Staphylococcus aureus (S. aureus) est responsable de divers types d’infections chez l’homme et les animaux. Dans l’industrie laitière, ce pathogène est régulièrement mis en cause dans les infections intra-mammaires sous-cliniques qui persistent chez la vache et qui est à l’origine d’importantes pertes économiques. Le caractère chronique de cette infection lié aux échecs de l’antibiothérapie, sa difficile détection et l’inexistence de vaccin efficace ont suscité des recherches plus approfondies sur les S. aureus à l’origine de la mammite sous-clinique qui persiste afin de les diagnostiquer et de mieux les contrôler. Dans mon étude, j’ai caractérisé des marqueurs génétiques et phénotypiques de S. aureus persistant pour les utiliser comme un outil de diagnostique. La découverte de caractéristiques inhérentes aux souches causant des mammites bovines persistantes permettrait l'identification rapide de souches potentiellement problématiques en début d'infection et la prise de décisions justes prenant en compte la gestion thérapeutique et la gestion des troupeaux. La caractérisation des souches persistantes a commencé par la détection du profil des superantigènes qui sont des immuno-modulateurs de l’hôte. Ce profile nous a permis d’observer l’absence de l’îlot génomique νSaβ-1 chez les souches sous-cliniques. Cependant, la présence de seg augmente la probabilité de causer une infection non-persistante. L’étude du phénotype a permis d’observer une corrélation entre la production de biofilm et le niveau d’activation du système agr chez les souches persistantes et non persistantes. Nous avons observé une surexpression du biofilm suivi d’une sous-expression d’hld chez les souches persistantes et le phénomène inverse chez les souches non persistantes. Le typage par le gène spa a révélé que deux lignées bactériennes (t267 et t529) sont responsables de la majorité des cas de mammites sous-cliniques persistantes et cliniques au Canada.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Du fait de leurs propriétés immunostimulantes, les entérotoxines de Staphylococcus aureus (SEs) sont aussi considérées comme des outils thérapeutiques anticancéreux potentiels. Cependant, leurs implications dans de nombreuses pathologies humaines limitent leurs utilisations. Récemment, un opéron dénommé enterotoxin gene cluster (egc) codant pour cinq entérotoxines (SEG, SEI, SElM, SElN et SElO) supposées être de moindre virulence pour l’organisme, a été mis en évidence. En 2004, des patients atteints de carcinome broncho-pulmonaire ont été traités par l’administration d’un surnageant de culture d’une souche de S. aureus, contenant l’opéron egc. Ce traitement a permis d’allonger la durée de survie, et n’a eu aucun effet secondaire. Dans ce cadre, l’objectif de cette thèse a été d’étudier l’activité anti-tumorale des toxines de l’egc. Nos travaux ont mis en évidence l’activité tumoricide de ces toxines, induite par l’activation du système immunitaire. Cette toxicité est médiée par la sécrétion de nombreux médiateurs solubles comme le TNF-α et le NO. Nous avons confirmé le caractère pro-inflammatoire de type Th1 des toxines de l’egc. Nos travaux ont également montré qu’hormis SEI, les toxines de l’egc induisent des sécrétions de cytokines, chimiokines, protéases matricielles (MMPs) et facteurs de croissances nettement inférieures à celle induites par le reste des SEs. Ces résultats pourraient expliquer la faible toxicité associée aux toxines de l’egc. Enfin, nous avons montré que SElO possèdent une toxicité intrinsèque vis-à-vis des lignées tumorales. Cette étude plaide en faveur de l'intérêt des toxines de l’egc dans le développement de nouvelles approches en thérapie anti-tumorale / The use of classical superantigens (e.g. SEA, SEB and SEC) for treatment of cancer has resulted in a low response rates due to serious toxicity in humans. However, in a recent clinical study, remarkable results in treating lung cancer were obtained using superantigens encoded by the enterotoxin gene cluster (egc) without causing any significant toxicity. The current study was performed to investigate how egc superantigens (i.e. SEG, SEI, SElM, SElN and SElO) have tumoricidal activity with low toxicity. Indeed, we first demonstrated that tumoricidal activity of egc-SEs is mediated by immune cell activation, in particular, by secretion of soluble mediators such as nitric oxide and TNF-α. Thus, the proteomic analysis of the PBMC supernatants, showed that SEs-egc enhance the expression of pro-inflammatory cytokines, chimokines and many other biomarkers. Interestingly, levels were significantly higher in supernatants of SEA-stimulated PBMC than those with egc superantigens suggesting that staphylococcal superantigens differs in their inflammatory proprerties. Our results suggest that the relative lower pro-inflammatory activity of egc toxins may explain the low toxicity of these toxins observed during the clinical trial. Finally, we showed that SElO have a direct cytostatic activity against tumor cells. These findings suggest that egc-SEs seems to be good candidates for the development of new drugs in cancer therapy

Notre travail montre la prédominance du clone « Lyon » parmi les souches de Staphylococcus aureus responsables d’infections invasives (i.e. bactériémies). Il est caractérisé par la présence du gène codant la «staphylococcal enterotoxin » (SE) A. Afin de mieux comprendre le lien éventuel entre la prédominance de la SEA et la gravité des infections induites, nous avons orienté nos travaux sur le versant immuno‐inflammatoire des SE. L’étude des répertoires Vβ induits par l’ensemble des SE s’est révélée peu discriminante. A l’aide d’approches génomiques et protéiques réalisées sur des lymphocytes et monocytes humains, nous avons observé le puissant potentiel inflammatoire de la SEA en particulier par rapport à la SEG (SE appartenant à l’opéron egc retrouvé dans les infections de faible sévérité) et la prédominance de la réponse lymphocytaire T. Enfin, afin de mieux comprendre la spécificité des effets observés, nous avons conduit des expériences sur lymphocytes purifiés en ciblant les Ly T effecteurs (CD4+CD25‐) et Ly T régulateurs (CD4+CD25+FOXP3+). Nos travaux ont confirmé l’induction par la SEA d’une forte réponse inflammatoire, associant une synthèse de cytokines de type Th1 et Th17 dans les deux lignées lymphocytaires. De plus, nos résultats suggèrent que les SE provoquent une perte des fonctions suppressives des Ly T régulateurs ouvrant de nouvelles perspectives quant à l’implication des SAgs dans de nombreuses situations cliniques en particulier le choc septique, et les infections chroniques / Our work shows the prevalence of the “Lyon” clone among Staphylococcus aureus strains responsible for severe systemic infections (i.e. bacteremia). This clone is characterized by the presence of the staphylococcal enterotoxin (SE) A coding gene. To better understand the possible link between the prevalence of SEA and the severity of infections, we focused our work on the immuno inflammatory responses of SE. By using genomic and protein studies, in human lymphocytes and monocytes, we observed the potent inflammatory property of SEA (especially in comparison with SEG ‐ belonging to the egc cluster mainly found in less severe infections) mainly targeting T cell response over monocytes. Finally, to better understand the specificity of these effects, we performed experiments on purified lymphocytes and targeted effectors (CD4+CD25‐) and regulatory T lymphocytes (CD4+CD25+FOXP3+). Our works confirmed the induction by SEA of a strong inflammatory response, characterized by the release of Th1 and Th17 cytokines in both lymphocyte lineages. Furthermore, our results also showed the loss of the regulatory T cell suppressive functions after SE stimulation. Collectively, these results offer new perspectives for the implication of the SAgs in numerous clinical situations in particular toxic shock and the chronic infections.

Les staphylocoques à coagulase négative (SCN) sont généralement considérés comme des pathogènes opportunistes à faible virulence. Cependant, des études antérieures ont rapporté une pathogénicité de certaines souches similaire à celle observée chez S. aureus ce qui laisse supposer l’expression de facteurs de virulence. Cette thèse vise à contribuer à l’importance des SCN dans les infections primitives sévères. Nous avons évalué le potentiel pathogène de souches cliniques de SCN au Bénin. Pour atteindre cet objectif, des SCN associés à diverses infections cliniques sévères ont été collectés sur une période de 10 mois au Centre National Hospitalier et Universitaire Hubert Koutoukou Maga à Cotonou. Ces souches sont identifiées d’abord par la galerie API® Staph, puis par la spectrométrie de masse MALDI-TOF et analysées pour leur susceptibilité aux antibiotiques et leur capacité à produire des facteurs de virulence. Cette partie de l’étude a montré que les espèces les plus impliquées dans les infections à SCN au Bénin sont : S. haemolyticus et S. epidermidis suivi d’autres espèces comme S. cohnii, S. sciuri, S. arlettae, S. capitis. Nous avons aussi apporté la preuve de la multi-résistance des souches aux antibiotiques, ainsi que de la présence d’au moins un, voire plusieurs facteurs de virulence tels que la protéase, l’estérase, l’hémolysine, la leucotoxine et l’entérotoxine staphylococcique C chez 44% des souches testées particulièrement dans les souches hospitalières isolées d’hémocultures. Ensuite, nous avons caractérisé un nouveau facteur de virulence identifié chez deux souches de S. epidermidis : l’entérotoxine staphylococcique C nommée SECepi qui a été dosée à environ 100 µg/mL dans les surnageants de culture bactérienne. Le gène secepi est constitué de 801 pb correspondant à 266 acides aminés. Sur la base des résultats de la comparaison d'homologie entre la chaîne peptidique de SECepi et les séquences déjà connues, nous avons constaté que SECepi est proche de SEC3 de la souche de S. aureus Mu3, avec trois substitutions d'acides aminés dans le peptide signal et neuf substitutions d'acides aminés dans la protéine mature. Cependant, plusieurs résidus qui sont impliqués dans la formation du complexe trimoléculaire CMH-SEC-TCR sont conservés dans SECepi. L’analyse de la protéine recombinante (rSECepi) révèle une parenté antigénique et une forte homologie structurale prédite avec SECaureus. De plus, cette toxine présente les activités biologiques caractéristiques d'un superantigène (SAg) incluant la stimulation de la mitogénicité et de la production concomitante de fortes doses de cytokines pro-inflammatoires et suppressives chez des lymphocytes T humains activés. Par ailleurs, SECepi résiste assez bien au chauffage à 100°C et à la digestion par les enzymes gastro-intestinales telles que la pepsine et la trypsine. Ces résultats fournissent la preuve que SECepi peut agir comme un superantigène chez l'hôte humain bien que le type sauvage comporte plusieurs mutations chez S. epidermidis. L’étude du dossier médical de l’un des patients a montré que l’entérotoxine produite par la souche de S. epidermidis a bien pu être à l’origine d’éléments de gravité du tableau clinique présenté par ce dernier à son admission en hospitalisation. Enfin, l’analyse génomique des deux souches toxinogènes de S. epidermidis, ainsi que leur aptitude à former du biofilm, confirment les possibilités variées d’échanges génétiques entre cette espèce et S. aureus. Cette thèse souligne l'importance de la surveillance des infections à SCN chez l’homme parce que certaines souches, à l’instar de S. aureus, produisent des facteurs de virulence pouvant aggraver l’état générale l’hôte. / Coagulase-negative staphylococci (CNS) are generally considered as opportunistic pathogens with low virulence. However, previous studies have reported pathogenicity of some strains similar to that observed in S. aureus. This thesis aims to contribute to the importance of SCN in severe primitive infections. First, we evaluated the pathogenic potential of clinical CNS strains in Benin. To achieve this objective, CNS associated with various severe clinical infections were collected over at the Hubert Koutoukou Maga National Hospital and University Center in Cotonou. These strains are identified as well as their susceptibility to antibiotics and their ability to produce virulence factors. This part of the study showed that the most involved species in Benin are: S. haemolyticus and S. epidermidis followed by other species such as S. cohnii, S. sciuri, S. arlettae, S. capitis. We also demonstrated the multi-resistance of strains to antibiotics, as well as the presence of potential virulence factors such as protease, esterase, hemolysin, leukotoxin and, enterotoxin Staphylococcal C in 44% of strains tested particularly in hospital strains isolated from blood cultures. We, then, characterized a new virulence factor identified in two strains of S. epidermidis: staphylococcal enterotoxin C called SECepi, which was secreted at ~100 μg/mL in bacterial culture supernatants. The secepi gene consists of 801 bp corresponding to 266 amino acids. On the basis of the comparison between the peptide chain of SECepi and the already known peptide sequences of the SEC, we found that SECepi is close to SEC3 of S. aureus Mu3 strain with three amino acids substitutions in the signal peptide and nine amino acid substitutions in the mature protein. However, most residues involved in formation of the tri-molecular complex CMH-SEC-TCR are conserved in SECepi. Analysis of the recombinant protein (rSECepi) revealed antigenic relationships and a strong structural homology is predicted with SECaureus. Moreover, this toxin exhibits the biological activities characteristic of a SAg including the stimulation of the mitogenicity and the concomitant production of high doses of pro-inflammatory and suppressive cytokines in activated human T lymphocytes. Moreover, SECepi is resistant to heating at 100 °C and digestion by gastrointestinal enzymes such as pepsin and trypsin. These results provide evidence that SECepi can act as a superantigen in humans although the wild type has several mutations in S. epidermidis. The study of the medical record of one of the patients showed that the enterotoxin produced by the strain of S. epidermidis might be at the origin of severity of the clinics presented at hospital admission. Finally, genomic analysis of the two toxigenic S. epidermidis strains confirms the varied possibilities of genetic exchange between this species and S. aureus. This thesis underscores the importance of monitoring CNS infections in humans because some strains, like S. aureus, produce virulence factors that can aggravate the overall host condition.