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Markierung von humanen mesenchymalen Stammzellen mit für die Magnet-Partikel-Spektroskopie geeigneten Eisenoxidnanopartikeln, Untersuchung des Zellverhaltens in dreidimensionaler Umgebung und nicht-invasive Analyse mittels Raman-Spektroskopie / Labeling of human mesenchymal stem cells using iron oxide nanoparticles which are traceable by magnetic particle spectroscopy, examination of cell behaviour in a 3D environment and non-invasive analysis using raman spectroscopyvon der Assen [geb. Weiß], Katrin Barbara January 2021 (has links) (PDF)
Stem cell research has already been challenged for years by the question how to design tissues or even whole organs in vitro. Human mesenchymal stem cells (hMSC) seem to be very promising for this task as they can be extracted in many cases directly from the recipient. Thus potential graft rejections are avoided. For further research on the behaviour of stem cells in vivo it is essential to be able to track them non-invasively. This is for example possible by Magnetic Particle Imaging (MPI). For this purpose stem cells have to be labelled with a suitable substance, for example with superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION). Presently there are no SPION approved by FDA or EMA that are able to enter hMSC without transfection agent (TA). Therefore the aim of this dissertation was to identify at least one SPION that possesses an optimal interaction with hMSC and can be tracked by MPI as well as by Raman-Spectroscopy. Furthermore the identified SPION should be detectable for a longer period of time and should not have any influence on hMSC. This dissertation was performed within the framework of the EU-wide `IDEA-project´. hMSC have been labelled with the iron oxide nanoparticles M4E, M4F, M4F2 and M3A-PDL in varying concentrations. For M3A-PDL and M4E examinations were done with concentrations of 0.5 mg/ml in standard cell culture as well as in a three-dimensional environment on a matrix of small intestinal submucosae (SIS-ser). Furthermore chondrogenic differentiation of M4E labelled hMSC was examined. Additionally Magnetic Particle Spectroscopy (MPS) and Raman-Spectroscopy were used as non-invasive detection systems. Histologically SPION uptake was proven by Prussian blue staining. Cell viability and proliferation were examined by Trypan blue staining and Ki67 antibody staining. In order to prove that also labelled cells proliferate, a special staining protocol combining Prussian blue and immunohistochemical stainings was established. The success of chondrogenic differentiation was histologically verified by Alcian blue staining, Aggrecan and Collagen II antibody staining. It could be demonstrated, that M4E has a very good cell-particle interaction when used for labelling hMSC. In contrast to M3A, which is only taken up into hMSC when covered by a TA, M4E can be used without TA.
Both particles do not influence cell viability or proliferation. M4F and M4F2 are not suitable to lable hMSC. SPION could be detected at least for four weeks after labelling in a three-dimensional environment which is significantly longer than the maximum detection time of two weeks in cell culture. Chondrogenic differentiation is influenced by cell labelling with 0.5 mg/ml M4E. M3A-PDL can be detected by MPS. Raman-Spectroscopy is suitable to differentiate between M3A-PDL labelled and unlabelled hMSC. This dissertation has been able to identify an iron oxide nanoparticle with an excellent cell-particle interaction that allows intense cell labelling without TA and can be detected by MPS. In further studies at the institute it could already be shown that Raman-Spectroscopy can differentiate also between
M4E labelled and unlabelled cells. However, chondrogenic differentiation of hMSC was inhibited in this dissertation. In literature several authors came to the conclusion that there is a dose-dependent inhibition of differentiation. Therefore further experiments are necessary to find out whether inhibition of differentiation might be less immanent when using smaller SPION concentrations. Additionally it should be evaluated if smaller SPION concentrations remain detectable by MPS for several weeks. Finally further studies should be done in testing systems that are more similar to the situation in vivo. Such systems are for example the dynamic environment of a BioVaSc-TERM®. This is important to make better predictions of the behaviour of labelled hMSC in vivo. / Die Stammzellforschung beschäftigt sich bereits seit Jahren mit der Frage, wie Gewebe oder sogar Organe im Labor hergestellt werden können. Als besonders vielversprechend erscheinen hierfür humane Mesenchymale Stammzellen (hMSC), da diese in vielen Fällen direkt vom Empfänger gewonnen werden können und so keine Organ- oder Gewebeabstoßung durch Abwehrreaktionen zu erwarten ist. Für die weitere Erforschung des Verhaltens von Stammzellen in vivo ist es notwendig, diese nicht-invasiv darstellen zu können. Dies ist zum Beispiel mittels Magnetischer Partikel Bildgebung (MPI) möglich. Hierfür müssen die Stammzellen mit einer geeigneten Substanz markiert werden. Eine solche sind beispielsweise superparamagnetische Eisenoxidnanopartikel (SPION). Derzeit gibt es keine von den medizinischen Zulassungsbehörden zugelassenen SPION die ohne TA in hMSC aufgenommen werden. In der hier vorliegenden Arbeit sollte also im Rahmen des
EU-weiten „IDEA-Projekts“ ein geeigneter SPION identifiziert werden, der eine optimale Zell-Partikel-Interaktion aufweist und sowohl mittels MPI als auch mit Raman-Spektroskopie nachweisbar ist. Zudem sollte die Nachweisbarkeit des SPION über einen längeren Zeitraum gegeben und kein Einfluss auf die hMSC feststellbar sein. Es wurden hMSC mit den Eisenoxidnanopartikeln M4E, M4F, M4F2 und M3A-PDL in unterschiedlichen Konzentrationen markiert. Für M3A-PDL und M4E erfolgten bei einer Konzentration von 0,5 mg/ml Untersuchungen in Zellkultur sowie auf SIS-ser als Matrix im 3D-Modell. Desweiteren wurde das Differenzierungsverhalten der mit M4E markierten hMSC bei chondrogener Differenzierung untersucht. Außerdem kamen Magnetische Partikel Spektroskopie (MPS) und Raman-Spektroskopie als nicht-invasive Nachweisverfahren zum Einsatz. Der SPION-Nachweis erfolgte histologisch mittels Berliner Blau Färbung. Untersuchungen zu Zellviabilität und Proliferation erfolgten durch Trypanblau sowie Ki67-Antikörper-Färbung. Um Nachzuweisen ob auch markierte Zellen proliferieren wurde eigens ein kombiniertes Färbeprotokoll zur Kombination von Berliner Blau und immunhistochemischer Färbung
etabliert. Der Erfolg der chrondrogenen Differenzierung wurde mittels Alcianblau, Aggrecan- und Kollagen-II-Antikörper Färbung überprüft. Es konnte gezeigt werden, dass M4E bei der Markierung von hMSC eine sehr gute Zell-Partikel-Interaktion aufweist und im Gegensatz zu M3A auch ohne TA in die Zellen aufgenommen wird. Durch beide Partikel werden Zellviabilität und Proliferation nicht beeinflusst. M4F sowie M4F2 ist zur Markierung nicht geeignet. Die Markierung ließ sich im 3D-Modell mit vier Wochen deutlich länger nachweisen als in 2D Zellkultur mit maximal zwei Wochen. Die chondrogene Differenzierung wird durch die Markierung mit 0,5 mg/ml M4E beeinflusst. M3A-PDL sind durch MPS nachweisbar. Die Raman-Spektroskopie eignet sich zur Differenzierung zwischen mit M3A-PDL markierten und unmarkierten hMSC. Es ist im Rahmen dieser Arbeit gelungen, einen
Eisenoxidnanopartikel mit hervorragender Zell-Partikel-Interaktion zu identifizieren, der ohne zusätzliches TA eine intensive Markierung der hMSC ermöglicht und mit MPS nachweisbar ist. Für M4E konnte in weiteren Arbeiten am Institut bereits gezeigt werden, dass auch eine Differenzierung zwischen markierten und unmarkierten Zellen mittels Raman-Spektroskopie möglich ist. Die chondrogene Differenzierung der hMSC wurde in der vorliegenden Arbeit allerdings beeinträchtigt. In der Literatur finden sich Hinweise auf eine dosisabhängige Inhibition der Differenzierung. Es sind daher weitere Versuche notwendig, um herauszufinden, ob die Inhibition der Differenzierung möglicherweise bei geringerer SPION-Konzentration weniger ausgeprägt ist. Zudem sollte untersucht werden, ob auch geringere Konzentrationen in den Zellen über mehrere Wochen mittels MPS nachweisbar bleiben. Desweiteren sollten Untersuchungen in, der in vivo Situation ähnlicheren,
Systemen, wie dem dynamischen Umfeld einer BioVaSc-TERM® durchgeführt werden um bessere Vorhersagen zum Verhalten markierter hMSC in vivo treffen zu können.
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Bioethik-Kommissionen in Deutschland : ein Überblick / Commissions on bioethics in GermanyKrippner, Bernd, Pollmann, Arnd January 2004 (has links)
Im ersten Abschnitt dieses Artikels wird ein knapper Überblick über das Spektrum der in Deutschland eingerichteten Bioethik-Kommissionen gegeben. Damit die unterschiedlichen institutionellen Anbindungsmöglichkeiten deutlich werden, muß zwischen einer "lokalen", einer "föderalen" und einer "nationalen" Institutionalisierungsebene differenziert werden (I). Im zweiten Schritt sollen einige wichtige Kriterien zur Unterscheidung verschiedener Kommissionstypen kenntlich werden. Hier werden vor allem die drei Aspekte "politische Legitimation", "personelle Zusammensetzung" und "zeitliche Ausrichtung" zentral sein (II). Im Schlußabschnitt werden zunächst die wichtigsten Kritikpunkte rekapituliert, die in der einschlägigen Literatur zum Thema diskutiert werden. Am Ende soll dann kurz zur Andeutung kommen, wie den Bedenken gegen eine wachsende "Kommissionierung" bzw. Institutionalisierung biopolitischer Diskussionsprozesse zu begegnen wäre (III).
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