Orientador: Jorg Kobarg / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto e Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T00:02:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bressan_GustavoCosta_D.pdf: 16510013 bytes, checksum: 30f3887b16b18caf89b81d091caca8d7 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A proteína Ki-1/57 foi descoberta através da reação cruzada do anticorpo monoclonal Ki-1 em células do linfoma de Hodgkin. Foi demonstrado previamente que Ki-1/57 sofre fosforilação por PKCs e metilação por PRMT1, uma arginino metiltransferase que modula diversas proteínas ligadoras a RNA. Nesse trabalho, é mostrada a interação de Ki-1/57 com sondas de RNA e com proteínas envolvidas no controle de splicing de pré-mRNA. O seu envolvimento no controle de splicing foi confirmado em ensaios de cotransfecção em células de mamíferos. Análises de microscopia de confocal mostraram a localização da construção EGFP-Ki-1/57 em diferentes corpúsculos nucleares de forma dependente da metilação celular. Essas regiões compreendem nucléolos, speckles, corpos de Cajal e GEMS, conhecidamente envolvidas na biogênese, maturação ou armazenamento de complexos de processamento de RNA/pré-RNA no núcleo. Análises a partir de construções truncadas sugeriram o N-terminal de Ki-1/57 como importante para a interação com proteínas reguladoras de splicing e localização nos corpúsculos nucleares, enquanto o C-terminal como necessário e suficiente para a ligação a RNA poliuridina e localização citoplasmática. Por outro lado, essas duas regiões pareceram atuar em conjunto no processamento do gene E1A. Similarmente a hnRNPQ, Ki-1/57 e outras proteínas funcionalmente relacionadas, SFRS9 é mostrada como alvo de metilação por PRMT1. A inibição da metilação resultou em um aumento do número de células apresentando localização da construção EGFP-SFRS9 no interior de nucléolos, mostrando a importância dessa modificação para a localização subnuclear de SFRS9. As características estruturais de Ki-1/57 também foram investigadas através de diferentes abordagens. Análises por SAXS, gel filtração analítica e ultracentrifugação analítica indicaram uma estrutura bastante alongada e flexível para a construção C-terminal 6xhis-(122-413)Ki-1/57. Ensaios de proteólise limitada também sugeriram uma baixa composição de núcleos hidrofóbicos estáveis e compactos. A capacidade de Ki-1/57 em sofrer enovelamento induzido após a interação com ligantes também foi monitorada em experimentos de dicroísmo circular. Embora não tenha sido observada nenhuma alteração estrutural após a incubação de 6xhis-(122-413)Ki-1/57 com o RNA poliuridina, a adição de TFE foi capaz de promover pequenos ganhos de elementos de estrutura secundária regular. Esses dados, juntamente com predições computacionais, sugerem que Ki-1/57 é uma nova proteína intrinsecamente desordenada, o que pode explicar o elevado número de diferentes proteínas parceiras que ela é capaz de interagir. / Abstract: The Ki-1/57 protein has been discovered through the cross reactivity of the monoclonal antibody Ki-1 in Hodgkin lymphoma cells. Previously, it was demonstrated that Ki-1/57 undergoes phosphorylation by PKCs and methylation by PRMT1, an arginine methyltransferase that modulates many RNA binding proteins. Here, the interaction of Ki-1/57 with RNA polyuridine and proteins involved in pre-mRNA splicing control are shown. Its involvement in splicing regulation was confirmed by cotransfection assays in mammalian cells. Confocal microscopy analyses revealed the localization of EGFP-Ki-1/57 at different nuclear bodies, depending on the cellular methylation status. These regions include nucleoli, speckles, Cajal bodies and GEMS, which are all known to be involved in biogenesis, maturation or storing of RNA/pre-mRNA processing complexes in the nucleus. Analysis from experiments with truncated forms of Ki-1/57 suggested its N-terminus as important for its interaction with splicing proteins and localization at nuclear bodies. In turn, its C-terminus was seen as necessary and sufficient for the cytoplasmic localization and polyuridine RNA binding. However, these two regions seemed to be required working together for an efficient splicing activity on E1A gene. Similarly to hnRNPQ, Ki-1/57 and others functionally related proteins, SFRS9 is shown here as a target for methylation by PRMT1. The inhibition of this activity resulted in increase in the number of cells showing EGFP-SFRS9 in the nucleoli, suggesting the importance of methylation for the subnuclear localization of SFRS9. The structural characteristics of Ki-1/57 also have been investigated through different approaches. Analyses by SAXS, analytical gel filtration and analytical ultracentrifugation techniques suggested a very elongated and flexible structure for the C-terminal construct (122-413)Ki-1/57. Also, limited proteolysis analysis suggested a low composition of stable and compact hydrophobic cores. The ability of Ki-1/57 in suffering binding-induced folding was also investigated. Although no structural modification has been observed after incubating (122-413)Ki-1/57 with a polyuridine RNA, the addition of the TFE probe was able to promote a small gain of regular secondary structural elements. These findings, together with different computational predictions, pointed out that Ki-1/57 is a novel intrinsically unstructured protein. This could explain the wide array of protein partners with which it is able to interact. / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular