Pseudomonas aeruginosa est un agent pathogène opportuniste ubiquitaire. Les souches LES (Liverpool Epidemic Strain), associées à des infections pulmonaires chroniques, ont initialement été isolées en 1988 des expectorations de patients souffrant de fibrose kystique. Leurs nombreux facteurs de virulence, comme l'importante production de biofilm, rendent ces bactéries particulièrement difficiles à éradiquer. Des mutants de la souche LESB58, une souche LES, ont été obtenus grâce à la mutagenèse par étiquette. Trois mutants sélectionnés suite à leur avirulence chez le rat, l'amibe et la drosophile ont été obtenus: L70T18G, L138T21T et L155T7T. L'objectif de cette maîtrise est d'établir un lien entre la perte de virulence et les gènes mutés via l'analyse phénotypique des mutants. Une caractérisation des mutants a été réalisée par analyse du biofilm en microfluidique, des tests de détection des lipases, de pigmentation et de prédation en utilisant l'amibe. L'effet de l'ion magnésium (Mg²⁺) sur certains facteurs de virulence a également été mesuré. En microfluidique, la morphologie générale du biofilm attaché varie peu d'une souche à l'autre. L155T7T ne semble pas être capable de produire du biofilm en condition de microfluidique tandis que L138T21T s'établit plus rapidement que la souche sauvage. Un défaut de pigmentation chez la souche L138T21T est observable sur les différents milieux utilisés. Les mutants ne semblent pas présenter de défaut au niveau de leur sécrétion de lipases. De plus, suite à l'ajout de l'ion Mg²⁺, L70T18G, voit sa résistance à la prédation amibienne augmenter tandis que la souche sauvage perd de sa résistance. Chaque mutant présente un profil phénotypique distinct qui suggère que la virulence de la souche LESB58 est une combinaison de différents facteurs. Pour compléter la caractérisation et mieux jauger l'importance relative des différents facteurs de virulence, il serait intéressant d'effectuer d'autres tests comme l'ajout d'ions en microfluidique. / Pseudomonas aeruginosa is a ubiquitous opportunistic pathogen. The LES (Liverpool Epidemic Strain) strains, associated with chronic pulmonary infections, were initially isolated in 1988 from the sputum of patients suffering from cystic fibrosis. Their many virulence factors, such as the high production of biofilm, make these bacteria particularly difficult to eradicate. Mutants of the LESB58 strain, a LES strain, were obtained by signature-tagged mutagenesis. Three mutants selected for their avirulence in rats, amoeba and drosophila were obtained: L70T18G, L138T21T and L155T7T. In order to establish a link between these genes and the loss of virulence of the corresponding mutants, a phenotypic analysis of the mutants constitutes the objective of this project. Characterization of the mutants was performed by microfluidic biofilm analysis as well as lipase detection, pigmentation and amoeba-based predation tests. The effect of the magnesium ion (Mg²⁺) on some virulence factors was also measured. In microfluidics, the general morphology of the attached biofilm slightly varies from one strain to another. L155T7T does not appear to be able to produce biofilm under microfluidic conditions while L138T21T establishes a biofilm faster than the wild strain inside the channels. A pigmentation defect in the L138T21T strain is observable on the various media used. The mutants do not seem to present any defect in their secretion of lipases. Moreover, following the addition of the Mg²⁺ ion, L70T18G sees its resistance to predation by amoebae increased while the wild strain loses resistance. Each mutant exhibits a distinct phenotypic profile which suggests that the virulence of strain LESB58 is a combination of different factors. To complete the characterization and better gauge the relative importance of the different virulence factors, it would be interesting to perform othertests such as the addition of ions in microfluidics.

Titre de l'écran-titre (visionné le 25 septembre 2023) / Les infections causées par des pathogènes fongiques sont un problème de santé publique inquiétant. Le taux de mortalité des patients avec une infection fongique invasive dépasse souvent 50%, et ce, même s'ils sont traités. Des études ont estimé que plus de décès sont causés chaque année par les maladies fongiques que par la tuberculose et la malaria. Malgré cela, les infections fongiques ont été très peu étudiées comparativement aux autres types de maladies infectieuses. Les antifongiques tels que les azoles sont essentiels pour traiter les mycoses. Cependant, l'évolution de la résistance met en péril notre capacité à traiter les patients infectés. Plusieurs mutations dans la cible moléculaire des azoles, Erg11, sont connues pour conférer la résistance. Pourtant, nos connaissances actuelles ne sont pas suffisantes pour être utilisées en clinique afin d'assister le choix de traitement et pour aider à développer de nouveaux médicaments. Nous avons construit un système pour étudier des variants d'ERG11 de pathogènes fongiques comme Candida albicans dans la levure modèle Saccharomyces cerevisiae. Nous avons remplacé le promoteur natif d'ERG11 de S. cerevisiae (ScERG11) avec un promoteur répressible à la doxycycline afin de supprimer l'expression du gène. Nous avons confirmé qu'ERG11 de C. albicans (CaERG11) complémente la fonction de ScERG11. Nous montrons également que des mutations de résistance telles que G464S dans CaERG11 peuvent être reconstituées dans notre système. De plus, en utilisant une approche de type Deep Mutational Scanning, nous avons construit une librairie exhaustive de CaERG11 comprenant presque 8000 mutants. Finalement, nous avons utilisé notre système pour caractériser des mutations dans CaERG11. Nous avons découvert de nouvelles mutations de résistance au fluconazole tout en décrivant des mutations déjà reportées dans la littérature. Ultimement, nous caractériserons systématiquement les mutations dans CaERG11 qui confèrent la résistance aux azoles et évaluerons leur impact sur la fonction de la protéine. / Infections caused by fungal pathogens are a concerning public health problem. The mortality rate of patients with an invasive fungal infection often exceeds 50%, even when they are treated. Studies estimated that more than 1.7 million deaths are caused by fungal disease each year, which is more than tuberculosis or malaria. Despite this, fungal infections have been understudied in comparison to other types of infectious diseases. Antifungals such as azoles are crucial medications to treat mycosis. However, the evolution of resistance to these molecules jeopardizes our ability to treat infected patients. Many mutations in the azole target Erg11 are known to confer resistance. Yet, our current knowledge is not sufficient to be used in clinics to assist the choice of treatment and to help in the development of new drugs. We built a system to study ERG11 variants of fungal pathogens like Candida albicans in the model yeast Saccharomyces cerevisiae. We replaced the native ERG11 promoter of S. cerevisiae (ScERG11) with a doxycycline repressible promoter to suppress the expression of the gene. We confirmed that ERG11 of C. albicans (CaERG11) complements the function of ScERG11. We also show that the resistance phenotypes due to mutations such as G464S in CaERG11 can be reconstituted in our system. Furthermore, using a Deep Mutational Scanning approach, we constructed an exhaustive library of nearly 8000 variants in CaERG11 and validated its completeness by high throughput sequencing. Finally, we confirmed that our system can be used to characterize azole resistance mutations. We screened the CaERG11 library with fluconazole and isolated resistant variants. We discovered new resistance mutations while describing mutants already reported in the literature. Ultimately, our system will be used to systematically characterize azole resistance mutations in ERG11 and to evaluate the impact of mutations on the protein function.

Septoria musiva (téléomorphe Mycosphaerella populorum) est un Ascomycète responsable de chancres sur tronc et jeunes branches en peupleraies et de taches foliaires en peupleraies et forêts. S. populicola (M. populicola) est responsable de taches foliaires sur peupliers. L’objectif de mon projet consiste à mettre en place un système de transformation à l’aide d’Agrobacterium tumefaciens pour ces deux champignons. A. tumefaciens est la bactérie causant la galle du collet, mais qui est utilisée couramment lors de transformation de végétaux et de champignons. Une première expérience a permis d’obtenir des transformants pour S. musiva avec le plasmide pPT1, mais aucun transformant n’a été obtenu pour S. populicola. Par la suite, un autre plasmide a été utilisé : pPL1. Cependant aucune souche transformée n’a pu être obtenue pour S. musiva, et S. populicola, malgré la vérification de différents paramètres. L’absence de transformant chez S. populicola peut être attribuée à un nombre insuffisant de conidies, tandis que pour S. musiva, un nombre insuffisant de bactéries ou un protocole de transformation non optimal pourrait expliquer les échecs successifs. / Seporia musiva (Mycosphaerella populorum) is an Ascomycota which causes canker and leafspot on hybrid poplar. S. populicola (M. populicola) only causes leafspot. The aim of my project was to transform these two fungi with Agrobacterium tumefaciens, a bacterium which causes Crown gall, and is commonly used to transform plant and fungi in laboratory. In a first experiment, transformation using plasmid pPT1 were successful for S. musiva, but not for S. populicola. However, no transformants were obtained from either S. musiva and S. populicola in subsequent experiments in which plasmid pPL1 was used and different parameters were tested. A possible explanation for the inhability to obtain transformants from S. populicola is the low number of conidia available for transformation experiments. In the case of S. musiva, low number of bacterial cells and non optimal protocols might explain negative results observed.

La résistance du virus de l’herpès simplex (VHS) aux antiviraux est un problème courant chez les individus immunosupprimés. Des mutations au sein du gène de la thymidine kinase (TK) virale sont principalement à l’origine de la résistance au traitement de première ligne, i.e. les analogues des nucléosides. La cible ultime de tous les antiviraux anti-herpétique demeure cependant l’ADN polymérase (pol) virale. Ces deux gènes viraux (TK et ADN pol) démontrent un certain degré de polymorphisme génétique et il peut devenir difficile d’identifier avec certitude les mutations responsables de la résistance aux antiviraux. Les travaux présentés dans cette thèse de Doctorat démontrent le développement de nouvelles méthodes afin d’établir un lien entre l’apparition de mutations au niveau de gênes viraux et un phénotype de résistance particulier. Un système d’expression du gène de la TK virale chez le parasite Leishmania et un ensemble de cosmides et de plasmides recombinants permettant de générer des virus ADN pol mutants ont été mis au point. Ces nouvelles stratégies nous ont permis de caractériser les mutations virales impliquées dans la résistance aux antiviraux. / Drug resistant HSV isolates are responsible form substantial morbidity among immunocompromised subjects. The genetic basis for resistance to nucleoside analogs such as acyclovir (ACV) have been mapped to point mutations in the viral thymidine kinase (TK) gene while mutations within the viral DNA pol gene, the main target for all anti-herpetic drug actually available, could lead to a multidrug resistance phenotype. However, the distinction between viral mutations (TK and DNA pol) involved in antiviral resistance or part of viral polymorphism can be difficult to evaluate with current methodologies. OBJECTIVE: The aim of this research project is thus to evaluate the role of particular mutations within the HSV TK and DNA pol gene with regard to drug-resistance patterns and viral fitness, by designing new gene expression systems. METHODS: The protozoan parasite Leishmania stably transfected with a TK expression vector (pSP72αNEOα) was used as an heterologous system to evaluate the role of several different point mutations within the coding region of the TK gene in conferring resistance to nucleoside analogs. Susceptibility of TK-expressing parasites to nucleoside analogs can thus be tested very easily by a simple measurement of the optic density of cultures grown in the presence or in the absence of the drug. Finally, a set of overlapping viral cosmids and plasmids for the rapid generation of recombinant HSV-1 DNA pol mutants have been developed. RESULTS: Expression of the TK gene from ACV-susceptible clinical isolates resulted in Leishmania susceptibility to the antiviral, whereas expression of a TK gene with frameshift mutations or nucleotide substitutions from ACV-resistant isolates gave rise to parasites with high levels of antiviral resistance. Twenty HSV-1 recombinants with single or dual mutations within the DNA pol gene were successfully generated with the cosmid/plasmid based approach. Mutations within the central part of the enzyme’s catalytic domain (regions II and VI) were associated with resistance to ACV, FOS, and ADV, whereas mutations inserted within extremities (δ-region C, I, V, and VII) were mostly related to the replicative activity of the enzyme. CONCLUSION: Such new strategies provide an easy, reliable, and sensitive means of evaluating the functional role of viral mutations which should translate in improved management of drug-resistant HSV infections.