 und die Kinase IRAK1, die beide entscheidend an der TLR-vermittelten Signaltransduktion beteiligt sind, essentiell für die Weiterleitung des Signals in Endothelzellen sind. Nachfolgend konnte mit TLR3 zumindest einer der signaltransduzierenden Rezeptoren identifiziert werden. Als erste umfassende Untersuchung der endothelialen Antwort auf Candida albicans erlaubt die vorliegende Arbeit neue Einblicke in die komplexen Signalmuster von Endothelzellen, die dieser klinisch bedeutende Krankheitserreger auslöst. / Endothelial cells (ECs) actively participate in the innate defence against microbial pathogens. Under unfavourable conditions defence reactions can even turn into life-threatening responses resulting in sepsis. Here the so far largely unknown EC reaction patterns to Candida albicans were studied. C. albicans is a facultative human pathogenic fungus and a major cause of lethality in septic patients. Oligonucleotide microarray analysis revealed 56 genes that were transcriptionally up-regulated and 69 that were suppressed upon exposure of ECs to C. albicans. A major portion of these genes is involved in defence mechanisms of the innate immune system with a high representation of genes serving the recruitment of neutrophils to sites of infection. Further examination of candidate signalling cascades established a central role of the proinflammatory NF-kappaB pathway in the regulation of the Candida-modulated transcriptome of ECs. It was shown that the NF-kappaB signalling pathway becomes activated at various levels. In addition, expression of a dominant negative mutant of a NF-kappaB signalling pathway compound blocked the Candida-induced kappaB-dependent gene expression. Using a pharmacological approach the stress-activated p38 mitogen-activated protein (MAP) kinase pathway was identified as a second major regulatory pathway which critically contributes to the regulation of selected Candida target genes such as CXCL8/IL-8. Candida-induced NF-kappaB activation is mediated independently of Toll-like receptors (TLR) 2 and 4 that commonly have been implicated with microbial pattern recognition. Nevertheless, knock-down of the adapter molecule MyD88 and the essential downstream kinase of TLR-, IL-1R- and IL-18R-signalling, IRAK1, suggested that recognition and signalling via a TLR apart from TLR2/TLR4 is crucial for Candida-induced gene expression in primary ECs. Finally, RNAi experiments indicate that most likely TLR3 represents this receptor. These data provide the first comprehensive analysis of endothelial gene responses to Candida albicans and present novel insights into the complex signalling patterns triggered by this important pathogen.

Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecules (CEACAMs) are exploited by human-specific pathogens to anchor themselves to or invade host cells. Interestingly, human granulocytes express a specific isoform, CEACAM3, that can direct efficient, opsonin-independent phagocytosis of CEACAM-binding Neisseria, Moraxella and Haemophilus species. As opsonin-independent phagocytosis of CEACAM-binding Neisseria depends on Src-family protein tyrosine kinase (PTK) phosphorylation of the CEACAM3 cytoplasmic domain, we hypothesized that an SH2-containing protein might be involved in CEACAM3-initiated, phagocytosis-promoting signals. Accordingly, we screened glutathione-S-transferase (GST) fusion proteins containing SH2 domains derived from a panel of signaling and adapter molecules for their ability to associate with CEACAM3. In vitro pull-down assays demonstrated that the SH2 domain of the adapter molecule Nck (GST-Nck SH2), but not other SH2 domains such as the Grb2 SH2 domain, interact with CEACAM3 in a phosphotyrosine-dependent manner. Either deletion of the cytoplasmic tail of CEACAM3, or point-mutation of a critical arginine residue in the SH2 domain of Nck (GST-NckSH2R308K) that disrupts phosphotyrosine binding, both abolished CEACAM3-Nck-SH2 interaction. Upon infection of human cells with CEACAM-binding Neisseria, full-length Nck comprising an SH2 and three SH3 domains co-localized with tyrosine phosphorylated CEACAM3 and associated bacteria as analyzed by immunofluorescence staining and confocal microscopy. In addition, Nck could be detected in CEACAM3 immunoprecipitates confirming the interaction in vivo. Importantly, overexpression of a GFP-fusion protein of the isolated Nck SH2 domain (GFP-Nck-SH2), but not GFP or GFP-Nck SH2 R308K reduced CEACAM3-mediated phagocytosis of CEACAM-binding Neisseria suggesting that the adaptor molecule Nck plays an important role in CEACAM3-initiated signaling leading to internalization and elimination of human-specific pathogens.

Die Detektion sogenannter Vitalitäts-assoziierte molekularer Muster (vita-PAMPs), signalisiert dem Immunsystem die Präsenz lebender Mikroorganismen und ruft verstärkte Immunantworten hervor. Die vorliegende Studie untersuchte die Erkennung bakterieller Vitalität durch humane Antigen-präsentierenden Zellen (APC), sowie die Effekte auf die adaptive Immunität. Transkriptomanalysen von humanen Monozyten zeigten eine selektive transkriptionelle Antwort auf lebendige im Vergleich zu hitzegetöteten Bakterien. Die inflammatorischen Zytokine IL-12 und TNF wurden nahezu ausschließlich in Reaktion auf lebende Bakterien exprimiert. Die Detektion bakterieller Vitalität ist in Menschen, Schweinen, Mäusen und Fischen konserviert. In Mäusen wurde bakterielle RNA als bakterielles vita-PAMP identifiziert. In menschlichen Monozyten führte die Supplementierung toter Bakterien mit bakterieller RNA oder mit synthetischen Liganden des Toll-like-Rezeptors (TLR) 7 und TLR8, jedoch nicht mit anderen TLR-Liganden, zur Rekonstitution der TNF- und IL-12-Antwort. Umgekehrt hemmte silencing von TLR8- vita-PAMP-induzierte Zytokinproduktion. T-follikuläre Helferzellen (TFH) spielen eine zentrale Rolle in der Initiierung humoraler Immunantworten. Hier wurde die Erkennung lebender Bakterien, bakterieller RNA oder synthetischer TLR8-Liganden durch APC als Stimulus für robuste TFH-Zelldifferenzierung identifiziert. Die TFH-Differenzierung ist abhängig von der Erkennung bakterieller RNA über TLR8 und der Produktion von IL-12. Immunisierung von Schweinen mit einem bakteriellen Lebendimpfstoff löste deutlich robustere TFH-Zell- und Antikörperreaktionen als eine Immunisierung mit der hitzegetöteten Version des gleichen Impfstoffs aus. Zusammenfassend haben wir TLR8 als den ersten bekannten vita-PAMP-Rezeptor identifiziert und seine zentrale Rolle für TLR8-vermittelte “Vitalitätserkennung” für die Induktion von TFH-Zellen und Impfreaktionen demonstriert. / The detection of the so-called vitality-associated molecular patterns (vita-PAMPs) signals to the immune system the presence of living microorganisms and triggers an increased immune response. The present study investigated the detection of bacterial vitality by human antigen-presenting cells (APC), as well as the effects of this recognition events on adaptive immunity. Transcriptome analysis of human monocytes showed a selective transcriptional response to live versus heat-killed bacteria. Among others, the inflammatory cytokines IL-12 and TNF were expressed almost exclusively in response to live bacteria. Moreover, the detection of bacterial vitality is conserved in humans, pigs, mice and fish. In mice, bacterial RNA was identified as a bacterial vita-PAMP. In human monocytes, supplementation of dead bacteria with bacterial RNA or with synthetic ligands of toll-like receptor (TLR) 7 and TLR8, but not with other TLR ligands, resulted in the reconstitution of the TNF and IL-12 responses. Conversely, silencing of TLR8 inhibited vita-PAMP-dependent cytokine production. T-follicular helper cells (TFH) play a central role in the initiation of humoral immune responses. Here, the recognition of living bacteria, bacterial RNA or synthetic TLR8 ligands by APCs was identified as a stimulus for robust TFH cell differentiation. TFH differentiation is dependent on the recognition of bacterial RNA via TLR8 and the production of IL-12. Immunization of pigs with a live bacterial vaccine elicited significantly more robust TFH cell and antibody responses than immunization with the heat-killed version of the same vaccine. In summary, we identified TLR8 as the first known vita-PAMP receptor in human and demonstrated its pivotal role in TLR8-mediated “viability recognition” for the induction of TFH cells and vaccine reactions.

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells, which display an extraordinary capacity to induce T-cell responses. Recent findings revealed that DCs also play a crucial role in the activation of natural killer (NK) cells representing important effectors in the innate immune defense against viruses and tumors. Here, we summarize various studies investigating the bidirectional crosstalk between human DCs and NK cells. In this context, it has been reported that DCs efficiently enhance CD69 expression, proliferation, interferon (IFN)-γ secretion and cytotoxic activity of NK cells. Cell membrane-associated molecules as well as soluble factors such as interleukin-12, tumor necrosis factor-α and type I IFNs contributed to DC-mediated NK cell activation. Reciprocally, the ability of human NK cells to enhance the immunostimulatory capacity of DCs was shown. Thus, NK cells promoted the maturation of DCs and markedly augmented their capacity to produce proinflammatory cytokines and to stimulate T-cell responses. The NK cell-mediated effects on DCs were dependent on cell membrane-associated molecules such as NKp30 and soluble factors such as tumor necrosis factor-α and IFN-γ. In conclusion, the reciprocal activating interaction between human DCs and NK cells may play a pivotal role in the immune defense against viruses and tumors. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Humane Antikörper sind aufgrund ihrer spezifischen, zielgerichteten Eigenschaften die idealen therapeutischen Waffen unserer modernen Medizin. Schon im ausgehenden letzen Jahrhundert gelang es dem pathologischen Institut der Universität Würzburg einige rein humane monoklonale Antikörper aus Geweben sowohl gesunder, als auch an einem Tumorleiden erkrankter Patienten zu isolieren. Zwei dieser Antikörper galt es im Rahmen dieser Arbeit näher zu untersuchen: LM-1 und PAM-1 , beides rein humane monoklonale IgM-Antikörper. Mithilfe immunhistochemischer Färbungen auf Paraffinschnitten von Adenocarcinomen des Colons, Carcinomen des Pancreas und Adeno- und Plattenepithelcarcinomen der Lunge ließ sich eindeutig demonstrieren, daß bei beiden Antikörpern eine tumorspezifische Reaktivität ohne Kreuzreaktion mit den umgebenden gesunden Geweben auf fast allen der ausgewählten Fälle der begutachteten Tumorarten vorlag. Daraus lässt sich eine zuverlässige und selektive Expression der jeweiligen Antigene auf den maligne entarteten Zellen folgern, die sich auch bei Betrachtung der Stadien der Tumoren und des Gradings der Zellen konstant zeigte. Damit scheint soweit keinen Zusammenhang zwischen der Entdifferenzierung der tumorösen Zellen, als auch der Größe und des Fortschreiten des Tumors erkennbar. Die hier demonstrierten Ergebnisse lassen sowohl PAM-1 als auch LM-1 als verlässliche Marker für multiple epitheliale Tumoren und deren Vorstufen erscheinen und können somit als wertvolles diagnostisches und wahrscheinlich auch therapeutisches Mittel eingestuft werden, doch muss die Diskussion dieser Aspekte weiterführenden Untersuchungen überlassen werden. / Human antibodies are ideal therapeutic agents in modern medicine because of their specific and determined abilities. In the end of the last century, the institute of Pathology at the University of Wuerzburg had been successful in isolating several fully human monoclonal antibodies from different tissues of cancer patients as well as from healthy human beings. In this piece of work, two of these had been looked at more closely: PAM-1 and LM-1, both completely human monoclonal IgM antibodies. Immunohistochemical stainings on paraffin sections of tissues of adenocarcinoma of the colon, carcinomas of the pancreas and adeno- and squamous cell carcinomas of the lung clearly demonstrated the tumor specific reactivity of both antibodies without interaction with healthy tissues surrounding the malignant cells in nearly all of the selected cases. We have seen a constant and exclusive expression of the corresponding antigens on the neoplastic cells that appears to be a steady characteristic on all malign cells, no matter which stadium the tumor already reached or which state of grading had been shown by the cells. So far there seems to be any correlation between the de-differentiation of the tumor cells as well as the size and the progression of the tumor. The demonstrated results show PAM-1 and LM-1 as reliable markers on multiple epithelial tumors and their precursor lesions. With their exclusive tumor specific affinity to their corresponding antigens and their ability of initiating ADCC and CDC as well as inducing apoptosis, these antibodies have to be measured as precious diagnostic agents and perhaps as cancer immunotherapeutics. But these aspects of possible future cancer therapy have to be postponed on further discussions and investigations.

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells, which display an extraordinary capacity to induce T-cell responses. Recent findings revealed that DCs also play a crucial role in the activation of natural killer (NK) cells representing important effectors in the innate immune defense against viruses and tumors. Here, we summarize various studies investigating the bidirectional crosstalk between human DCs and NK cells. In this context, it has been reported that DCs efficiently enhance CD69 expression, proliferation, interferon (IFN)-γ secretion and cytotoxic activity of NK cells. Cell membrane-associated molecules as well as soluble factors such as interleukin-12, tumor necrosis factor-α and type I IFNs contributed to DC-mediated NK cell activation. Reciprocally, the ability of human NK cells to enhance the immunostimulatory capacity of DCs was shown. Thus, NK cells promoted the maturation of DCs and markedly augmented their capacity to produce proinflammatory cytokines and to stimulate T-cell responses. The NK cell-mediated effects on DCs were dependent on cell membrane-associated molecules such as NKp30 and soluble factors such as tumor necrosis factor-α and IFN-γ. In conclusion, the reciprocal activating interaction between human DCs and NK cells may play a pivotal role in the immune defense against viruses and tumors. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Macrophages are innate immune cells responsible for engulfing microbes and cell debris through phagocytosis and orchestrating immune responses to maintain homeostasis. While conducting immune surveillance over all types of organs and tissues, macrophages face inherently heterogeneous microenvironments with unique biophysical features. For instance, microglia residing in the brain, Kupffer cells living in the skin and bone osteoclasts are exposed to very distinct tissue stiffnesses. Despite the research done in the last decade clearly indicates that macrophages are sensitive to physical factors, how mechanical cues modulate their inflammatory response remains poorly understood. The present study aims at investigating how microenvironment stiffness influences the pro-inflammatory behaviour of macrophages. Besides characterising the regulatory effect on pro-inflammatory gene expression and cytokine production, this work examines the impact of stiffness on the inflammasome, one of the main macrophage signalling platforms. For this, an in vitro system based in 2D polyacrylamide hydrogels whose stiffness can be independently tuned was established. Using substrates with an elastic moduli between 0.2 and 33.1 kPa, bone marrow-derived macrophages adopted a less spread and rounder morphology on compliant compared to stiff polyacrylamide. Upon priming with lipopolysaccharide, the expression levels of the gene encoding for TNF-α were higher on more compliant hydrogels, yet there were no significant differences in the expression of other major pro-inflammatory genes. Additionally stimulating macrophages with the ionophore nigericin revealed higher secreted protein levels of IL-1β and IL-6 on compliant substrates. Interestingly, macrophages challenged on compliant polyacrylamide also displayed an enhanced formation of the NLRP3 inflammasome as well as increased levels of pyroptotic cell death. The upregulation of inflammasome assembly on compliant hydrogels was not primarily attributed to the reduced cell spreading, since spatially confining cells on micropatterns led to a decrease of inflammasome-positive cells compared to well-spread cells. Finally, interfering with actomyosin contractility diminished the differences in inflammasome formation between compliant and stiff substrates. In summary, these results show that substrate stiffness affects the pro-inflammatory response of macrophages and for the first time describe that the NLRP3 inflammasome is one of the signalling components affected by stiffness mechanosensing. The work presented here expands our understanding of how microenvironment stiffness affects macrophage behaviour and which elements of their machinery might contribute to integrate mechanical cues into the regulation of their inflammatory functions. The onset of pathological processes or the implant of foreign bodies represent immune challenges in which macrophages can face a mechanically changing environment. Therefore, a better insight on how macrophages detect and process biophysical signals could potentially provide a basis for new strategies to modulate inflammatory responses.:INTRODUCTION 1.1 Macrophage cell biology 1.1.1 The origin of macrophages 1.1.2 The macrophage: a swiss army knife 1.1.3 The macrophage pro-inflammatory response 1.2 Immunobiophysics: the force of the immune system 1.2.1 Exertion of immune cell forces 1.2.2 Immune cell mechanosensing 1.3 Cellular mechanosensing and mechanotransduction 1.3.1 Cell adhesions to the extracellular matrix 1.3.2 Nuclear mechanotransduction 1.3.3 Membrane mechanosensing elements 1.4 Macrophage mechanosensing AIMS AND SCOPE OF THE THESIS RESULTS 3.1 Morphol. characterisation of macrophages cultured on substrates of varying stiffness 3.1.1 BMDMs adhere and can be cultured on polyacrylamide hydrogels 3.1.2 Macrophage morphology is influenced by substrate stiffness 3.1.3 PEG-Hep hydrogels induce similar morphological differences as PAA substrates but do not constitute a suitable macrophage culture platform 3.1.4 Substrate stiffness affects membrane architecture 3.2 Impact of substrate stiffness on the pro-inflammatory response of macrophages 3.2.1 The morphol. differences induced by different stiffness persist after macrophage priming 3.2.2 Tuning substrate stiffness does not cause major changes in the expression of pro-inflammatory genes 3.2.3 Lower substrate stiffness upregulates the secretion of the cytokines IL-6 and IL-1β 3.2.4 Stiffer substrates diminish macrophage pyroptotic cell death 3.2.5 Compliant substrates enhance NLRP3 inflammasome formation 3.3 Investigation of macrophage mechanotransducing elements 3.3.1 Limiting cell spreading alone does not recapitulate the effects induced by stiffness on inflammasome formation 3.3.2 Actomyosin contractility may play a role in transducing the mechanical cues given by substrate stiffness DISCUSSION AND CONCLUSIONS 4.1 Compliant substrates enhance the macrophage pro-inflammatory response 4.2 Substrate stiffness influences the formation of the NLRP3 inflammasome 4.3 Exclusively altering cell spreading does not explain the differences induced by substrate stiffness 4.4 Actomyosin contractility as a potential macrophage mechanotransducer element 4.5 Potential impact of the study in the context of cancer 4.6 Potential impact of the study in the context of implant design 4.7 Conclusions of the study MATERIALS AND METHODS 5.1 Production of polyacrylamide (PAA) hydrogels 5.2 Production of polyethylenglycol-heparin (PEG-Hep) hydrogels 5.3 Mechanical characterisation of hydrogels and macrophages 5.4 Isolation and culture of bone marrow-derived macrophages (BMDMs) 5.5 Fluorescence confocal microscopy 5.6 Scanning electron microscopy (SEM) 5.7 Gene expression analysis using quantitative real-time PCR (qRT-PCR) 5.8 Cytokine quantification assays 5.9 Cell viability assay 5.10 Culture of BMDMs on micropatterns 5.11 Optical diffraction tomography (ODT) 5.12 Statistical analysis and data visualisation APPENDIX LIST OF ACRONYMS AND ABBREVIATIONS LIST OF FIGURES BIBLIOGRAPHY ACKNOWLEDGEMENTS / Als Teil des angeborenen Immunsystems sind Makrophagen dafür verantwortlich Pathogene und Zellrückstände durch Phagozytose zu beseitigen. Sie orchestrieren Immunantworten um homöostatische Bedingungen von Organen und Geweben aufrechtzuerhalten. Dabei sind sie extrem heterogenen Mikroumgebungen ausgesetzt, welche sich jeweils durch eine einzigartige Kombination von (bio)chemischen und mechanischen Eigenschaften, vor allem Gewebesteifigkeiten, auszeichnen. Dies veranschaulichen beispielsweise im Gehirn residierende Mikroglia, Kupffer-Zellen in der Haut und Osteoklasten in Knochen. Obwohl diverse Studien aus dem letzten Jahrzehnt eindeutig zeigen, dass Makrophagen auf mechanische Signale reagieren, ist der zugrunde liegende Mechanismus, wie diese Signale eine Entzündungsreaktion modulieren, noch immer unzureichend verstanden. Die vorliegende Studie beinhaltet die systematische Untersuchung, wie die Steifigkeit der Mikroumgebung das proinflammatorische Verhalten von Makrophagen beeinflusst. Neben der Charakterisierung der regulatorischen Wirkung auf die proinflammatorische Genexpression und Zytokinproduktion untersucht diese Arbeit auch den Einfluss der Steifigkeit auf das Inflammasom; eine der wichtigsten Signalplattformen für Makrophagen. Zu diesem Zweck wurde zunächst ein Zellkultursystem mit 2D-Polyacrylamid-Hydrogelen als Zellsubstrat entwickelt, bei dem das Elastizitätsmodul der Gelsubstrate gezielt eingestellt werden kann. Unter Verwendung von Substraten mit einem Elastizitätsmodul zwischen 0,2 kPa und 33,1 kPa zeigt die mikroskopische Analyse, dass aus Knochenmark stammende Makrophagen im Vergleich zu steifem Polyacrylamid eine weniger ausgebreitete und rundere Morphologie annehmen. Nach dem Primen mit Lipopolysaccharid waren die Expressionsniveaus des Gens, das für TNF-α kodiert, auf deformierbareren Hydrogelen höher, jedoch gab es keine signifikanten Unterschiede in der Expression anderer wichtiger pro-inflammatorischer Gene. Eine zusätzliche Stimulierung von Makrophagen mit dem Ionophor Nigericin bewirkte höhere sekretierte Proteinspiegel von IL-1β und IL-6 auf deformierbaren Substraten. Makrophagen, die deformierbarem Polyacrylamid ausgesetzt waren, zeigten auch eine verstärkte Bildung des NLRP3-Inflammasoms sowie ein erhöhtes Ausmaß an pyroptotischem Zelltod. Die Hochregulierung der Inflammasom-Assemblierung auf deformierbaren Hydrogelen wurde nicht primär auf die reduzierte Zellausbreitung zurückgeführt, da räumlich begrenzte Zellen auf Mikromustern zu einer Abnahme von Inflammasom-positiven Zellen im Vergleich zu stark ausgebreiteten Zellen führten. Schließlich verringerte eine Störung der Aktomyosin-Kontraktilität die Unterschiede in der Inflammasombildung zwischen deformierbaren und steifen Substraten. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass die Substratsteifigkeit die proinflammatorische Reaktion von Makrophagen beeinflusst und beschreiben erstmalig, dass das NLRP3-Inflammasom eine der Signalkomponenten ist, die von der zellulären Steifheitswahrnehmung beeinflusst werden. Die hier vorgestellte Arbeit erweitert unser Verständnis davon, wie die Steifigkeit der Mikroumgebung das Verhalten von Makrophagen beeinflusst und welche Elemente ihrer Maschinerie dazu beitragen könnten mechanische Signale in die Regulierung ihrer Entzündungsfunktionen zu integrieren. Das Einsetzen pathologischer Prozesse oder die Implantation von Fremdkörpern stellen Immunherausforderungen dar, bei denen Makrophagen einer sich mechanisch verändernden Umgebung ausgesetzt sein können. Daher könnte ein besserer Einblick in die Art und Weise, wie Makrophagen biophysikalische Signale erkennen und verarbeiten, möglicherweise eine Grundlage für neue Strategien zur Modulation von Entzündungsreaktionen bieten.:INTRODUCTION 1.1 Macrophage cell biology 1.1.1 The origin of macrophages 1.1.2 The macrophage: a swiss army knife 1.1.3 The macrophage pro-inflammatory response 1.2 Immunobiophysics: the force of the immune system 1.2.1 Exertion of immune cell forces 1.2.2 Immune cell mechanosensing 1.3 Cellular mechanosensing and mechanotransduction 1.3.1 Cell adhesions to the extracellular matrix 1.3.2 Nuclear mechanotransduction 1.3.3 Membrane mechanosensing elements 1.4 Macrophage mechanosensing AIMS AND SCOPE OF THE THESIS RESULTS 3.1 Morphol. characterisation of macrophages cultured on substrates of varying stiffness 3.1.1 BMDMs adhere and can be cultured on polyacrylamide hydrogels 3.1.2 Macrophage morphology is influenced by substrate stiffness 3.1.3 PEG-Hep hydrogels induce similar morphological differences as PAA substrates but do not constitute a suitable macrophage culture platform 3.1.4 Substrate stiffness affects membrane architecture 3.2 Impact of substrate stiffness on the pro-inflammatory response of macrophages 3.2.1 The morphol. differences induced by different stiffness persist after macrophage priming 3.2.2 Tuning substrate stiffness does not cause major changes in the expression of pro-inflammatory genes 3.2.3 Lower substrate stiffness upregulates the secretion of the cytokines IL-6 and IL-1β 3.2.4 Stiffer substrates diminish macrophage pyroptotic cell death 3.2.5 Compliant substrates enhance NLRP3 inflammasome formation 3.3 Investigation of macrophage mechanotransducing elements 3.3.1 Limiting cell spreading alone does not recapitulate the effects induced by stiffness on inflammasome formation 3.3.2 Actomyosin contractility may play a role in transducing the mechanical cues given by substrate stiffness DISCUSSION AND CONCLUSIONS 4.1 Compliant substrates enhance the macrophage pro-inflammatory response 4.2 Substrate stiffness influences the formation of the NLRP3 inflammasome 4.3 Exclusively altering cell spreading does not explain the differences induced by substrate stiffness 4.4 Actomyosin contractility as a potential macrophage mechanotransducer element 4.5 Potential impact of the study in the context of cancer 4.6 Potential impact of the study in the context of implant design 4.7 Conclusions of the study MATERIALS AND METHODS 5.1 Production of polyacrylamide (PAA) hydrogels 5.2 Production of polyethylenglycol-heparin (PEG-Hep) hydrogels 5.3 Mechanical characterisation of hydrogels and macrophages 5.4 Isolation and culture of bone marrow-derived macrophages (BMDMs) 5.5 Fluorescence confocal microscopy 5.6 Scanning electron microscopy (SEM) 5.7 Gene expression analysis using quantitative real-time PCR (qRT-PCR) 5.8 Cytokine quantification assays 5.9 Cell viability assay 5.10 Culture of BMDMs on micropatterns 5.11 Optical diffraction tomography (ODT) 5.12 Statistical analysis and data visualisation APPENDIX LIST OF ACRONYMS AND ABBREVIATIONS LIST OF FIGURES BIBLIOGRAPHY ACKNOWLEDGEMENTS