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Les enzymes de biosynthèse des glycosaminoglycanes : étude structurale et fonctionnelle de la [bêta]4GalT7 humaine et caractérisation moléculaire des mutations responsables du syndrome progéroide d'Ehlers-Danlos / Enzymes involved in glycosaminoglycan biosynthesis : structure-function study of human [bêta]4GalT7 and molecular characterization of progeroid form of Ehlers-Danlos syndromeTalhaoui, Ibtissam 10 December 2010 (has links)
Les chaînes de glycosaminoglycanes (GAGs) des protéoglycanes (PGs) jouent un rôle majeur dans la régulation de multiples événements cellulaires et le maintien de l'architecture des tissus. Des perturbations de la synthèse des GAGs sont impliquées dans des pathologies d'origine dégénérative, tumorale et génétique, tel que le syndrome progéroïde d'Ehlers-Danlos (ED). Ce déficit résulte de mutations de la [bêta]1,4-galactosyltransférase 7 ([bêta]4GalT7) humaine associées à des atteintes sévères du système musculo-squelettique. En effet, cette enzyme catalyse une étape essentielle de l?initiation de la synthèse des GAGs à partir de la protéine "core" des PGs et de xylosides exogènes. Notre travail a porté sur l'étude structure-fonction de la [bêta]4GalT7 recombinante humaine. Nous avons associé des approches in vitro et ex vivo afin d?explorer le rôle des acides aminés des motifs 163DVD165, 221FWGWGREDDD230 et 257HLH259, strictement conservés au sein des [bêta]4GalTs. L'étude des conséquences de mutations systématiques sur les propriétés cinétiques et fonctionnelles de la [bêta]4GalT7 recombinante a permis d'identifier des acides aminés essentiels du site actif. Nous avons montré que les résidus D165 et H257 forment des liaisons de coordination avec le cation Mn2+ et proposé le rôle du résidu D228 dans la catalyse. Nous avons mis en évidence un rôle central du résidu W224 dans les interactions avec les substrats donneur et accepteur. Nous avons également établi les bases moléculaires des mutations de la [bêta]4GalT7 associées au syndrome ED. Enfin, l'étude de mécanismes de régulation épigénétique des voies de biosynthèse des GAGs dans les cellules H-EMC-SS de chondrosarcome humain a mis en évidence une hyperméthylation spécifique des gènes de la famille des 3-O-sulfotransférases, associée à un phénotype invasif. L'ensemble de ce travail ouvre des perspectives vers de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le traitement des arthropathies / Proteoglycans (PGs) and their glycosaminoglycan chains (GAGs), play a major role in the architecture of extracellular matrices and are implicated in numerous cell events. The impairment of GAG synthesis and sulfation is involved in degenerative, tumor and genetic diseases, such as the progeroid form of Ehlers-Danlos (ED) syndrome. This inherited disorder is due to mutations of human [bêta]4GalT7 ([bêta]4GalT7) causing a defect in GAG synthesis, associated with severe musculo-skeletal alterations. Indeed, this enzyme catalyzes a key step in GAG synthesis linked to the core protein of PGs and from exogenous xylosides. Our work has been focused on the structural and functional characterization of human recombinant [bêta]4GalT7 enzyme. We combined in vitro and ex vivo approaches to explore the role of amino acids located in 163DVD165, 221FWGWGREDDD230 and 257HLH259 motifs, which are highly conserved within [bêta]4GalTs. The study of the consequences of site-directed mutations on kinetic and functional properties of the [bêta]4GalT7 enzyme allowed us to identify key active site amino acids. Our results indicate that D165 and H257 residues form coordination bonds with Mn2+ divalent cations. Furthermore, we suggested a catalytic role for D228 residue and highlighted a central role of W224 residue via interactions with the donor and acceptor substrates. We also determined the molecular basis of [bêta]4GalT7 mutations associated with ED syndrome. Finally, the study of epigenetic regulation mechanisms by DNA methylation of GAG biosynthesis in human chondrosarcoma cells (H-EMC-SS) revealed the specific hypermethylation of the 3-O-sulfotransferase gene family, associated with the invasive phenotype of these cells. Together, this work paves the way towards innovative strategies in the treatment of arthropathies
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Structure-fonction de l’action pionnière de Pax7Bascunana, Virginie 08 1900 (has links)
Dans l’hypophyse, Pax7 spécifie l’état du lobe intermédiaire grâce à son action pionnière. Cette action implique dans un premier temps une liaison de cette protéine à certains sites d’hétérochromatine et, par la suite, le remodelage de cette hétérochromatine en euchromatine. Le remodelage de l’épigénome par Pax7 permet au facteur de transcription Tpit d’entrainer l’activation du transcriptome mélanotrope par opposition au destin hypophysaire corticotrope entraîné par Tpit en l’absence de Pax7. Pour étudier l’action pionnière de Pax7, différents membres du laboratoire Drouin ont utilisé un modèle de cellules corticotropes. L’expression ectopique du facteur pionnier Pax7 dans ces cellules permet leur transition d’un phénotype corticotrope à mélanotrope. En plus de l’isoforme prédominante de Pax7 exprimée dans hypophyse avec lequel les travaux de Budry et Mayran ont étaient faits, il existe trois autres isoformes de Pax7 qui diffèrent par quelques acides aminés (Q et GL) dans le domaine PAIRED liant l’ADN.
Nous voulions savoir quels étaient les domaines protéiques de Pax7 impliqués pour son activité pionnière.
Nous avons d’abord étudié les propriétés des différents isoformes naturelles de Pax7 présentant des variations dans le domaine PAIRED que ce soient pour leurs capacités de facteur transcription ou de facteur pionnier dans un modèle de cellules de corticotrope. Nous avons constaté que les quatre isoformes de Pax7, ainsi que Pax3, le facteur le plus homologue à Pax7 dans la famille Pax, présentent une capacité similaire à lier la chromatine fermée. Cependant, Pax3 et les isoformes de Pax7 (GL+) sont incapables d’ouvrir la chromatine sur un sous-groupe d’enhancers pionniers nécessaire à l’activation du transcriptome mélanotrope.
Par la suite, par analyse structure-fonction, nous avons identifié une région de Pax7 importante pour sa liaison à soixante pour cent des sites présents dans l’hétérochromatine qui sont ciblés par l’action pionnière et une région importante pour l’ouverture de chromatine aux sites des pionniers sensibles à la variation GL.
Collectivement, nos données ont montré que les acides aminés GL dans le domaine PAIRED en N-terminal et la partie C-terminale de la protéine Pax7 sont critiques pour l’ouverture de la chromatine à des enhancers spécifiques présents dans l’hétérochromatine dont l’activation est nécessaire au destin mélanotrope. D’autre part, les analyses de structure-fonctions nous ont permis d’identifier une région critique de Pax7 nécessaire à son interaction avec l’hétérochromatine sur ces même enhancers. / In the pituitary, Pax7 specifies the intermediate lobe state through a pioneer factor action that involves the binding of this protein to certain heterochromatin sites and, subsequently, the remodeling of this heterochromatin into euchromatin. Epigenome remodeling by Pax7 thus allows the transcription factor Tpit to determine the melanotrope fate as opposed to the corticotrope pituitary fate that is driven by Tpit in absence of Pax7. To study the pioneering action of Pax7, Budry et al, and Mayran et al, used a model of corticotrope cells which, following the expression of Pax7, transit from a corticotrope phenotype to melanotic phenotype thanks to its pioneering action. In addition to the predominant Pax7 isoform expressed in pituitary with which the work of Budry and Mayran were done, there are three other Pax7 isoforms that differ by a few amino acids (Q and GL) in the DNA-binding paired domain.
We wanted to know what protein domains of Pax7 was involved in its pioneering activity.
We have investigated the properties of the different Pax7 isoforms with respect to their transcriptional and pioneer capabilities in a model of corticotrope cells. We found that all four Pax7 isoforms together with the closely related factor Pax3, exhibit a similar ability to bind closed chromatin. However, Pax3 and the isoforms of Pax7 (GL+) failed to open the chromatin at a subset of enhancer necessary to activate the melanotrope transcriptome.
In addition, we have identified by structure-function analysis a region of Pax7 that appears important for Pax7 binding at 60 percent of heterochromatin sites that are targeted for pioneering and one region important for chromatin opening to the pioneer sites GL-sensible.
Collectively, our data suggest that the amino acids GL in the paired domain and the C-terminal part are critical for the chromatin opening to heterochromatin sites necessary to melanotrope transcriptome. On the other hand, structure-functions analyses allowed us to identify a critical region of Pax7 required for the interaction with heterochromatin on these same enhancers.
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