The incidence of melanoma and non‐melanoma skin cancer is continuing to increase worldwide. Melanoma is the sixth most common cancer in the United States, making skin cancer a significant public health issue. Photo chemoprevention with natural products is an effective strategy for the control of cutaneous neoplastic. Polyphenols from fruits have been shown to protect the skin from the adverse effects of solar UVR, cancer, and the growth of cancer stem cells. In particular, blueberries are known for their high concentration of phenolic compounds that have the high antioxidant capacity, and their effectiveness in reducing UV damage and, therefore, skin cancer. In Matar's lab, we have shown that Polyphenol-Enriched Blueberry Preparation (PEBP), derived from biotransformation of blueberry juice through fermentation, is effective for targeting skin cancer stem cell proliferation in different skin cancer cell lines. We predicted that PEBP affects melanoma skin cancer stem cells (MCSCs) epigenetically by targeting miRNA pathways. We observed the effects of PEBP on sphere growth and cell motility in vitro. We performed RT2-qPCR analyses to determine PEBP influence on miRNA in B16F10 spheres. We transfected B16F10 cells with miR-200b and performed western blotting analyses. Our results demonstrated that PEBP reduced sphere growth and cell migration, and up regulated miR-200b expression in different biological settings. Inhibition of miR-200b increased Zinc Finger E-Box Binding Homeobox 1 (ZEB1) expression. Consequently, PEBP may influence MCSCs through miRNA pathways. Elucidating the mechanisms by which PEBP modulates CSCs biological behavior by controlling miRNAs will enhance our understanding of the molecular mechanisms in skin cancer chemoprevention and might result in their use as natural photo-protectants in skin cancer.

Introdução: A resistência do câncer de mama (CM) ao tratamento quimio/radioterápico convencional ainda representa um grande desafio, especialmente em carcinomas triplonegativos, os quais não expressam receptores de estrógeno, receptores de progesterona e oncogene (HER2)/neu. Sabe-se que o grau de resistência do CM está fortemente associado à quantidade de células-tronco tumorais (CTTs), as quais podem ser detectadas por imunofenotipagem (CD24-/CD44+). As CTTs são quiescentes e apresentam inibição de vias pró- apoptóticas. Vários compostos naturais apresentam atividade antitumoral, dentre os quais o fitoestrógeno da soja genisteína (GEN) destaca-se como amplo inibidor de tirosino-quinases. Contudo os efeitos biológicos da GEN quanto à presença de CTTs ainda são pouco conhecidos, especialmente quando associada a outros quimioterápicos. Objetivos: Avaliar os efeitos citotóxicos do fitoestrógeno GEN em populações de CTTs e não-CTTs, aliado ao tratamento in vitro com radiação ionizante (RAD) e doxorrubicina (DXR) na linhagem de CM triplo-negativo MDA-MB-231. Metodologia: Foram empregados esquemas de pré-tratamento (GEN + DXR e GEN + RAD) e pós-tratamento (DXR + GEN e RAD + GEN), utilizando 1 - 5 ?M de GEN por 24h, 1 ng/mL de DXR por 24h e 5 -10 Gy de RAD, sendo os experimentos realizados após 24h de irradiação. Ao final de cada tratamento, foram avaliados viabilidade celular, grau de sinergia, ciclo celular, apoptose e quantidade de células CD24-/CD44+. Além disso, foi feita a aquisição de células CTTs e não-CTTs a fim de analisar a expressão gênica de vias apoptóticas. O estudo investigou os mesmos parâmetros na linhagem de CM hormônio-positivo MCF-7. Resultados: O tratamento com GEN 1 ?M por 24h provocou apoptose significativa em MDA-MB-231 por bloqueio em fase G2/M, porém o aumento da dose também não alterou a viabilidade e a população CD24-/CD44+. Células MCF-7 mostraram-se resistentes à GEN, pela indução da fase S, mas foram sensíveis à RAD, pelo bloqueio em fase G0/G1. O aumento da dose de GEN nos tratamentos combinados com DXR produziu aumento na sinergia. O pré-tratamento GEN 5 ?M + DXR 1 ng/mL induziu expressão de genes apoptóticos em células CD24-/CD44+, mas não reduziu a viabilidade. Conclusões: Tratamentos combinados utilizando baixas doses de GEN e DXR em esquemas de pré e pós-tratamento são capazes de provocar apoptose e redução da viabilidade em células MDA-MB-231 sensíveis. Contudo, esses tratamentos parecem induzir a sinalização de mecanismos de sobrevivência em CTTs, incluindo supressão de vias apoptóticas. Nesse contexto, apenas os tratamentos que induzem bloqueio no ciclo celular, mas sem alterar a viabilidade, são capazes de afetar populações CTTs resistentes de MDA-MB-231. / Introduction: Conventional chemo/radiotherapy breast cancer resistance still represents a major challenge, especially in triple-negative carcinomas, which do not express estrogen receptors, progesterone receptors and oncogene (HER2)/neu. It is known that the degree of breast cancer resistance is strongly associated with the amount of cancer stem cells, which can be detected by immunophenotyping (CD24-/CD44+). Cancer stem cells remain in G0/G1 phase for a long time, and exhibit inhibition of pro-apoptotic pathways. Several natural compounds have been studied, among which is the phytoestrogen genistein (GEN) from soy bean. The GEN acts as an ample tyrosine kinase inhibitor, and its antitumor activity has been pointed out in several studies. However, the biological effects of GEN in tumor stem cells are still poorly understood, especially when combined with other chemotherapy. Objectives: To assess the cytotoxic effects of GEN phytoestrogen in tumor stem and non-tumor stem sub-populations, combined with radiation (RAD) and doxorubicin (DXR) in vitro treatments in triple-negative breast cancer cell line MDAMB-231. Methodology: We used pretreatment (GEN + DXR e GEN + RAD) and post-treatment (DXR + GEN e RAD + GEN) regimens using 1 - 5 ?M of GEN for 24 hours, 1 ng/ml DXR for 24 hours and 5 - 10 Gy of RAD, in which experiments were performed after 24 hours of irradiation. At the end of each treatment we assessed cell viability, coefficient of drug interaction, cell cycle, apoptosis and amount of CD24-/CD44+ cells. Moreover, cancer stem cells and non-cancer stem cells sub-populations were sorted in order to study the gene expression of apoptotic pathways. This study also investigated the hormone-positive breast cancer cell line MCF-7. Results: GEN 1 ?M for 24 hours caused significant apoptosis in MDA-MB-231 by blocking the G2/M phase, but increasing the dose did not alter viability and CD24-/CD44+ quantity. MCF-7 cells were resistant to GEN, by inducing S phase, but were also sensitive to the RAD, with G0/G1 block. Increasing the dose in GEN treatments combined with DXR produced increased synergistic effects. Pretreatment GEN 5 ?M + DXR 1 ng/ml induced superexpression of apoptotic genes in CD24- /CD44+ cells, but did not reduce cell viability. Conclusions: Combined treatments using low doses of DXR and GEN in pre and post treatment schemes are able to trigger apoptosis and reduce viability of MDA-MB-231 responsive cells. However, these treatments appear to induce survival signaling mechanisms in cancer stem cells, including suppression apoptotic pathways. In this context, only treatments that induce cell cycle block, but without causing decrease in cell viability, are able to affect resistant tumor stem cells in MDA-MB-231.

Introdução: A resistência do câncer de mama (CM) ao tratamento quimio/radioterápico convencional ainda representa um grande desafio, especialmente em carcinomas triplonegativos, os quais não expressam receptores de estrógeno, receptores de progesterona e oncogene (HER2)/neu. Sabe-se que o grau de resistência do CM está fortemente associado à quantidade de células-tronco tumorais (CTTs), as quais podem ser detectadas por imunofenotipagem (CD24-/CD44+). As CTTs são quiescentes e apresentam inibição de vias pró- apoptóticas. Vários compostos naturais apresentam atividade antitumoral, dentre os quais o fitoestrógeno da soja genisteína (GEN) destaca-se como amplo inibidor de tirosino-quinases. Contudo os efeitos biológicos da GEN quanto à presença de CTTs ainda são pouco conhecidos, especialmente quando associada a outros quimioterápicos. Objetivos: Avaliar os efeitos citotóxicos do fitoestrógeno GEN em populações de CTTs e não-CTTs, aliado ao tratamento in vitro com radiação ionizante (RAD) e doxorrubicina (DXR) na linhagem de CM triplo-negativo MDA-MB-231. Metodologia: Foram empregados esquemas de pré-tratamento (GEN + DXR e GEN + RAD) e pós-tratamento (DXR + GEN e RAD + GEN), utilizando 1 - 5 ?M de GEN por 24h, 1 ng/mL de DXR por 24h e 5 -10 Gy de RAD, sendo os experimentos realizados após 24h de irradiação. Ao final de cada tratamento, foram avaliados viabilidade celular, grau de sinergia, ciclo celular, apoptose e quantidade de células CD24-/CD44+. Além disso, foi feita a aquisição de células CTTs e não-CTTs a fim de analisar a expressão gênica de vias apoptóticas. O estudo investigou os mesmos parâmetros na linhagem de CM hormônio-positivo MCF-7. Resultados: O tratamento com GEN 1 ?M por 24h provocou apoptose significativa em MDA-MB-231 por bloqueio em fase G2/M, porém o aumento da dose também não alterou a viabilidade e a população CD24-/CD44+. Células MCF-7 mostraram-se resistentes à GEN, pela indução da fase S, mas foram sensíveis à RAD, pelo bloqueio em fase G0/G1. O aumento da dose de GEN nos tratamentos combinados com DXR produziu aumento na sinergia. O pré-tratamento GEN 5 ?M + DXR 1 ng/mL induziu expressão de genes apoptóticos em células CD24-/CD44+, mas não reduziu a viabilidade. Conclusões: Tratamentos combinados utilizando baixas doses de GEN e DXR em esquemas de pré e pós-tratamento são capazes de provocar apoptose e redução da viabilidade em células MDA-MB-231 sensíveis. Contudo, esses tratamentos parecem induzir a sinalização de mecanismos de sobrevivência em CTTs, incluindo supressão de vias apoptóticas. Nesse contexto, apenas os tratamentos que induzem bloqueio no ciclo celular, mas sem alterar a viabilidade, são capazes de afetar populações CTTs resistentes de MDA-MB-231. / Introduction: Conventional chemo/radiotherapy breast cancer resistance still represents a major challenge, especially in triple-negative carcinomas, which do not express estrogen receptors, progesterone receptors and oncogene (HER2)/neu. It is known that the degree of breast cancer resistance is strongly associated with the amount of cancer stem cells, which can be detected by immunophenotyping (CD24-/CD44+). Cancer stem cells remain in G0/G1 phase for a long time, and exhibit inhibition of pro-apoptotic pathways. Several natural compounds have been studied, among which is the phytoestrogen genistein (GEN) from soy bean. The GEN acts as an ample tyrosine kinase inhibitor, and its antitumor activity has been pointed out in several studies. However, the biological effects of GEN in tumor stem cells are still poorly understood, especially when combined with other chemotherapy. Objectives: To assess the cytotoxic effects of GEN phytoestrogen in tumor stem and non-tumor stem sub-populations, combined with radiation (RAD) and doxorubicin (DXR) in vitro treatments in triple-negative breast cancer cell line MDAMB-231. Methodology: We used pretreatment (GEN + DXR e GEN + RAD) and post-treatment (DXR + GEN e RAD + GEN) regimens using 1 - 5 ?M of GEN for 24 hours, 1 ng/ml DXR for 24 hours and 5 - 10 Gy of RAD, in which experiments were performed after 24 hours of irradiation. At the end of each treatment we assessed cell viability, coefficient of drug interaction, cell cycle, apoptosis and amount of CD24-/CD44+ cells. Moreover, cancer stem cells and non-cancer stem cells sub-populations were sorted in order to study the gene expression of apoptotic pathways. This study also investigated the hormone-positive breast cancer cell line MCF-7. Results: GEN 1 ?M for 24 hours caused significant apoptosis in MDA-MB-231 by blocking the G2/M phase, but increasing the dose did not alter viability and CD24-/CD44+ quantity. MCF-7 cells were resistant to GEN, by inducing S phase, but were also sensitive to the RAD, with G0/G1 block. Increasing the dose in GEN treatments combined with DXR produced increased synergistic effects. Pretreatment GEN 5 ?M + DXR 1 ng/ml induced superexpression of apoptotic genes in CD24- /CD44+ cells, but did not reduce cell viability. Conclusions: Combined treatments using low doses of DXR and GEN in pre and post treatment schemes are able to trigger apoptosis and reduce viability of MDA-MB-231 responsive cells. However, these treatments appear to induce survival signaling mechanisms in cancer stem cells, including suppression apoptotic pathways. In this context, only treatments that induce cell cycle block, but without causing decrease in cell viability, are able to affect resistant tumor stem cells in MDA-MB-231.