Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-06-14T11:23:47Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 947659 bytes, checksum: e40a84800499bceebcf0b0b2051d2265 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-14T11:23:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 947659 bytes, checksum: e40a84800499bceebcf0b0b2051d2265 (MD5) Previous issue date: 2007-07-17 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Geminivírus constituem um grupo de vírus com genoma composto de DNA de fita simples que se replicam no núcleo de células do hospedeiro através de um intermediário dupla fita, podendo ser constituídos por um genoma mono ou bi-segmentado. O transporte do DNA viral do núcleo para o citoplasma de geminivírus bi-segmentados requer a proteína viral designada NSP, Nuclear Shuttle Protein (BV1). A localização de NSP e seu papel proposto no movimento célula-a-célula do DNA viral predizem que podem ocorrer interações com fatores do hospedeiro tanto no citoplasma quanto no núcleo. Inicialmente foi demonstrado que a proteína NSP de geminivírus que infecta Arabidopsis Cabbage leaf Curl Virus (CaLCuV) interage com receptores cinase (RLK) contendo repetições ricas em leucina (LRR) designadas NIK (NSP-Interacting Kinase). A interação NSP-NIK foi mapeada em NIK1 e ocorre através de uma região de 81 resíduos de aminoácidos do domínio cinase (aa 422-502) que compreende o potencial sítio ativo ser/tre cinase (subdomínio VIbHrDvKssNxLLD) e a alça de ativação (subdomínio VII-DFGAk/rx, mais subdomínio VIII GtxGyiaPEY). A proteína comportou-se como um autêntico receptor cinase, sofrendo autofosforilação in vitro. Sendo, entretanto, a atividade cinase inibida pela proteína NSP. A fim de analisar o papel biológico da interação NSP-NIK, ensaios de infecção foram realizados em plantas contendo alelos nulos para o gene NIK1. Estes resultados demonstraram que a inativação dos alelos NIK1 e NIK3 aumentou a suscetibilidade à infecção causada pelo CaLCuV. Dada a sobreposição do domínio de interação com NSP com domínios regulatórios, foram realizados estudos bioquímicos através de mutagênese sítio dirigida em NIK1. A fim de mapear os sítios envolvidos na ativação da fosforilação de NIK1, o resíduo Thr-474 na alça de ativação foi substituído para resíduos de Ala, Asp ou Glu. Além disso, os resíduos Thr-468, Thr-469 e Ser-465 foram trocados por Ala. Foi demonstrado que a proteína receptora NIK1 exibe um padrão complexo de sítios de fosforilação, que agem independentemente em reações de transfosforilação e fosforilação de substratos. O resíduo de Thr-474 possui um papel central na ativação da proteína cinase, uma vez que os mutantes T474A e T474E apresentaram baixas atividades de auto e fosforilação do substrato. Similarmente, substituição do resíduo Gly-473 por Val juntamente com substituição de Thr-474 por Ala aboliu a autofosforilação e a fosforilação do substrato, sugerindo que, esta mutação acarreta modificações estruturais da alça de ativação que promovem impedimentos estéricos. Em contraste, a substituição dos resíduos Thr-469 e Ser465 por alaninas não causou impacto acentuado na autofosforilação, mas aumentou a atividade de fosforilação do substrato. Provavelmente, fosforilação desses resíduos provocam um efeito inibitório na atividade cinase. Além disso, foram conduzidos experimentos de complementação em A. thaliana nocautes para NIK. Complementação de NIK1 restaurou o fenótipo selvagem com a diminuição da suscetibilidade ao vírus. Em contraste, a expressão de NIK1 mutante com o domínio cinase inativo não reverteu o fenótipo do nocaute nik1, mantendo a elevada taxa de infecção. Estes resultados suportam o argumento de que o domínio cinase de NIK1 medeia uma via de sinalização que culmina em uma resposta de defesa. / Geminiviruses are small, single-stranded DNA viruses that replicate through doublestranded DNA intermediates in the nuclei of their plant hosts and can be mono or bipartite. The transport of bipartite viral DNA from the nucleus to the cytoplasm requires the viral protein NSP, and the nuclear shuttle protein NSP (BV1), both required for systemic infection. The localization of NSP and its proposed role in cell-to-cell movement of the viral DNA predict that interactions with host factors may occur in both the cytoplasm and the nucleus. Initially we have demonstrated that the NSP from an Arabidopsis-infecting geminivirus, Cabbage leaf Curl Virus (CaLCuV) interacts with a leucine rich repeat (LRR) receptor like kinases (RLK) designated NIK (NSP-Interacting Kinase). The NSP-NIK interaction occurs in NIK1 through an 81 amino acid region of the kinase domain (aa 422502) that encompasses the putative active site for ser/thr kinases (sub-domain VIbHrDvKssNxLLD) and the activation loop (sub-domain VII-DFGAk/rx, plus subdomain VIII -GtxGyiaPEY).The protein behaved like authentic receptor kinase undergo autophosphorylation in vitro. However, NSP protein inhibits the kinase activity. To unravel the biological significance of the NSP-NIK interaction we have selected nik null alleles for infection assays. Inactivation of NIK1 and NIK3 alleles enhanced the susceptibility to geminivirus infection. Given the overlap of the NSP-interacting domain with regulatory domains for kinase activity, we focused on site-directed mutagenesis studies on NIK1 To map the phosphorylation sites involved in activation of NIK1, we have replaced Thr-474 in the activation loop by Ala, Asp or Glu residues, whereas Thr-468, Thr-469 and Ser 465 were replaced by Ala. We found that NIK1 exhibits a complex pattern of phosphorylation sites that function independently in auto- and in substrate phosphorylation. The Thr-474 residue seems to play a pivotal role in the activation of the kinase protein, since the mutants T474A and T474E exhibited low auto- and substrate phosphorylation activities. Furthermore, the replacement of Gly-473 by Val in addition to Thr-474 by Ala abolished autophosphorylation and phosphorylation of substrate, sugesting that this mutation promotes a structural rearrangement of the A-loop that compromises activity. In contrast, the replacement of Thr469 and Ser-465 for alanines did not impact autophosphorylation significantly, but increased substrate phosphorylation activity. Possibly the phosphorylation of these residues impairs the kinase activity. In addition, we conducted complementation experiments in the nik1 genetic background. NIK1 expression in nik1 complemented the mutant and restored the wild type phenotype, with decreased virus susceptibility. In contrast, an inactive kinase domaincontaining NIK1 mutant did not reverse the enhanced susceptibility phenotype of the knockout lines and kept a high infection rate. These results are consistent with a model in which the kinase domain of NIK mediates a signaling pathway that culminates in antiviral defense.