Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-09T14:26:07Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_DhianRenatoAlmeidaCamargo.pdf: 3559105 bytes, checksum: 559d79208eea1b927b5dfdc61f96fdc8 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-09T14:26:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_DhianRenatoAlmeidaCamargo.pdf: 3559105 bytes, checksum: 559d79208eea1b927b5dfdc61f96fdc8 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-09T14:26:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_DhianRenatoAlmeidaCamargo.pdf: 3559105 bytes, checksum: 559d79208eea1b927b5dfdc61f96fdc8 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-09T14:26:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_DhianRenatoAlmeidaCamargo.pdf: 3559105 bytes, checksum: 559d79208eea1b927b5dfdc61f96fdc8 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / Noventa e dois sorotipos de Streptococcus pneumoniae já foram descritos, mas a vacina pneumocócica conjugada (PCV10) introduzida no calendário básico de vacinação do Brasil, em 2010, cobre somente os mais prevalentes no país. A substituição dos sorotipos vacinais após imunização em massa é uma grande preocupação e monitorar esse fenômeno requer métodos de sorotipagem eficientes e acessíveis. A Sorotipagem clássica de pneumococos baseada em antissoros produzidos em animais é trabalhosa, restrita a poucos laboratórios de referência, e não pode tipar isolados não capsulados. Alternativamente, os métodos de sorotipagem molecular avaliam os polimorfismos dos genes do cluster cps, que codificam enzimas chave para a síntese do CPS em Streptococcus pneumoniae. Em uma abordagem apropriada, cps-RFLP, os loci cps amplificados por PCR são digeridos com uma endonuclease gerando perfis únicos à eletroforese em gel de agarose, permitindo assim a identificação do sorotipo. Neste trabalho, nós combinamos abordagens in silico e in vitro para demonstrar que XhoII é a endonuclease mais discriminante para o método cps-RFLP, e para construir um banco de dados de perfis sorotipo-específico que acomodou a diversidade genética do lócus cps de 91 conhecidos sorotipos de pneumococos. O banco de dados de perfis cps-RFLP foi integrado ao Molecular Serotyping Tool (MST), software anteriormente publicado baseado em web-based para sorotipagem molecular. Usando XhoII, o método cps-RFLP obteve especificidade de 84,6% para sorotipagem e 100 % para sorogrupagem de pneumococos. Esta nova ferramenta pode representar uma colaboração relevante para vigilância epidemiológica em tempo real da diversidade de pneumococos em resposta a programas de imunização em massa. / Ninety-two Streptococcus pneumoniae serotypes have been described, but the pneumococcal conjugate vaccine (PCV10) introduced in the Brazilian basic vaccination schedule, in 2010, covers only the most prevalent in the country. Pneumococcal serotype-shifting after massive immunization is a major concern and monitoring this phenomenon requires efficient and accessible serotyping methods. Classical pneumococcal serotyping based on antisera produced in animals is laborious, restricted to a few reference laboratories, and cannot type non-capsulated isolates. Alternatively, molecular serotyping methods assess the polymorphisms in the cps gene cluster, which encodes key enzymes for CPS synthesis in Streptococcus pneumoniae. In one such approach, cps-RFLP, the PCR amplified cps loci are digested with an endonuclease, generating unique fingerprints on agarose gel electrophoresis, therefore allowing serotype identification. In this work, we combined in silico and in vitro approaches to demonstrate that XhoII is the most discriminating endonuclease for cps-RFLP, and to build a database of serotype-specific fingerprints that accommodates the genetic diversity within the cps locus of 91 known pneumococci serotypes. The database of cps-RFLP fingerprints was integrated to Molecular Serotyping Tool (MST), our previously published web-based software for molecular serotyping. Using XhoII, the cps-RFLP method achieved 84.6% specificity for serotyping and 100% for serogrouping of pneumococci. This new tool may represent a relevant aid to real time epidemiological surveillance of pneumococci diversity in response to mass immunization programs.