Ingeniera Civil Química / Ingeniera Civil en Biotecnología / El presente trabajo tiene por objetivo el estudio de la acción catalítica del microorganismo termófilo moderado Sulfobacillus acidophilus en la biolixiviacion de calcopirita a 45ºC, con el fin de demostrar una mayor tasa de recuperación de cobre al elevar la temperatura de operación. Con este objeto, se realizó un estudio comparativo de la biolixiviación de calcopirita por un microorganismo mesófilo Acidithiobacillus ferrooxidans y el microorganismo Sulfobacillus acidophilus. El estudio consistió en la biolixiviación de un concentrado de calcopirita en frascos agitados a 30 y 45ºC para los cultivos mesófilo y termófilo moderado, respectivamente. Los frascos fueron monitoreados periódicamente por un periodo de 648 horas, para la medición de Eh, pH, Fe(II) y Fe total en solución, fierro precipitado, sulfato y cobre en solución. Las poblaciones de bacterias de ambos microorganismos (planctónicas y adheridas a los minerales) se cuantificaron utilizando tinción con DAPI y su evaluación en un microscopio de epifluorescencia. Además, mediante el análisis de los datos obtenidos de cobre en solución se determinaron las tasas de recuperación, y las respectivas etapas controlante del proceso según el modelo del núcleo sin reaccionar. Los resultados mostraron para ambas cepas una alta capacidad de adherencia sobre la calcopirita de aproximadamente 85%. Sin embargo, el porcentaje de recuperación de cobre y el tiempo de disolución total de la calcopirita () muestra una diferencia apreciable entre los cultivos. Se obtuvo un porcentaje de recuperación de 7,3% y 13,3% y valores de  de 20.833 y 6.944 días para A. ferrooxidans y S. acidophilus, respectivamente. Los resultados obtenidos permiten concluir que S. acidophilus no fue capaz de aumentar la tasa de recuperación de cobre, lo que se evidenció por obtener una tasa menor a la obtenida en el experimento control (sin microorganismo), a la misma temperatura de estudio. Esto debido a la mayor precipitación de jarositas en el cultivo inoculado, lo que pasivó el mineral. Estos resultados darían cuenta que los experimentos con S. acidophilus corresponderían a una lixiviación química y el aumento de éste rendimiento se atribuye al aumento de la temperatura de 30 a 45ºC, lo que aceleraría la reacción química.

Ingeniera Civil en Biotecnología / Ingeniera Civil Química / Este trabajo se enmarca en el contexto de la creciente industria de los fertilizantes fosfatados y su principal materia prima el ácido fosfórico, este ácido se obtiene en su mayor parte del ataque vía húmeda de la roca fosfórica con ácido sulfúrico. El presente trabajo contribuye al estudio de viabilidad y factibilidad de biolixiviación de fosfatos requerido por la empresa minera VALE S.A. El objetivo principal es estudiar la toxicidad que puedan presentar algunos de los distintos iones presentes en la solución obtenida de la lixiviación química de una muestra de mineral fosfatado, sobre la cepa Sulfobacillus thermosulfidooxidans. Se realizó un primer estudio de la toxicidad de los iones presentes en la solución obtenida de la lixiviación química, ajustada a 3 diferentes pH que se encuentran dentro del rango de operación del pH en pilas de lixiviación: 1,4; 1,8 y 2,03 . A estos cultivos se les monitoreó el pH, concentración de ion sulfato, concentración de ácido sulfúrico y se hizo recuento de células con el marcador fluorescente DAPI. De este estudio se concluyó que el crecimiento y actividad bacteriana fueron completamente inhibidos. Además se identificaron como posibles inhibidores el ion sulfato y el ion fosfato, iones que se encuentran en altas concentraciones. Un segundo estudio de biooxidación de azufre se realizó en presencia de concentraciones de ion sulfato crecientes, como sulfato de potasio (K_2 SO_4 ) con pH inicial 2,3. El objetivo fue determinar las concentraciones críticas de este ion a las que la actividad bacteriana se reduce al 50% y a la que es completamente inhibida. De este estudio se concluye que con una concentración de 70 mM de sulfato de potasio, la conversión de azufre elemental a ácido sulfúrico por parte de las bacterias se ve reducido al 50% de la conversión en un medio basal en ausencia de la sal. Y a los 200 mM de sulfato de potasio, la conversión se ve inhibida completamente. Finalmente, se realizó un estudio preliminar de la actividad bacteriana en presencia de una concentración de 12 [g⁄L] de ion fosfato y pH 2,3. Al cual se le monitorea solo la evolución del pH. Este estudio permite inferir que esta concentración resultaría tóxica para las bacterias, resultado que necesita ser confirmado mediante un estudio más exhaustivo.

Ingeniera Civil en Biotecnología / Ingeniera Civil Química / El presente trabajo de título tiene como principal objetivo caracterizar el comportamiento de la bacteria termófila moderada Sulfobacillus thermosulfidooxidans en la biooxidación de azufre elemental, para de esta forma contribuir a una mejor comprensión del comportamiento de este microorganismo en la producción de ácido sulfúrico; evalúa para ello su capacidad de oxidación y adherencia al azufre elemental con el objetivo de poder investigar la factibilidad técnica de la producción de ácido sulfúrico con este microorganismo a nivel industrial. Para lo anterior se utilizaron cultivos puros de Sulfobacillus thermosulfidooxidans en matraces agitados a 45°C en azufre en perlas estériles, con extracto de levadura. Se monitorearon periódicamente el pH, la concentración de ácido sulfúrico y sulfato en solución. Junto con lo anterior, se realizó el recuento de las células planctónicas y adheridas al azufre por medio de tinción DAPI, observación y recuento en un microscopio de Epifluorescencia. Los resultados indicaron que el proceso de biooxidación de azufre elemental con Sulfobacillus thermosulfidooxidans depende en gran medida de la concentración de las bacterias en la superficie del azufre, lo cual permitió el desarrollo de un modelo para que describe la cinética de este proceso. Con el modelo se estimo que el proceso es controlado principalmente por la difusión del oxigeno en el biofilm, requiriéndose 2000 horas para la completa oxidación del azufre. Asimismo, demostró que esta bacteria termófila moderada posee una alta capacidad azufre-oxidante, alcanzándose a las 312 horas de cultivo una concentración de 10,54 [g/L] de ácido sulfúrico. Junto con lo anterior, se demostró que S. thermosulfidooxidans posee un porcentaje de adherencia de 54% a la superficie del azufre elemental, además de un elevado crecimiento celular, tanto en la superficie del azufre como en la solución, cuantificándose a las 216 horas de cultivo 6,6x1011 y 2,9x1012 bacterias en suspensión y adheridas respectivamente, correspondientes al máximo número de microorganismos registrados. Por último, se determinó que el mecanismo por el cual estas bacterias oxidan el azufre es el mecanismo de lixiviación cooperativo, ya que tanto las bacterias planctónicas como las adheridas contribuyen a la oxidación del azufre elemental.

Thesis (MSc (Microbiology))--Stellenbosch University, 2008. / Members of the genus Sulfobacillus form an important part of the microbial consortia that are active in the biooxidation of sulphide ores in biomining processes, yet very little is known about these industrially important organisms. The study of sulfobacilli, and other biomining organisms, is hampered by the absence of effective gene cloning and inactivation systems. During this study, the groundwork was laid for the development of a genetic system for the genus Sulfobacillus. The plasmid diversity present in industrial and environmental isolates of sulfobacilli was assayed. Plasmids were plentiful in the assayed strains, providing the basis for development of cloning vectors for sulfobacilli. Plasmid DNA isolated from Sulfobacillus thermosulfidooxidans strain DSM 9293T was methylated at dam and dcm sites. Whether the methylase enzymes responsible for this methylation pattern form part of restriction-methylation systems or only play a regulatory role is unknown, but it does indicate the appropriate methylation state of DNA for the transformation of this strain. The DNA sequences of three plasmids originating from sulfobacilli were analysed and compared. There was no significant similarity between the three plasmid sequences, indicating diversity in plasmid genetic load and replication mechanisms. Plasmid pSulfBC1 was predicted to replicate via the rolling circle mechanism, while the replication mechanisms of pKara and pTHWX could not be predicted from sequence data. Two antibiotics, chloramphenicol and tetracyline, were found to be suitable for selection of Sulfobacillus transformants. E. coli – Sulfobacillus shuttle vectors were constructed using the Sulfobacillus plasmid, pKara, as the backbone with a Gram-positive chloramphenicol resistance marker and appropriate elements allowing replication in, and mobilization from, E. coli. These shuttle vectors were used in the evaluation of electroporation and conjugation as methods for the delivery of DNA to Sulfobacillus. Transformants of sulfobacilli could not be obtained by either transformation method, although some progress was made towards determining the optimal conditions for both methods. The most promising finding was that cells of E. coli and Sulfobacillus could be maintained on the same medium for a theoretically sufficient time to allow mating. It is likely that Sulfobacillus transconjugants can be obtained with the right combination of donor, mobilizable vector, selectable marker and treatment to neutralize restriction systems.

Thesis (MSc)--University of Stellenbosch, 2004. / ENGLISH ABSTRACT: Thirteen Sulfobacillus strains from different geographical locations and two Alicyclobacillus strains were included in this study. These organisms proved to be moderately thermophillic (two different sets of optimal temperatures of 45°C and 55°C were found), Gram-positive, endospore forming bacteria. The pH optima of the strains tested was pH 2.5 and the pH range lay between pH 1.5 and pH 5.0. It was established that some strains of Sulfobacillus had the capacity for anaerobic growth when using ferric iron as an electron donor. It was determined that S. thermosuljidooxidans was the species found within South African biooxidation plants. Plasm ids were identified within strain 611 (S. thermosuljidooxidans) isolated from a Billiton commercial plant. The sample of Sulfobacillus strains used in this study could clearly be divided into two groups based on the analysis of their 16S rRNA gene sequences as well as the number of ribosomal (rm) operons present as determined by Southern hybridization. A system for the convenient identification of Sulfobacillus species was developed using several of the techniques employed in this study. Preliminary identifications can be obtained by restriction enzyme digestion of the PCR amplified 16S rRNA gene. Confirmation of this placement can be done by comparison of the 16S - 23S rRNA spacer region amplification band sizes. Once the preliminary identification has been completed it is possible to place the isolate in the correct species by making use of the differences in sugar utilization that the species exhibit. The more laborious method of 16S rRNA sequence comparisons can be undertaken if there is still any uncertainty as to which species an isolate belongs to. Phylogenetic results obtained from the 16S rRNA gene sequence indicates that the genus Sulfobacillus should probably be divided into two individual genera. Further information gathered from the phylogenetic comparisons indicates that strain Riv-14 previously assigned to S. ambivalens is more closely related to S. montseratensis. Data obtained from 16S - 23S rRNA spacer region analysis confirms this result. Future work includes the use of DNA-DNA hybridization studies and mol% G+C ratio's in order verify the presence of two distinct genera as well as placing Riv-14 within the correct species. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Dertien isolate van die genus Sulfobacillus afkomstig van geografies verskillende areas en twee isolate van die genus Alicyclobacillus is in die studie ingesluit. Hierdie organismes het gewys dat hulle gematigde termofiele (twee verskillende groepe met optimale temperature van 45°C en 50°C elk was waargeneem), Gram-positiewe, endospoorvorrnende organismes is. Die pH optima van die isolate was pH 2.5 en die reeks van pH waar groei moontlik was het tussen pH l.5 en pH 5.0 gelê. Dit was bewys dat sekere van die Sulfobacillus isolate oor die vermoë beskik het om anaerobies te respireer deur ferri yster (Fe3+) as elektron akseptor te gebuik. Dit was bepaal dat S. thermosulfidooxidans die spesies is wat teenwoordig was in die bio-oksidasie reaktors in Suid Afrika. Plasmiede vanuit die isolaat 611 (s. thermosulfidooxidans) afkomstig vanuit 'n Billiton komersieële reaktor, is geidentifiseer. Die toetsmonster van Sulfobacillus isolate gebruik in hierdie studie het duidelik daarop gewys dat daar twee groepe binne Sulfobacillus is. Hierdie stelling is gebaseer op data afkomstig van die analiese van die 16S rRNA volgorde asook die aantal ribosomale (rm) kopieë teenwoordig soos bepaal deur Southern klad eksperimente. 'n Sisteem vir die maklike identifikasie van Sulfobacillus spesies is ontwerp deur van verskeie tegnieke, soos in hierdie studie toegepas, gebruik te maak. Aanvanklike identifikasie kan verkry word deur gebruik te maak van restriksie ensiem vertering van PKR geamplifiseerde 16S rRNA geen. Hierdie plasing van die isolaat kan bevestig word deur die grootte van die 16S - 23S rRNA intergeniese amplifikasie produkte te vergelyk. Sodra die aanvanklike plasing van die isolaat voltrek is, kan daar van die verskille in die vermoëns van die spesies om sekere suikers the benut, gebruik gemaak word om die isolaat binne die regte spesies te plaas. Die meer werksintensiewe metode van 16S rRNA volgorde vergelyking kan gebruik word indien daar enige onsekerheid is oor by watter spesies die isolaat hoort. Filogenetiese resultate verkry van die vergelyking van die 16S rRNA geen volgorde dui daarop aan dat die genus Sulfobacillus waarskynlik uit meer as een genus bestaan. Die filogenetiese data dui verder daarop dat die isolaat Riv-14 wat as 'n S. ambivalens geklassifiseer is, nader verwant is aan die spesies S. montseratensis. Data verkry vanaf die 16S - 23S intergeniese gebied analiese bevestig hierdie resultaat. Toekomstige werk sluit DNA-DNA hibridisasie en mol% Gte ratio eksperimente in om sodoende die teenwoordigheid van meer as een genus sowel as die plasing van Riv-14 in die korrekte spesies te bevestig.

Thesis (MSc)--University of Stellenbosch, 2007. / ENGLISH ABSTRACT: The arsenic resistance operon (ars operon) of the Gram-positive, iron-oxidizing, acidophilic, moderately thermophilic bacterium, Sulfobacillus thermosulfidooxidans VKM B-1269T (Sb. t. VKM B-1269T), was isolated and characterised. The ars operon was chromosomally located and consisted of an arsR (codes for a transcriptional regulator) and an arsB (codes for a membrane located arsenic/antimony efflux pump). The arsRB genes were transcribed in the same direction. An arsC (codes for an arsenate reductase), usually associated with ars operons, was absent from this ars operon. PCR and Southern-hybridization experiments revealed that no arsC, representative of either the Grx/GSH or Trx ArsC families was present in the genome of Sb. t. VKM B-1269T. An interesting feature of the ars operon was the presence of a gene encoding a 525 amino acid (60.83 kDa) kumamolisin-As precursor located upstream of the arsRB operon. The intergenic region between the termination end of the kumamolisin-As precursor gene and the transcriptional start of the arsR gene was only 77 bp, suggesting that this ars operon might consist of three genes. RT-PCR analysis showed that the ars operon of Sb. t. VKM B-1269T, was not co-transcribed with the kumamolisin-As precursor gene in its native Sulfobacillus host. The ars operon of Sb. t. VKM B-1269T did not complement an Escherichia coli arsenic sensitive mutant. mRNA transcript analysis and promoter expression studies confirmed that processes involved in the production of functional proteins from the ars operon transcript were likely to be responsible for the inability of the arsRB operon of Sb. t. VKM B-1269T to confer resistance to arsenic in the heterologous E. coli host. Eight Sulfobacillus strains isolated from different geographical areas were subjected to amplified ribosomal DNA restriction enzyme analysis (ARDREA) using the restriction endonuclease Eco1015 (SnaBI) and revealed that they could be divided into the proposed Sulfobacillus spp. subgroup I and subgroup II, respectively (Johnson et al., 2005). The presence, distribution and relatedness of the ars genes among members of genus Sulfobacillus was determined. Phylogenetic sequence comparisons revealed two clearly defined arsB clusters within genus Sulfobacillus and showed that the arsB of a specific Sulfobacillus sub specie is distinctive of that specific Sulfobacillus sub specie. Futhermore, sequence analysis of the isolated arsB homologue fragments from the respective Sulfobacillus spp. showed that four distinctive profiles could be identified based on differences in the location of restriction endonuclease recognition sites. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Die arseen weerstandbiedendheidsoperon (ars operon) van die Gram-positiewe, ysteroksiderende, asidofiliese, matige termofiliese bakterium, Sulfobacillus thermosulfidooxidans VKM B-1269T (Sb. t. VKM B-1269T), was geïsoleer en gekarakteriseer. Die ars operon was op die chromosoom geleë en het uit ‘n arsR (kodeer vir ‘n transkripsionele reguleerder) en ‘n arsB (kodeer vir ‘n membraan geleë arseen/timien uitskeidings pomp) bestaan. Die arsRB gene word in dieselfde rigting getranskribeer. ‘n arsC (kodeer vir ‘n arsenaat reductase), wat gewoontlik geassosïeer word met ars operons, was afwesig van hierdie ars operon. PKR en Southern-hibridisasie eksperimente het aangedui dat geen arsC, verteenwoordigend van beide die Grx/GSH of Trx ArsC families, nie teenwoordig was in die genoom van Sb. t. VKM B-1269T, nie. ‘n Interressante eienskap van hierdie ars operon was die teenwoordigheid van ‘n geen wat stroom-op van die arsRB operon geleë is en ‘n 525 amino suur (60.83 kDa) kumamolisin-As voorloper kodeer. Die intergeniese gedeelte tussen die terminerings einde van die kumamolisin-As voorloper en die transkriptionele begin van die arsR geen was slegs 77 bp, wat voorgestel het dat die ars operon moontlik uit drie gene bestaan. RT-PKR analiese het bewys dat die ars operon van Sb. t. VKM B-1269T, nie geko-getranskribeer word met die kumamolisin-As voorloper in sy oorspronklike Sulfobacillus gasheer nie. Die ars operon van Sb. t. VKM B-1269T, het nie ‘n Escherichia coli arseen sensitiewe mutant gekomplimenteer nie. mRNA transkrip-analiese en promoter uitdrukkings eksperimente het bevestig dat prosesse wat betrokke is in die produksie van funksionele proteïene vanaf die ars operon transkrip, moontlik vir die onvermoë van die arsRB operon van Sb t. VKM B-1269T verantwoordelik was om weerstandbiedendheid teen arseen in die heteroloë E. coli gasheer te verleen. Agt Sulfobacillus stamme wat geïsoleer is vanuit verskillende geografiese areas, was onderhewig aan geamplifiseerde ribosomale DNA restriksie-ensiem-analiese (ARDREA) deur gebruik te maak van restriksie endonuklease Eco1015 (SnaBI) en het aangedui dat hulle in die voorgestelde Sulfobacillus spp. subgroup I en subgroup II ingedeel kan word (Johnson et al., 2005). Die aanwesigheid, verspreiding en verwantskappe van die ars gene tussen lede van genus Sulfobacillus was bepaal. Filogenetiese DNA volgorde vergelykings het aangedui dat twee duidelik definïeerbare arsB groepe van mekaar onderskei kan word en dat die arsB van ‘n spesifieke Sulfobacillus sub spesie uniek tot daardie spesifieke Sulfobacillus subspesie is. Bykomend, DNA volgorde analiese van die geïsoleerde arsB homoloog fragmente van die Sulfobacillus spp. het gewys dat vier unieke profiele, op grond van verskille in die ligging van restriksie ensiem herkenning setels, geïdentifiseer kan word.