La bactérie Clostridium difficile est maintenant considérée comme un pathogène majeur responsable d'infections nosocomiales en Amérique du Nord et en Europe. De plus, l'émergence de souches hypervirulentes, telle la souche NAP1/027 responsable de récentes épidémies, est un phénomène inquiétant. Un enjeu crucial au cours des prochaines années sera de mieux comprendre les mécanismes de virulence et d'évolution de C. difficile. Les bactériophages (c.-à-d. des virus bactériens, ou phages) sont des joueurs clés dans l'évolution de la plupart des bactéries, pathogènes ou non. Les données concernant l'impact des phages sur C. difficile sont très limitées. Par contre, deux études récentes démontrent que les phages semblent influencer la virulence de C. difficile en altérant la production de toxines TcdA et TcdB. L'objectif de mes travaux de recherche est donc d'étudier au niveau microbiologique et moléculaire les phages de C. difficile et de démontrer leur impact sur l'évolution et la virulence de ce pathogène. Dans ce contexte, plusieurs phages ont été induits à partir d'isolats cliniques de C. difficile. Dans cette collection, un phage en particulier, le (pCD38-2, a été choisi pour la caractérisation subséquente dû à sa divergence génomique par rapport aux autres phages et à sa capacité d'infecter la grande majorité des souches ayant le ribotype hypervirulent (027). Ces caractéristiques uniques ont justifié le séquençage complet de son génome. Par contre, aucun facteur de virulence évident n'a été identifié. À l'opposé, une analyse bio-informatique a permis l'identification d'une région spécifique comportant plusieurs gènes de conversion lysogénique potentiels. L'impact de ces gènes sur la virulence bactérienne reste à être déterminé. De plus, lorsqu'on introduit le phage cpCD38-2 dans la souche sensible CD274, on observe une accumulation plus rapide et plus grande des toxines après 48h dans le surnageant de la culture. Ce phénomène a été confirmé avec des tests ELISA sur des réplicas biologiques indépendants ainsi que par un immunodosage avec anticorps spécifiques aux deux toxines. Par ailleurs, une étude transcriptionelle par PCR en temps réel a permis de constater que le phage (pCD38-2 influence également l'expression des gènes tcdA et tcdB dans le temps. Par contre, l'effet du phage cpCD38-2 est variable lorsqu'on l'introduit dans d'autres souches de C. difficile. Donc, les résultats de nos travaux indiquent que certains phages auraient un impact sur la virulence de C. difficile en altérant la production et la transcription des gènes de toxines. Nos données laissent toutefois sous-entendre que cet effet peut varier selon les souches de C. difficile. [Symboles non conformes]

<p>U ovom radu su izolovani specifičn<em>i&nbsp; Bordetella bronchiseptica</em>&nbsp; bakteriofagi iz iz<br />priodne sredine koji pripadaju familiji&nbsp; <em>Siphoviridae</em>. Bakteriofagi su&nbsp; okarakterisani u<br />cilju razmatranja njihove uloge u lizogenoj konverziji bakterije i mogućnosti<br />primene u kontroli vrste&nbsp;<em> B. bronchiseptica</em>. U tu svrhu ispitivane su morfolo&scaron;ke<br />karakteristike odabranih faga, litički&nbsp; spektar faga, i karakteristike genoma i proteina<br />faga. Takođe, ispitivana je i stabilnost faga u različitim uslovima sredine, njihova<br />litička efikasnost i efekat na formiranje i vec formirani biofilm. U radu je ispitana i<br />uloga faga u produkciji biofilma,&nbsp; rezistenciji na antibiotike, procesu hemolize i<br />pokretljivosti kod vrste&nbsp; <em>B. bronchiseptica</em>.&nbsp; Rezultati ovog rada jasno ukazuju na<br />ulogu faga u lizogenoj konverziji vrste&nbsp;<em> B.&nbsp; bronchiseptica</em>&nbsp; kao&nbsp; i mogućnost njihove<br />primene, uz određene modifikacije, kao anti-<em>B.bronchiseptica</em> agenasa.</p> / <p>In this paper <em>Bordetella bronchiseptica</em> specific phages belonging to family <em>Siphoviridae</em> were isolated from environment. Bacteriophages were characterized to determine their role in the lysogenic conversion of bacteria and their possible usage in <em>B. bronchiseptica </em>control. For this purpose, morphological characteristics of the selected phages, the phage lytic spectrum, and the characteristics of phage genome and the proteins were examined. Also, the stability of phage in different environmental conditions was studied as well as their lytic efficiency, effect on the biofilm formation and formed biofilm. The paper also examined the role of phages in the production of biofilm, resistance to antibiotics, the process of hem olysis and the motility of<em> B. bronchiseptica </em>species. The results of this study clearly indicate the role of phage in lysogenic conversion in <em>B. bronchiseptica</em> as well as their potential for <em>B. bronchiseptica</em> control.</p>

Bacteriophage MooMoo is a temperate phage that was isolated and propagated on Mycobacterium smegmatis (M. smeg). It typically produces turbid plaques, however spontaneous clear plaque mutants can be readily isolated. Both turbid (MooMoo-T) and clear plaque (MooMoo-C) formers can establish stable lysogens, but the parental turbid plaque forming phage has a higher lysogenic frequency. The phage repressor protein typically plays the central role in regulating the lysis/lysogeny decision. Therefore, we expected that the mutation responsible for the clear plaque phenotype would be located in the repressor gene. Remarkably, whole genome sequencing detected a single base pair mutation in the minor tail protein gene (gp19). The regulatory role of the repressor protein could not be excluded considering it was unclear how the mutation in gp19 was leading to the altered plaque phenotype. To locate the phage repressor, we used bioinformatics to identify several candidate genes with helix-turn-helix and DNA binding motifs (gp42, gp43 and gp44). We also cloned the parental and mutant gp19 genes. Each candidate gene was cloned into a shuttle vector. The clones of gp43, gp44 and both derivatives of gp19 did not prevent MooMoo growth, whereas the clones of gp42 inhibited phage growth. Based on these results, we concluded that gp42 is the phage repressor for MooMoo. To determine if the presence of gp19 alters lysogenic frequency, lysogeny assays of wild-type (WT) and mutant gp19 clones were evaluated. Compared to the MooMoo-C lysate, the cloned copy of the mutant gp19 showed a slight increase in lysogeny efficiency. The lysogeny frequencies on strains that carry cloned copies of gp19 (WT or mutant) were similar to those obtained on strains that lacked the plasmids. From these results, we concluded, the presence of either parental or mutant gp19 clones does not affect the lysogeny frequency. To determine if host cell physiology was affected by lysogeny, carbon, nitrogen, phosphorus and sulfur utilization resources were screened using high-throughput phenotypic microarrays. From these results, we concluded the presence of the WT or mutant prophage had no significant effect on the utilization of the resources tested.