Des molécules sont présentées aux T Vγ9Vδ2 par une protéine de co-stimulation immune BTN3A.Le membre BTN3A2 est surexprimé dans 4 cancers, et pourrait agir comme récepteur leurre.Récemment, l’isoforme BTN3A2 a été décrite comme régulant la localisation membranaire du BTN3A1 grâce à une hétérodimérisation.L’objectif de mon projet était d’identifier le ligand de BTN3A2 pour une immunothérapie.Ainsi, nous avons tout d’abord sélectionné, par des études de liaison utilisant la cytométrie en flux, quelques lignées cellulaires T exprimant le ligand de BTN3A2. Puis basé sur notre sélection, la comparaison du profil d’expression génique a été effectuée, nous permettant d’établir une liste de protéines membranaires candidats du ligand de BTN3A2,les molécules HLA de classe II. Après génération de lignées cellulaires surexprimant les candidats potentiels de la méthode transcriptomique, ces cellules ont été utilisées pour des tests de liaison avec le BTN3A2-Fc qui se sont révélés négatifs dans les différentes conditions.De plus, la technologie de transfections transitoires puis tests de liaison, a été utilisée pour identifier les récepteurs partenaires potentiels de BTN3A2.Les quatre produits géniques restants ont été sélectionnés, PLPP3, SEMA6A, SEMA6C et MSR1 mais non validés.Finalement, nous avons utilisé un agent de capture avec trois bras, permettant une liaison covalente, qui a montré que BTN3A1 était le candidat potentiel. Dans notre projet, nous avons confirmé l’hétérodimérisation de BTN3A1/A2 et nous avons démontré la forme existante d’hétérodimérisation pour former une voie de signalisation activant les cellules T Vγ9Vδ2. / Molecules are presented to Vγ9Vδ2 T cells by immune costimulatory protein BTN3A.BTN3A2 which is devoid of a functional intracellular domain, is overexpressed in 4 cancers. Recently, BTN3A2 was described as regulator of subcellular localization of BTN3A1 thanks to heterodimerization. The aim of our project, was to identify the ligand of BTN3A2 for immunotherapy. Therefore, we have first selected by binding studies using flow cytometry, few T cell lines expressing BTN3A2 ligand.Based on the selection, a gene expression profile comparison was performed and allowed us to establish a list of membrane proteins expressed only in positive cell lines, BTN3A2 ligand candidates. The highest FC were found for HLA class II molecules. Cell lines overexpressing potential candidates of transcriptomic method were used for binding assays using BTN3A2-Fc, but were negative in all conditions. Then cell microarray technology was used to identify potential receptor partners of BTN3A2. 4 remaining gene products were selected, PLPP3, SEMA6A, SEMA6C and MSR1. The validation of these candidates was not done after transient transfection and binding test with BTN3A2-Fc (using flow cytrometry). Moreover, chemoproteomic experiments were performed to isolate and identify by mass spectrometry (MS) BTN3A2 ligand. Therefore, we used an original capture reagent (TFR) with three moieties, allowing covalent binding, which showed clearly BTN3A1 as a potential candidate. In our project, we have confirmed the heterodimerization of BTN3A1/A2 and we have demonstrated an existing form of heterodimerization that could interact with other proteins, to form a signaling pathway activating Vγ9Vδ2 T cells.

La sous-famille BTN3A comprend 3 isoformes : BTN3A1, A2 et A3. Le domaine intracellulaire B30.2 de BTN3A1 est impliqué dans la reconnaissance du Phosphoantigène (Pag) et l’activation des lymphocytes T Vγ9Vδ2(LTVγ9Vδ2). BTN3A2, dépourvue de B30.2, pourrait être un récepteur-leurre. L’anticorps monoclonal (Acm) 20.1 reconnaît les trois isoformes de BTN3A et sensibilise les tumeurs à la lyse par les LTVγ9Vδ2, mimant l’action des Biphosphonates (N-BP). Nous avons étudié l’expression, la régulation et le ciblage de BTN3A en contexte d’hémopathie maligne et de tumeur solide. Nous avons montré que BTN3A2 est l’isoforme majoritairement exprimée par les blastes de Leucémie Aiguë Myéloïde (LAM) primaire. Cependant, l’Acm 20.1 sensibilise les blastes de LAM primaire à la lyse par les LT Vγ9Vδ2, même ceux résistants aux N-BP. Cet effet est confirmé dans des souris NOD-SCID-γcKO xénogreffées avec la lignée U937 ou des blastes primaires. Nous avons ensuite montré l’expression de BTN3A sur des lignées et des tumeurs pancréatiques primaires et observé qu’elle est associée au pronostic chez les patients atteints de cancer du pancréas. L’expression de BTN3A2, isoforme majoritairement exprimée augmente en contexte de stress cellulaire hypoxique et métabolique. La faible expression de BTN3A1 comparativement à BTN3A2 et le clivage des BTN3A pourraient favoriser l’échappement tumoral à la reconnaissance par les LT Vγ9Vδ2. Cependant, les LT Vγ9Vδ2 ont des fonctions cytolytiques préservées en hypoxie. Le ciblage de BTN3A par l’Acm 20.1 sur les tumeurs étudiées, en restaurant la lyse par les LT Vγ9Vδ2, offrirait des perspectives thérapeutiques notamment pour les tumeurs chimiorésistantes. / BTN3A subfamily comprises three isoforms: BTN3A1, A2 and A3. The B30.2 intracellular domain of BTN3A1is involved in Phosphoantigen recognition and Vγ9Vδ2 T cells activation. BTN3A2, devoid of B30.2 domain, could be « a decoy receptor ». The agonist anti-BTN3A monoclonal Antibody (mAb) 20.1 recognizes the three BTN3A isoforms and sensitizes tumors to Vγ9Vδ2 T cell lysis. This mAb mimics the effect of Aminobisphosphonates (N-BP). We studied BTN3A expression, regulation and targeting in tumors of hematological and solid origin. We showed that primary Acute Myeloïd Leukemia (AML) blasts express BTN3A with a main expression of BTN3A2. However, the 20.1 mAb sensitizes primary AML blasts to Vγ9Vδ2 T cell lysis even N-BP-poorly sensitive blasts. This was confirmed in NOD-SCID-γc KO mice xenografted with U937 human cell line or primary blasts. Next, we have demonstrated BTN3A expression in pancreatic cell lines and primary tumors. We observed that BTN3A is associated to prognosis in patients with pancreatic cancer. BTN3A2 is the most highly expressed isoform and its level of expression increases upon hypoxic and metabolic cellular stress. The weak expression of BTN3A1 compared to BTN3A2 isoform together with BTN3A molecules shedding could constitute an immune escape mechanism of tumor cells from Vγ9Vδ2 T cells recognition. Though, Vγ9Vδ2 T cells have preserved cytotoxic functions under hypoxic condition. BTN3A targeting with anti-BTN3A 20.1 mAb on the tumors we studied would open new therapeutic perspectives notably in chemoresistant tumors, thanks to the restoration of Vγ9Vδ2 T cell lysis.