MHCII molecules expose a weave of antigens, which send survival or activation signals to T lymphocytes. The ongoing process of peptide binding to the MHC class II groove implicates three accessory molecules: the invariant chain, DM and DO. The invariant chain folds and directs the MHCII molecules to the endosomal pathway. Then, DM exchanges the CLIP peptide, which is a remnant of the degraded invariant chain, for peptides of better affinity. Expressed in highly specialized antigen presenting cells, DO competes with MHCII molecules for DM binding and favors the presentation of receptor-internalized antigens. Altogether, these molecules exhibit potential immunomodulatory properties that can be exploited to increase the potency of peptide vaccines. DO requires DM for maturation and to exit the ER. Interestingly, it is possible to monitor this interaction through a conformation change on DOβ that is recognized by the Mags.DO5 monoclonal antibody. Using Mags.DO5, we showed that DM stabilizes the interactions between the DO α1 and β1 chains and that DM influences DO folding in the ER. Thus, the Mags.DO5+ conformation correlates with DO egress from the ER. To further evaluate this conformation change, directed evolution was applied to DO. Of the 41 unique mutants obtained, 25% were localized at the DM-DO binding interface and 12% are at the solvent-exposed β1 domain, which is thought to be the Mags.DO5 epitope. In addition, I used the library to test the ability of HLA-DO to inhibit HLA-DM and sorted for the amount of CLIP. Interestingly, most of the mutants showed a decrease inhibitory effect, supporting the notion that the intrinsic instability of DO is a required for its function. Finally, these results support the model in which DO competes against classical MHCII molecules by sequestering DM chaperone’s function. MHCII molecules are also characterized by their ability to present superantigens, a group of bacterial or viral toxins that coerces MHCII-TCR binding in a less promiscuous fashion than what is observed in a canonical setting. While the mechanism of how bacterial superantigens form trimeric complexes with TCR and MHCII is well understood, the mouse mammary tumor virus superantigens (vSAG) are poorly defined. In the absence of a crystal structure, I chose a functional approach to examine the relation between vSAG, MHCII and TCR with the goal of uncovering the overall trimolecular architecture. I showed that TCR concomitantly binds both the MHCII α chain and the vSAG and that TCR-MHCII docking is almost canonical when coerced by vSAGs. Because many peptides may be tolerated in the MHCII groove, the pressure exerted by vSAG seems to tweak conventional TCR-MHCII interactions. Furthermore, my results demonstrate that vSAG binding to MHCII molecules is conformation-dependent and abrogated by the CLIP amino-terminal residues extending outside the peptide-binding groove. In addition, they also suggest that vSAGs cross-link adjacent MHCIIs and activate T cells via a TGXY motif. / Les molécules du CMH présentent une panoplie d'antigènes qui, lorsque reconnus par un lymphocyte T spécifique, indique à ce dernier de survivre ou de s'activer. Le processus menant à la liaison d'un peptide à la poche du CMH de classe II, implique trois molécules accessoires, soit la chaine invariante, DM et DO. La chaine invariante replie et dirige les molécules du CMHII jusqu'à la voie endosomale. Ensuite, DM échange CLIP, peptide découlant de la dégradation de la chaine invariante, pour d'autres ayant une meilleure affinité. Exprimé seulement chez certaines cellules présentatrices, DO compétitionne avec les molécules du CMHII pour la liaison à DM et ainsi favorise la présentation d'antigènes internalisés par des récepteurs membranaires. Ensemble, ces protéines ont un potentiel immunomodulatoire pouvant être exploité afin d'augmenter l'efficacité de vaccin peptidique. DO requiert DM pour arriver à maturité et sortir du RE. Cette interaction, qui induit un changement de conformation dans la chaine β de DO, peut être sondée à l'aide de l'anticorps monoclonal Mags.DO5. En utilisant cet anticorps, nous avons montré que DM stabilise l'interaction entre les domaines α1 et β1 de DO et influence son repliement dans le RE. Donc, la conformation qui révèle l’épitope Mags.DO5 corrèle avec la migration de DO hors du RE. Afin d'étudier plus précisément ce changement de conformation, DO fut contraint à une ronde d’évolution dirigée. Des 41 mutants obtenus, 25% se retrouvent à l'interface DO- DM et 12% se retrouvent à la surface exposée au solvant du domain β1, région hypothétique de l'épitope Mags.DO5. De plus, la bibliothèque de mutants a été testée pour son habileté à inhiber l'activité de DM. La plupart des mutants montre une activité inhibitrice diminuée, ce qui supporte le model où DO compétionne les molécules du CMHII en séquestrant le rôle chaperon de DM. Les molécules du CMHII ont l'unique habileté de présenter les superantigènes, une famille de toxines virales et bactériennes qui force l'interaction CMHII-TCR de façon beaucoup moins spécifique qu'en contexte canonique. Alors que la façon dont les superantigènes bactériens s'assemblent avec le CMHII et le TCR soit bien comprise, la nature du complexe trimoléculaire découlant des superantigènes du virus de la tumeur mammaire de la souris (vSAG) reste mal définie. En l'absence d'une structure cristalline, une approche fonctionnelle a été choisie pour examiner la relation des vSAGs avec le CMHII et le TCR avec le but de dévoiler l'architecture de ce multi-complexe protéique. Je montre que le TCR lie parallèlement la chaine α du CMHII et vSAG, ce qui résulte en une interaction presque canonique. Puisque différents peptides peuvent être tolérés lors de cet ancrage, il semble que vSAG ajuste les interactions CMHII-TCR conventionnelles. En outre, mes résultats montrent que vSAG reconnait un épitope conformationnel et que cette liaison peut être abrogée par l'extension amino-terminale du peptide CLIP, laquelle s'étend en deçà de la niche. Finalement, mes résultats suggèrent que vSAG peut réticuler plusieurs CMHII adjacents et active les cellules T via son motif TGXY.

Les vaccins à base de cellules dendritiques (DCs) constituent une avenue très populaire en immunothérapie du cancer. Alors que ces cellules peuvent présenter des peptides exogènes ajoutés au milieu, l’efficacité de chargement de ces peptides au le complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe II est limitée. En effet, la majorité des molécules du CMH II à la surface des DCs sont très stable et l’échange de peptide spontané est minime. Confinée aux vésicules endosomales, HLA-DM (DM) retire les peptides des molécules du CMH II en plus de leur accorder une conformation réceptive au chargement de peptides. Il est possible, cependant, de muter le signal de rétention de DM de façon à ce que la protéine s’accumule en surface. Nous avons émis l’hypothèse que ce mutant de DM (DMY) sera aussi fonctionnel à la surface que dans la voie endosomale et qu’il favorisera le chargement de peptides exogènes aux DCs. Nous avons utilisé un vecteur adénoviral pour exprimer DMY dans des DCs et avons montrer que la molécule augmente le chargement de peptides. L’augmentation du chargement peptidique par DMY est autant qualitatif que quantitatif. DMY améliore la réponse T auxiliaire (Th) du coté Th1, ce qui favorise l’immunité anti-cancer. Du côté qualitatif, le chargement de peptides résulte en des complexes peptide-CMHII (pCMH) d’une conformation supérieure (conformère). Ce conformère (Type A) est le préféré pour la vaccination et DMY édite avec succès les complexes pCMH à la surface en éliminant ceux de type B, lesquels sont indésirables. La fonction de DM est régulée par HLA-DO (DO). Ce dernier inhibe l’habilité de DM à échanger le peptide CLIP (peptide dérivée de la chaîne invariante) en fonction du pH, donc dans les endosomes tardifs. Mes résultats indiquent que la surexpression de DO influence la présentation des superantigènes (SAgs) dépendants de la nature du peptide. Il est probable que DO améliore indirectement la liaison de ces SAgs au pCMH dû à l’accumulation de complexe CLIP-CMH, d’autant plus qu’il neutralise la polarisation Th2 normalement observée par CLIP. Ensemble, ces résultats indiquent que DMY est un outil intéressant pour renforcer le chargement de peptides exogènes sur les DCs et ainsi générer des vaccins efficaces. Un effet inattendu de DO sur la présentation de certains SAgs a aussi été observé. Davantage de recherche est nécessaire afin de résoudre comment DMY et DO influence la polarisation des lymphocytes T auxiliaires. Cela conduira à une meilleure compréhension de la présentation antigénique et de son étroite collaboration avec le système immunitaire. / Dendritic cell peptide-based vaccines are the most common immunotherapy approach in cancer therapy. While, in principle, dendritic cells (DCs) could be loaded efficiently by exogenously added tumor peptides, their loading efficacy is severely reduced due to low number of peptide-receptive MHC II on cell surface. Most surface MHC II molecules are either occupied by endogenous peptides or are inactive due to a conformation that is not receptive for free peptides. In MHC II antigen presentation pathway, HLA-DM (DM) in acidic endosomal vesicles removes the self-peptides and grants a peptide receptive conformation to MHC II. Mutating of an intracellular sorting motif in DM, renders its accumulation on cell surface. We hypothesized that the mutant DM (DMY) is functional on cell surface and can generate peptide receptive MHC II on surface of DCs for exogenous peptide loading. By using an adenoviral vector that expresses DMY, we found that DMY is functional on surface of DCs. DMY supplied peptide receptive MHC II on surface of DCs and improved exogenous peptide loading. The improvement of peptide loading by DMY is both quantitative and qualitative. DMY improves helper T cell (Th) response in Th1 direction that favors anti-cancer immunity. The qualitative improvement of peptide loading extends to loading of superior conformational isomer (conformer) of peptide-MHC complexes. This superior conformer (type A) is the favourite type for vaccination approaches and DMY successfully edits peptide-MHC conformers on cell surface level by eliminating undesirable one (type B). Function of DM is regulated by HLA-DO (DO) and it is well accepted that in acidic pH of late endosomes, DO inhibits function of DM by preventing removal of class II associated invariant chain peptide (CLIP) from peptide binding groove of MHC II. My results indicate that DO overexpression, changes binding of peptide-dependent superantigens to MHC II molecules. Superantigens (SAgs) are small microbial proteins that bind out side peptide binding groove of MHC II. DO probably enhances binding of peptide-dependent SAgs by forcing the accumulation of CLIP on the cell surface of antigen presenting cells. DO also neutralizes Th2 polarization by CLIP. Collectively, these results indicate that DMY is a valuable tool for improvement of exogenous peptide loading in DCs vaccines. An unnoticed effect of DO on SAgs binding was also recognized. Further investigations are needed to clarify the mechanisms by which, DMY and DO influence Th polarization. This would provide a better understanding of antigen presentation pathway and its interaction with immune system.

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