Les premier et second transferts de brin sont deux étapes essentielles de la transcription inverse du génome du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1). De nombreuses études in vitro suggèrent que les transferts nécessitent l’action de la protéine de nucléocapside du VIH-1 (NC). Le premier transfert, se produisant de l’extrémité 5’ vers l’extrémité 3’ de l’ARN génomique du VIH-1, repose en grande partie sur un appariement ADN-ARN impliquant la région r de l’ADN strong-stop (ADNss) et la région R située à l’extrémité 3’ de l’ARN viral (ARN 3’UTR). Les structures, interactions et dynamiques qui gouvernent cet appariement sont mal connues. Jusqu’à notre étude, la formation de l’hybride ADN-ARN n’avait été étudiée in vitro qu’avec des courts acides nucléiques qui ne reflètent que partiellement les structures formées par l’ADNss et l’ARN 3’UTR dans le virus en cours de réplication. L’objectif principal de ma thèse a été de caractériser in vitro les mécanismes moléculaires qui gouvernent l’hybridation de l’ADNss avec l’ARN 3’UTR. Pour atteindre cet objectif, j’ai utilisé des méthodes de la biologie moléculaire et j’ai analysé la structure secondaire de l’ADNss entier avec trois sondes de structure (DNase I, mung bean nuclease et permanganate de potassium) : i) en l’absence de NC ; ii) en présence de NC ; iii) en présence de l’ARN 3’UTR.Les résultats obtenus nous ont permis d’être les premiers à déterminer in vitro la structure secondaire de l’ADNss entier du VIH-1 et à identifier dans celui-ci quatre sites sur lesquels se fixe préférentiellement la NC. A notre connaissance, les structures secondaires des ADNss d’autres rétrovirus n’ont pas été déterminées. Nos données structurales sont en faveur d’une structure secondaire de l’ADNss du VIH-1 constituée de trois tiges-boucles (u5, cpoly(A) et cTAR) et trois régions simple-brin en l’absence ou présence de NC. Notre analyse phylogénétique suggère que la structure secondaire de l’ADNss et les sites forts NC sont conservés parmi les différents groupes du VIH-1. Nos résultats suggèrent aussi qu’une partie de la région u5 de l’ADNss établit des interactions très faibles et probablement transitoires avec une partie de la région U3 de l’ARN 3’UTR en l’absence de NC. En réalisant des cinétiques d’hybridation et en utilisant deux ADNss mutés, nous avons montré que l’hybridation ADNss-ARN 3’UTR nécessite l’activité de la NC et que ce processus ne repose pas sur une seule voie d’initiation. Nos résultats supportent un modèle dans lequel la première étape est la fixation de la NC au niveau des quatre sites, ce qui va déclencher l’ouverture de la structure tridimensionnelle de l’ADNss et favoriser ainsi l’accessibilité de la région r ; la seconde étape étant la déstabilisation par la NC des structures secondaires ; la troisième étape étant l’appariement par la NC des régions complémentaires r et R. L’ensemble des résultats obtenus permet à mon équipe d’accueil d’initier de nouvelles études in vitro et ex vivo. / An essential step of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) reverse transcription is the first trand transfer that requires base pairing of the R region at the 3’- end of the genomic RNA with the complementary r region at the 3’-end of minus strand strong-stop DNA (ssDNA). HIV-1 nucleocapsid protein (NC) facilitates this annealing process. Determination of the ssDNA structure is needed to understand the molecular basis of NC-mediated genomic RNA-ssDNA annealing. For this purpose, we investigated ssDNA using structural probes (nucleases and potassium permanganate). This study is the first to determine the secondary structure of the fulllength HIV-1 ssDNA in the absence or presence of NC.Our probing data obtained in the absence of NC, suggest weak contacts between the u5 region of ssDNA and the U3 region the genomic RNA. The probing data and phylogenetic analysis support the folding of ssDNA into three stem-loop structures and the presence of four high-affinity binding sites for NC. Using the gel retardation assay, we analyzed the interaction of NC with each site. Taken together, our results support a model for the NC-mediated annealing process in which the preferential binding of NC to four sites triggers unfolding of the threedimensional structure of ssDNA, thus facilitating interaction of the r sequence of ssDNA with the R sequence of the genomic RNA. In addition, using gel retardation assays and ssDNA mutants, we show that the annealing of ssDNA to the 3’- end of the genomic RNA requires NC activity and does not rely on a single pathway (zipper intermediate or kissing complex).

Le 1er transfert de brin, étape cruciale de la transcription inverse impliquant la protéine de nucléocapside du VIH-1 (NC), repose sur l’appariement de la séquence r de l’ADN « strong stop » (ADNss) avec la séquence 3’ R de l’ARN viral (3’UTR) qui forme les tiges-boucles TAR et polyA. La séquence r est supposé former les tiges-boucles cTAR et cpolyA. Le transfert repose donc probablement sur l’hybridation de molécules structurées. La structure secondaire de l’ADNss n’a jamais été déterminée. L’objectif a été d’identifier les interactions et structures gouvernant l’hybridation de l’ADNss avec l’ARN 3’UTR. Les outils de la biologie moléculaire et trois sondes de structure ciblant l’ADN ont été utilisés pour atteindre cet objectif. Nos résultats sont les suivants : 1) l’ADN cTAR nu se replie sous la forme de deux conformations différentes qui sont en équilibre ; 2) la NC peut déplacer l’équilibre vers l’une des conformations et se fixer préférentiellement sur la boucle interne du cTAR ; 3) la NC est exigée pour former un hétéroduplex constitué de l’intégralité de l’ADNss et du 3’ UTR ; 4) l’hybridation ADNss-3’UTR peut être initiée à partir de plusieurs sites dans 0,2 mM MgCl2 ; 5) l’ADNss forme deux conformations en équilibre dans 0,2 mM MgCl2 et principalement une seule dans 2 mM MgCl2 ; 6) dans l’ADNss, la NC se fixe préférentiellement au niveau de la région simple-brin qui relie les tiges-boucles cTAR et cpolyA. Cette fixation joue probablement un rôle important dans l’hybridation des tiges-boucles ARN et ADN complémentaires. Notre étude permet de mieux comprendre la transcription inverse et la recombinaison qui dépend du transfert de brin interne. / The 1st strand transfer, a crucial step of reverse transcription involving the HIV-1 nucleocapsid protein (NC), relies on base pairing of the r sequence of strong-stop DNA (ssDNA) with the 3’ R sequence of viral RNA (3’ UTR) which forms the TAR and polyA stem-loops. The r sequence can form the cTAR and cpolyA stem-loops. Therefore, the transfer relies probably on annealing of folded molecules. This process is not well known at the molecular and structural level. The tools of molecular biology and three DNA-targeted probes were used to get insights into the annealing process. Our results were the following: 1) in the absence of NC, the cTAR DNA folds into two distinct conformations in equilibrium; 2) NC slightly shifts the equilibrium toward one conformation and binds tightly the internal loop of the cTAR hairpin; 3) NC is required for the formation of heteroduplex of the full-length ssDNA and 3’ UTR; 4) the annealing of ssDNA to 3’ UTR can be initiated from different sites in the presence of 0.2 mM MgCl2; 5) the full-length ssDNA folds into two conformations in equilibrium in 0.2 mM MgCl2 but mainly into one conformation in 2 mM MgCl2 ; 6) NC preferentially binds to the single-stranded region between the cTAR and cpolyA hairpins in ssDNA. This binding site probably plays an important role in the annealing of complementary DNA and RNA hairpins. This study helps us to gain insights into the reverse transcription process and the associated genetic recombination.

The 1st strand transfer, a crucial step of reverse transcription involving the HIV-1 nucleocapsid protein (NC), relies on base pairing of the r sequence of strong-stop DNA (ssDNA) with the 3' R sequence of viral RNA (3' UTR) which forms the TAR and polyA stem-loops. The r sequence can form the cTAR and cpolyA stem-loops. Therefore, the transfer relies probably on annealing of folded molecules. This process is not well known at the molecular and structural level. The tools of molecular biology and three DNA-targeted probes were used to get insights into the annealing process. Our results were the following: 1) in the absence of NC, the cTAR DNA folds into two distinct conformations in equilibrium; 2) NC slightly shifts the equilibrium toward one conformation and binds tightly the internal loop of the cTAR hairpin; 3) NC is required for the formation of heteroduplex of the full-length ssDNA and 3' UTR; 4) the annealing of ssDNA to 3' UTR can be initiated from different sites in the presence of 0.2 mM MgCl2; 5) the full-length ssDNA folds into two conformations in equilibrium in 0.2 mM MgCl2 but mainly into one conformation in 2 mM MgCl2 ; 6) NC preferentially binds to the single-stranded region between the cTAR and cpolyA hairpins in ssDNA. This binding site probably plays an important role in the annealing of complementary DNA and RNA hairpins. This study helps us to gain insights into the reverse transcription process and the associated genetic recombination.

Du fait de sa haute conservation et de ses fonctions clés dans le virus VIH-1, la protéine de la nucléocapside NC est une cible de choix pour développer de nouveaux anti-viraux. Bien que la compréhension mécanistique des propriétés chaperonnes de NC vis-à-vis des acides nucléiques ait connu d’importants progrès, les aspects dynamiques de ces propriétés restent mal comprises, faute notamment d’outils appropriés pour les suivre au niveau moléculaire. L’objectif de ce travail de thèse a été de caractériser au niveau moléculaire la dynamique des interactions de NC avec les acides nucléiques, à l’aide d’outils fluorescents développés au laboratoire ou en collaboration. En utilisant des peptides NC et des oligonucléotides marqués en différentes positions par des analogues fluorescents d’acides aminés et de nucléosides, respectivement, nous avons pu donner une image complète du processus dynamique sous-tendant le mécanisme chaperon de NC dans le second transfert de brins de la transcription inverse du cycle du VIH-1. Cette compréhension est fondamentale pour concevoir des stratégies rationnelles afin de cibler le rôle spécifique de NC dans ses interactions avec ses cibles nucléiques. / Due to its high conservation and key functions in the HIV-1 virus, the nucleocapsid protein NC is a potential target for the development of new anti-viral drugs. Although the mechanistic understanding of the NC nucleic acid chaperone properties has achieved a significant progress, the dynamic aspects of these properties remain poorly understood, mainly due to the lack of the appropriate tools to monitor them at the molecular level. The objective of this thesis was to characterize the dynamic interactions of NC with nucleic acids at the molecular level using new fluorescent tools developed in the laboratory or in collaboration. Using NC peptides and its target oligonucleotides labeled in different positions by fluorescent amino acid and nucleoside analogs, respectively, we were able to give a complete picture of the dynamic processes underlying the chaperone activity of NC in the second strand transfer of HIV-1 reverse transcription. This understanding is fundamental to design rational strategies in order to target the specific role of NC in interaction with its nucleic acid targets.