Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Resumo: As fosfolipases A2 (PLA2s) são um dos maiores constituintes protéicos do veneno botrópico e um dos responsáveis pela necrose muscular, consequência esta não eficazmente neutralizada pela administração do soro antiofídico. Estas proteínas são tóxicas através do rompimento ou perturbação da membrana celular em um mecanismo catalítico dependente de cálcio e outro independente, sendo este último não totalmente elucidado. Usualmente, estas toxinas são obtidas diretamente do veneno das serpentes, sendo sua purificação um desafio pela co-existência de diferentes isoformas. O objetivo desta tese foi compreender o mecanismo miotóxico independente de cálcio através de estudos estruturais e propor nova metodologia que trate de dados cristalográficos de toxinas provenientes de amostras impuras, chamada SEQUENCE SLIDER. Para tanto, cristalografia e outras técnicas biofísicas, como espalhamento de raios X a baixo ângulo, serão utilizados para estudar três miotoxinas ofídicas em estado nativo e complexado com produtos naturais e inibidores. Nós propusemos medidas locais e globais para caracterizar e relacionar a estrutura dessas toxinas a função. Com o SEQUENCE SLIDER, pudemos elucidar as estruturas de toxinas inéditas cuja sequência era parcialmente conhecida. Esta nova metodologia proposta consiste em avaliar diferentes cadeias laterais contra o coeficiente de correlação em espaço real calculado a partir dos dados cristalográficos. Em paralelo, desenvolvemos o SEQUENCE SLIDER no âmbito do... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Les complexes multi-protéiques jouent un rôle crucial dans les cellules vivantes en catalysant et servant d'intermédiaires entre pratiquement toutes les activités cellulaires essentielles. Cependant, un grand nombre de ces machines se trouvent en très faibles quantités dans les cellules en particulier en ce qui concernent les complexes eucaryotes. Ceci est réfractaire à leur extraction à grande échelle et empêche sévèrement l'élucidation de leur structure et fonction. Dans le but de rendre les complexes multi protéiques accessibles par la voie de production recombinante, le groupe Berger a mis au point un ensemble de systèmes d'expression sur mesure pour la surproduction de complexes multi protéiques dans différents organismes hôtes incluant E. coli, les cellules d'insectes et les cellules de mammifères. Ces systèmes et en particulier le système MultiBac baculovirus/cellules d'insecte ont d'ors et déjà grandement contribués à l'étude de l'assemblage structural et fonctionnel à l'échelle moléculaire et atomique de nombreux complexes multi protéiques importants. Cela inclut en particulier le facteur général humain de transcription TFIID, un complexe de ~1.5 MDa qui constitue le sujet de recherche du laboratoire Berger. Mes contributions dans le développement de la technologie pour la production et dans l'élucidation des complexes TFIID humains sont discutées en détails dans cette thèse. / Multiprotein complexes play a crucial role in living cells by catalyzing and mediating virtually all essential cellular activities. However, many of these essential machines exist in very low endogenous amount in cells, in particular for eukaryotic complexes. This is refractory to large-scale extraction from native source material, severely impeding the elucidation of their structure and function. In order to make multiprotein complexes accessible by means of recombinant production, the Berger laboratory has developed an array of advanced expression systems tailor-made for overproducing multiprotein complexes in various host organisms including E. coli, insect cells and mammalian cells. Those systems, in particular the MultiBac baculovirus/insect cell system have already greatly contributed to studying the structural and functional assemblies of numerous important multiprotein complexes in molecular and atomic detail. Notably, this includes also the human general transcription factor TFIID, a ~1.5 MDa complex, which is the research focus of the Berger laboratory. My contributions to the expression technology development and to the structural elucidation of human TFIID complexes are discussed in details in this thesis.

Orientador: Marcos Roberto de mattos Fontes / Resumo: Ainda nos dias de hoje, o envenenamento ofídico é um problema de saúde pública, afetando, sobretudo, regiões de clima tropical, subtropical, particularmente áreas rurais de países da África, Ásia, Oceania e América Latina. No Brasil, os gêneros de serpentes Bothrops e Crotalus são responsáveis por quase 95% dos acidentes ofídicos, enquanto o segundo gênero apresenta alta taxa de morbidade. O veneno das serpentes do gênero Bothrops contem fosfolipases A2 ácidas que causam uma considerada mionecrose e severas reações anticoagulantes. De outro lado, os venenos das serpentes do gênero Crotalus possuem o complexo crotoxina, o qual é formado pela crotoxina A (não catalítica) e a crotoxina B (PLA2 catalítica) que possui potente ação neurotóxica. As serpentes peçonhentas, grupo que inclui ambas as famílias citadas, utilizam esse veneno tanto para a captura de sua presa como para sua própria defesa. Inevitavelmente, essas serpentes terão contato com o seu próprio veneno, como por exemplo, na alimentação, pois as presas estarão envenenadas. Por tal fato, as serpentes peçonhentas apresentam alguns mecanismos de defesa, inclusive algumas proteínas encontradas em seu sangue que são chamadas de proteínas inibitórias de PLA2 (PLIs). Para entender melhor o mecanismo de inibição desses compostos plasmáticos, foi desenvolvido neste trabalho um novo protocolo de docking molecular que consiste em analisar as estruturas ao longo dos modos normais, docking molecular, simulação de dinâmica molecula... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Nowadays, snake envenomation is a public health issue that mostly affects tropical and subtropical regions, particularly rural areas of countries from Africa, Asia, Oceania and Latin America. In Brazil, the Bothrops and Crotalus snake genre are responsible for approximately 95% of all snake bites, and the accidents caused by the latter have a relatively high mortality rate. The venom of Bothrops snakes contains a acid phospholipases A2 that causes drastic local myonecrosis and several anticoagulant reactions. On the other hand, the Crotalus genus snake venom contains the the crotoxin complex, which is formed by crotoxin A (non-catalytic) and crotoxin B (catalytic PLA2), that have up a strong neurotoxic action. Venomous snakes, including the two afore mentioned genre, use their venoms for capturing their prey and for their own defense. These snakes will inevitably get in contact with their own venom, for example, in alimentation, for the prey itself will be poisoned. For this fact, the poison snakes features in your blood the so-called PLA2 inhibiting proteins (PLIs). In order to understand the inhibition mechanism of these plasmatic components, it has developed in this study a new molecular docking protocol that consists in analyzing the structures using normal modes, molecular docking, molecular dynamics simulation and other bioinformatics tools. The results of this work was the proposition of a new flexible molecular docking protocol between two or more proteins and your... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre