Les troubles musculo-squelettiques représentent la deuxième cause d'invalidité dans le monde et des millions de personnes subissent une fracture chaque année. Bien que la régénération osseuse soit un processus efficace permettant à l'os de récupérer sa structure et ses fonctions initiales, 10% des fractures ne guérissent pas correctement et peuvent entraîner un retard de régénération ou une non-consolidation osseuse. Le processus de régénération osseuse repose sur l'activation de cellules souches squelettiques (CSS), dont les origines et les mécanismes d'action sont encore mal caractérisés. De nombreuses études se sont concentrées sur les cellules stromales de la moelle osseuse (CSM) comme source principale de CSS pour le processus de régénération osseuse endogène et les thérapies cellulaires. Cependant, notre laboratoire et d'autres équipes ont récemment montré que le périoste est une source majeure de cellules qui contribuent à la formation de cartilage et d’os dans le cal alors que les CSM ont une contribution minimale et restreinte au compartiment de moelle osseuse pendant la régénération. Le but de ce projet est de caractériser les cellules souches squelettiques du périoste et comparer leur potentiel de régénération in vitro et in vivo avec les cellules stromales de la moelle osseuse. Nous avons mis au point des cultures primaires de cellules issues du périoste (CPs) et de la moelle (CSMs) de souris. Les CPs et les CSMs expriment des marqueurs communs et peuvent se différencier dans les trois lignages mésenchymateux (ostéoblastes, adipocytes et chondrocytes) in vitro. In vitro les CPs ont un potentiel clonogénique et une croissance cellulaire plus élevés que les CSMs. Malgré l’origine embryonnaire commune des CPs et CSMs, les CPs n’ont pas les mêmes fonctions aux stades postnatal et adulte. Après transplantation au site de fracture, les CPs ont un meilleur potentiel d’intégration au centre du cal dans le cartilage et l’os comparé aux CSMs. Les CPs persistent dans le cal à long terme et peuvent reconstituer un pool de CPs dans le périoste nouvellement formé après régénération, permettant d’être mobilisées à nouveau après des blessures successives. Par des analyses transcriptomiques des CPs et CSMs isolées avant et après fracture, nous avons caractérisé les profiles moléculaires des CPs et des CSMs et mis en évidence une réponse à la blessure plus importante chez les CPs. Le gène Periostin (Postn) et d’autres gènes codant pour des protéines de la matrice extracellulaire liées à Postn sont surexprimées dans les CPs activées par la fracture. L’expression de POSTN est détectée dans le périoste et dans le cal pendant tout le processus de régénération osseuse. Les souris invalidées pour Postn ont un phénotype de régénération osseuse anormale marqué par la formation de fibrose et une absence de consolidation osseuse. Ce phénotype est dû à une déficience du périoste et des CPs chez les souris Postn mutantes. En absence de Postn, le reconstitution du périoste et du pools de CPs à long terme est abolie entraînant une incapacité du périoste mutant à participer à la réparation osseuse après une seconde blessure. En conclusion, ce travail a mis en évidence que le périoste contient une population de CSS avec un potentiel de régénération élevé pour la réparation osseuse endogène comparé aux CSMs. Nous montrons que Périostine est une protéine clé du périoste, régulant la capacité des CPs à répondre aux blessures et permettant de maintenir l’intégrité du périoste et le pool de CPs à long terme. Le périoste et les cellules souches du périoste pourraient donc être une meilleure cible pour augmenter la régénération osseuse cliniquement. / Musculoskeletal disorders represent the second cause of disability worldwide. Among them, bone repair defects occur in 10% of patients that sustain a fracture causing delayed union or non-union. Bone regeneration is normally an efficient process allowing bone to recover its proper shape and functions, and relying on the activation of skeletal stem cells (SSCs), that are still poorly characterized. Numerous studies have concentrated on bone marrow stromal cells/skeletal stem cells (BMSCs) to understand the role of SSCs in bone regeneration and for cell-based therapies. Recently, our laboratory and others have shown that the periosteum is a major source of cells that contribute to cartilage and bone formation in the fracture callus while BMSC’s contribution to the endogenous repair process is minimal and restricted to the bone marrow compartment. Here, we aimed to characterize skeletal stem cells within periosteum and compare their in vitro and in vivo regenerative potential with BMSCs. We established primary cultures of periosteal cells (PCs) and BMSCs in mice and showed that PCs and BMSCs express similar markers by FACS and qRT-PCR and can differentiate into the three mesenchymal lineages (osteoblasts, adipocytes and chondrocytes) in vitro. We show that although PCs and BMSCs have common embryonic origins, PCs exhibit superior bone regenerative potential in mature bones with higher CFU-F activity, cell growth and migration capacity in vitro compared to BMSCs. By lineage tracing after transplantation at fracture sites in vivo, we show that PCs can better contribute to cartilage and bone and integrate long-term in the callus compared to BMSCs. Using a periosteum graft approach, we show that PCs can repopulate the periosteum after injury and are mobilized again after subsequent injuries to repair bone. Microarray analyses of PCs and BMSCs isolated from intact and injured tibias 3 days post fracture show an enhanced molecular response to injury of PCs. Periostin (Postn) and other genes encoding extracellular matrix (ECM) proteins linked to Postn were up-regulated in activated PCs. Postn expression was detected in the periosteum and the callus through all stages of bone regeneration and Postn deficient mice have impaired bone regeneration leading to fibrosis and non-union. This phenotype is due to a deficient periosteum and PCs as shown by in vitro and in vivo experiments. Moreover, the capacity of PCs to repopulate the newly formed periosteum and contribute to repair after a second injury is abolished in the absence of Periostin. In conclusion, this work shows that periosteum comprises SSCs with high bone regenerative potential for endogenous bone repair compared to BMSCs. We show that Periostin is a key ECM component of the periosteum regulating the ability of PCs to respond to injury, participate in skeletal repair and maintain the pool of PCs in the periosteum. SSCs within periosteum are therefore a promising target to augment bone regeneration clinically.

Treatments for skeletal tissue injuries include surgery and rehabilitation but in adult patients, the healing process is slow and incomplete, and the underlying biological mechanisms are largely unknown. Skeletal tissues contain stem cells responsible for their maintenance and repair, but the identity and location of these stem cells, and what molecular mechanisms regulate their fate decisions remain unclear. To design more effective regenerative therapies for skeletal conditions, understanding the fundamental biology of skeletal stem cells (SSC) in postnatal organisms is required. Our project aims at identifying and characterizing these SSC populations in postnatal murine and human tissues using lineage tracing techniques, combined with multicolor 3D confocal microscopy and computational image analysis, in vitro assays, and single cell transcriptomics. We hypothesized that the postnatal skeleton contains self-renewing and multipotent Sox9+ SSCs that persist in adulthood. We showed that the adult mouse skeleton contains Sox9+ cells self-renewing, multipotent skeletal stem cells (SSCs) with osteogenic and chondrogenic potential. They are located adjacent to the growth plates and in periosteum and persist in adulthood. Transcriptome analysis revealed that these cells express other putative SSCs markers, as well as genes involved in skeletal development, stem cell self-renewal, and fate decision. This data provides testable drug targets to pharmacologically manipulate SSCs fate decisions in situ. In addition, we showed that human tissues contain SSCs similar to murine tissues. This is the first experimental proof of self-renewal in postnatal Sox9+ SSCs in vivo. These findings provide actionable insights for the use of culture-expanded stem cell product for regenerative medicine product or pharmacological targeting of these stem cells in situ. We believe our data will help improve stem-cell based and tissue engineering therapies, increasing success rate of regenerative orthopaedic surgeries while reducing reoccurrence of injuries.