Doctor en Ciencias de la Ingeniería, Mención Ingeniería Química y Biotecnología / Streptomyces leeuwenhoekii C34 es una nueva cepa que fue aislada desde la laguna Chaxa ubicada en el Desierto de Atacama, Chile. Esta cepa produce metabolitos especializados con actividad contra Staph. aureus resistente a meticilina (MRSA): chaxamicinas y chaxalactinas. La secuencia genómica de S. leeuwenhoekii C34 se obtuvo mediante las tecnologías de Illumina Miseq y PACbio RS II SMRT. El genoma se utilizó para identificar clústers de genes biosintéticos (BGCs) que codifican para metabolitos especializados a través de minería de genomas, y para desarrollar un modelo a escala genómica (GSM) para estudiar las rutas de biosíntesis de producción de metabolitos especializados. Se encontraron 34 BGCs en el genoma de S. leeuwenhoekii C34, más un BGC ubicado en el plásmido pSLE2. Se encontró tres BGCs para lazo-péptidos. Específicamente, se identificó el producto del BGC del lazo-péptido 3 en el sobrenadante de S. leeuwenhoekii C34 cultivado en medio TSB/YEME y se expresó exitosamente en el huésped heterólogo S. coelicolor M1152. Se confirmó que este lazo-péptido era el mismo que la chaxapeptina, recientemente descrita para S. leeuwenhoekii C58. Por otra parte, se identificó un BGC de 64 kb (locus 1083651 a 1147687) que codifica para un híbrido trans-AT PKS/NRPS. Es probable que el producto de este BGC sea un compuesto halogenado debido a la presencia de un gen, sle09470, que codifica para una enzima cloradora. Para estudiar este clúster de genes, se desarrollaron diferentes cepas derivadas de S. leeuwenhoekii. También, el BGC se clonó en huéspedes heterólogos: S. coelicolor M1152, M1154 and S. albus. A través de análisis de HPLC MS/MS y comparación de perfiles de metabolitos, se identificó un grupo de compuestos con patrón clorado, sin embargo se descartaron como posibles productos del BGC ya que además de encontrarse en las cepas de S. leeuwenhoekii también se encontraron en muestras de S. coelicolor M1152. Por otra parte, se detecto un metabolito con una señal de m/z 611.53 [M + H]+ solamente en las muestras de S. leeuwenhoekii M1614 ( chaxamycin BGC) y M1619 ( chaxamycin BGC; sle09560). Se requieren msá estudios para confirmar si los metabolitos expresados diferencialmente corresponden a un producto del híbrido transAT-PKS/NRPS BGC. Para construir el GSM de S. leeuwenhoekii C34 se desarrolló una interfaz basada en python, que permite: buscar genes de Streptomyces asociados a reacciones en la base de datos KEGG, realizar BLAST local contra S. leeuwenhoekii C34, comparar los dominios de proteínas, descargar información de los metabolitos, construir el GSM y realizar simulaciones usando COBRApy. Las rutas biosintéticas de chaxamicinas, chaxalactinas, desferrioxaminas, ectoina y el producto del híbrido transAT-PKS/NRPS BGC (híbrido PK-NP) se incluyeron en el modelo. El modelo, iVR1007, consiste de 1722 reacciones, 1463 metabolitos y 1007 genes, y se validó usando información experimental de crecimiento en diferentes fuentes de carbono, nitrógeno y fósforo, mostrando un 83.7 % de precisión. El modelo se usó para encontrar deleción y sobre-expresión de genes no intuitivas que predicen un aumento en la producción de precursores de chaxamicinas, chaxalactinas e híbrido PK-NP. Las modificaciones predichas podrán ser usadas para realizar ingeniería metabólica de S. leeuwenhoekii C34 para incrementar la producción de metabolitos especializados.

Doctor en Ciencias de la Ingeniería, Mención Ingeniería Química y Biotecnología / Streptomyces leeuwenhoekii C34 es un actinomiceto aislado del desierto de Atacama, Chile, productor de los antibióticos chaxamicinas A a D y chaxalactinas A a C. El objetivo de este trabajo fue identificar los genes involucrados en la biosíntesis de chaxamicinas y chaxalactinas y producir chaxamicinas en un huésped heterólogo. Capítulo Uno detalla procedimientos de crecimiento y modificación genética de S. leeu- wenhoekii C34. La temperatura óptima para producción de chaxamicinas en medio líquido fue 30 °C, y la que permitió alcanzar altos niveles de esporulación en medio sólido fue 37 °C. S. leeuwenhoekii C34 fue sensible a tioestreptona, apramicina, higromicina B y kanamicina, mientras que no a ácido nalidíxico, antibióticos usados para seleccionar bac- terias genéticamente modificadas. Un vector sensible a temperatura (pGM1190) y otro con un sistema de integración del fago C31 (pSET152) fueron exitosamente transferi- dos a S. leeuwenhoekii C34 por conjugación con una cepa que no metila ADN, E. coli ET12567/pUZ8002. Suplementación del medio de conjugación con 120 mM MgCl2 ó 60 mM CaCl2, incrementó la frecuencia de conjugación de forma significativa, comparado con el control sin adición de sales. En este trabajo se demostró que S. leeuwenhoekii C34 incorpora ADN foráneo no metilado. Capítulo Dos describe la identificación y expresión heteróloga de los genes de biosín- tesis de chaxamicinas. El genoma de S. leeuwenhoekii C34 fue secuenciado de novo combinando tecnologías de secuenciación Illumina y PacBio. Un grupo de 27 genes (80,2 kb, locus 1.210.347 1.290.550), codifica enzimas para la biosíntesis de chaxam- icinas. pIJ12853 contenía un inserto del genoma de S. leeuwenhoekii C34 de 145 kb que incluye el segmento de 80,2 kb, el que fue transferido a una cepa que no produce chaxamicinas, S. coelicolor M1152, resultando en la producción de chaxamicinas A D, confirmando que los genes presentes en pIJ12853 codifican para la ruta de biosíntesis de chaxamicinas. Genes del huésped heterólogo podrían estar involucrados en biosíntesis y/o exporte de estas moléculas. La deleción del gen AHBA sintasa (cxmK) en S. leeu- wenhoekii C34, dio origen a la cepa M1653 que pierde su capacidad de producir chax- amicinas. Para demostrar que la interrupción en la producción de chaxamicinas fue sólo debido a su incapacidad de producir AHBA, un cultivo líquido de M1653 suplementado con AHBA comercial permitió restablecer la producción de chaxamicinas. Esto es una prueba más de que el los genes de biosíntesis de chaxamicinas fueron identificados. Capítulo Tres describe la identificación bioinformática de los genes de biosíntesis de chaxalactinas. Una secuencia de 80,7 kb (locus 7.146.903 7.227.608) contenía genes codificantes de 5 subunidades de una policétido sintasa, cuya arquitectura de dominios coincidía con la predicha para biosíntesis de chaxalactina A. Un gen que codifica una citocromo P450 sería responsable de la hidroxilación C-14 de chaxalactina A que da ori- gen a chaxalactina B. Dos genes codificantes de O-metiltransferasas estarían involucra- dos en una O-metilación C-13 de chaxalactina B, que da origen a chaxalactina C.