Tesis por compendio / [ES] Los pequeños ARNs artificiales (art-sRNAs) son moléculas de ARN de simple cadena, de 21 nucleótidos (nt), diseñados computacionalmente para silenciar genes de la planta con alta eficacia y especificidad. Los art-sRNAs se clasifican en dos grupos: micro ARNs artificiales (amiRNAs) y pequeños ARNs interferentes sintéticos que actúan en trans (syn-tasiRNAs). A pesar de que los art-sRNAs se usan frecuentemente para silenciar genes endógenos y exógenos en plantas, todavía hay algunos aspectos desconocidos que limitan sus aplicaciones. Uno de ellos es su capacidad de movimiento, dado que se desconoce si son capaces de moverse y silenciar genes endógenos en tejidos distintos a los de origen. Por tanto, el uso de art-sRNAs para inducir silenciamiento génico a nivel de toda la planta, habitualmente implica la generación de plantas transgénicas que expresen los precursores completos de art-sRNAs, limitando su versatilidad como herramienta biotecnológica para genómica funcional y mejora de cultivos. En esta tesis, hemos investigado en primer lugar la capacidad de silenciamiento sistémico de los art-sRNAs y, posteriormente, hemos diseñado precursores mínimos de art-sRNAs para facilitar su expresión no transgénica a partir de virus y en toda la planta. En primer lugar, estudiamos la capacidad de silenciamiento local y sistémico de art-sRNAs dirigidos contra la subunidad CHLI de la quelatasa de magnesio, codificada por el gen SULPHUR (NbSu), mediante ensayos de expresión transitoria en Nicotiana benthamiana. Tanto amiRNAs como syn-tasiRNAs indujeron el silenciamiento sistémico de NbSu, para lo cual se requieren altos niveles de expresión cerca del peciolo. Esta actividad sistémica está facilitada por el movimiento vascular de art-sRNAs de doble cadena y 21 nt a través de la planta, permitiendo silenciar genes en tejidos distintos a los de origen. Este resultado pone de manifiesto el potencial biotecnológico de expresar localmente art-sRNAs que sean capaces de moverse a tejidos distales de la planta y desencadenar un silenciamiento génico altamente específico. En segundo lugar, nos centramos en diseñar precursores de tamaño mínimo derivados de las moléculas precursoras endógenas de Arabidopsis thaliana (Arabidopsis): MIR390a (521 nt) y TAS1c (1011 nt). Evaluamos la eficacia de silenciamiento de una colección de construcciones que contenían versiones acortadas de los precursores AtMIR390a y AtTAS1c mediante expresión transitoria y estable en N. benthamiana y Arabidopsis, respectivamente. Observamos que, tanto amiRNAs como syn-tasiRNAs, son altamente eficientes y se procesan de forma precisa cuando se producen a partir de precursores mínimos de solo 89 y 54 nt respectivamente. Además, comprobamos que cuando se expresan a partir de un vector viral de ARN, como el virus X de la patata, solo se producen art-sRNAs auténticos a partir de precursores mínimos, y no de los de longitud completa, lo que da lugar al silenciamiento eficiente de genes endógenos en N. benthamiana. Asimismo, pudimos inducir silenciamiento génico mediante art-sRNAs expresados a partir de un virus, de forma no transgénica y escalable, mediante la pulverización sobre plantas de extractos infecciosos que contenían los vectores modificados. Estos resultados muestran que la longitud de los precursores de art-sRNAs puede ser acortada de forma significativa sin comprometer la eficacia del silenciamiento inducido, y que los precursores mínimos ofrecen una ventaja biotecnológica sobre los precursores de longitud completa cuando se expresan a partir de vectores virales. / [CA] Els xicotets ARNs artificials (art-sRNAs) són molècules d'ARN de simple cadena de 21 nucleòtids (nt), dissenyats computacionalment per a silenciar gens de plantes amb alta eficàcia i especificitat. Els art-sRNAs es classifiquen en dos tipus: microARNs artificials (amiRNAs) i xicotets ARNs interferents sintètics que actuen en trans (syn-tasiRNAs). Encara que els art-sRNAs són àmpliament utilitzats per a silenciar tant gens endògens com exògens en plantes, hi ha alguns aspectes desconeguts que limiten les seues aplicacions. Un d'ells és la seua capacitat de moviment, ja que encara no s¿ha establit si poden desplaçar-se i silenciar gens endògens en teixits diferents del d'origen. Conseqüentment, aconseguir un silenciament gènic en tota la planta mediat per art-sRNAs normalment requereix la producció de plantes transgènices que expressen els precursors complets dels art-sRNAs, la qual cosa restringeix el seu ús versàtil com a eina biotecnològica per a la genòmica funcional i la millora de cultius. En aquesta tesi, primer vam investigar la capacitat de silenciament sistèmic dels art-sRNAs, i després vam dissenyar precursors mínims d'art-sRNAs per a facilitar la seua aplicació de manera no transgènica a tota la planta, expressant els art-sRNAs a partir de vectors virals. Primer, vam estudiar la capacitat de silenciament local i sistèmic dels art-sRNAs, dirigits contra el gen SULPHUR (NbSu) ,que codifica per a una subunitat de la quelatasa de magnesi, assajada en Nicotiana benthamiana mitjançant l'expressió transitòria. Tant amiRNAs com syn-tasiRNAs van produir silenciament sistèmic de NbSu, amb una alta expressió d'art-sRNAs prop del pecíol de la fulla. El moviment vascular dels dúplexs d'art-sRNAs de 21 nt va facilitar aquesta activitat sistèmica a través de la planta, permetent el silenciament d'aquest gen en teixits distals als quals els art-sRNAs han sigut produïts. Aquest resultat destaca el gran potencial biotecnològic dels art-sRNAs expressats localment, capaços de moure's a grans distancies i amb molta especificitat, desencadenant el silenciament gènic a tota la planta. En segon lloc, ens vam centrar en dissenyar precursors d'amiRNAs i syn-tasiRNAs del mínim tamany possible, derivats dels precursors endògens MIR390a (521 nt) i TAS1c (1011 nt) d' Arabidopsis thaliana, respectivament. Vam avaluar l'eficàcia de silenciament d'una col·lecció de construccions que incloïen les versions acurtades dels precursors AtMIR390a i AtTAS1c, fent servir expressió transitòria en N.benthamiana i expressió estable en A. thaliana. Vam trobar que es poden produir amiRNAs i syn-tasiRNAs altament efectius i correctament processats a partir de precursors mínims de només 89 i 54 nt respectivament. A més, vam observar que art-sRNAs autèntics es produeixen a partir dels precursors mínims i no utilitzant els precursors complets quan s'expressen des d'un vector viral basat en ARN, com el virus X de la creïlla, resultant en un silenciament eficient de gens endògens de N. benthamina. A més, el silenciament de gens mediat per art-sRNAs expressats a partir d'un vector viral es va a aconseguir amb èxit sense l'ús de transgènics i d'una manera escalable, utilitzant un esprai amb extractes crus infecciosos que contenen els vectors virals modificats. Aquests resultats manifesten que la longitud dels precursors d'art-sRNAs pot ser reduïda significantment sense comprometre l'eficàcia de silenciament, i que aquests precursors mínims ofereixen un avantatge biotecnològic sobre els precursors complets quan s'expressen a partir de vectors virals. / [EN] Artificial small RNAs (art-sRNAs) are 21-nucleotide (nt) single-stranded RNA molecules computationally designed to silence genes with high efficacy and specificity. Art-sRNAs are classified into two main types: artificial microRNAs (amiRNAs) and synthetic trans-acting small interfering RNAs (syn-tasiRNAs). Although art-sRNAs are widely used to silence both endogenous and exogenous plant genes, there are still some unknown aspects limiting their applications. One of them is their movement capacity, since it has not been established whether they can move and silence endogenous genes in tissues other than where they are originally expressed. Consequently, achieving whole-plant gene silencing mediated by art-sRNAs, typically requires the generation of transgenic plants expressing full-length art-sRNA precursors, restricting their use as versatile biotechnological tools for functional genomics and crop improvement. In this thesis, we first investigated the systemic silencing capacity of art-sRNAs, and then engineered minimal art-sRNA precursors to facilitate transgene-free, virus-based expression of art-sRNAs at the whole-plant level. Firstly, we studied the local and systemic silencing capacity of art-sRNAs targeting the magnesium chelatase subunit CHLI-encoding SULPHUR (NbSu) gene, using transient expression assays in Nicotiana benthamiana. Both amiRNAs and syn-tasiRNAs were found to induce systemic silencing of NbSu, which required high art-sRNA expression near the leaf petiole. This systemic activity was facilitated by the vascular movement of 21-nt art-sRNA duplexes throughout the plant, allowing the silencing of plant genes in tissues different from where art-sRNAs are produced. This result highlights the biotechnological potential of locally expressed art-sRNAs to move long distances and trigger highly specific gene silencing throughout the plant. Secondly, we focused on engineering amiRNA and syn-tasiRNA precursors of minimal size and derived from the endogenous Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) MIR390a (521 nt) and TAS1c (1011 nt) precursors, respectively. We evaluated the silencing efficacy of a collection of constructs containing shortened versions of the AtMIR390a and AtTAS1c precursors, through both transient and stable expression in N. benthamiana and Arabidopsis, respectively. We found that highly effective and accurately processed amiRNAs and syn-tasiRNAs can be produced from minimal precursors of only 89 and 54 nt, respectively. Moreover, we observed that authentic art-sRNAs are produced from minimal -but not from full-length precursors- when expressed from an RNA-based viral vector, such as potato virus X, resulting in efficient silencing of endogenous genes in N. benthamiana. Furthermore, virus-induced gene silencing mediated by art-sRNAs was successfully achieved in a transgene-free and scalable manner by spraying plants with infectious crude extracts containing the modified viral vectors. These results reveal that the length of art-sRNA precursors can be significantly shortened without compromising silencing efficacy, and that minimal precursors offer a biotechnological advantage over full-length precursors when expressed from viral vectors. / This work was supported by grants or fellowships from Ministerio de Ciencia y Universidades (MCU, Spain), Agencia Estatal de Investigación (AEI, Spain) and Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER, European Union) [RTI2018-095118-A-100, PID2021-122186OB-100 and RYC-2017-21648 to A.C., and PRE2019-088439 and PRE2022-102565 to A.E.C. and J.L.-G., respectively], NextGenerationEU/PRTR (European Union) [CNS2022-135107 to A.C.], from Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC, Spain) [JAEINT_21_00860 to A.P.-E.] and from European Commission [Erasmus+ Grant Agreement 2020-1-DE01-KA103-005653 to A.P. / González Cisneros, AE. (2024). Artificial Small RNAs in Plants: Characterization of Systemic Activity, and Engineering Minimal Precursors for Transgene-Free, Virus-Based Expression [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/213397 / Compendio