Orientadore: Laura Maria Mariscal Ottoboni, Fernanda de Castro Reis / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T13:23:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Madureira_DanielleJannuzzi_M.pdf: 2040876 bytes, checksum: f7135c29454428e52c585317e3d024c4 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Acidithiobacillus ferrooxidans e Acidithiobacillus thiooxidans são espécies bacterianas acidofilicas, quimiolitotróficas e mesofilicas, encontradas em ambientes de biolixiviação. A. ferrooxidans utiliza íons ferrosos e compostos que contém enxofte como doadores de elétrons enquanto que A. thiooxidans utiliza apenas enxofte e compostos contendo enxofte. Ambas as espécies utilizam principalmente o oxigênio como receptor final de elétrons, contudo, podem também crescer em ambientes de anaerobiose. A. thiooxidans possui maior resistência ao pH podendo ser encontrada em ambientes com pH variando de 0,5 a 5,0, enquanto que A.ferrooxidans é encontrada em pHs que variam de 1,0 a 2,5. Devido a essas características e devido a capacidade dessas bactérias de solubilizar metais, A. ferrooxidans e A. thiooxidans vem sendo utilizadas em experimentos de biolixiviação. Este processo é utilizado na indústria para recuperação de cobre devido às vantagens oferecidas. Entretanto, pouco se sabe sobre a resposta gênica destas bactériaS a presença de sulfetos metálicos e dos metais pesados em solução proveniente do processo de oxidação. Na primeira parte deste trabalho foi analisada a resposta gênica da estirpe de A. ferrooxidans LR na presença e na ausência de covelita (CuS) por 24 horas através da técnica de RAP-PCR (Random Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction). Foram obtidos 19 cDNAs com expressão diferencial, dos quais 12 foram confirmados como sendo diferencialmente expressos. Dentre estes, foram isolados sete genes que codificam: proteínas de transporte (AFE 0123, AFE ,0989, AFE 0990, AFE 0580, AFE 0671, AFE 2248 e AFE 1149), a proteína diguanilato ciclase, uma proteína de membrana, uma metiltnmsferase e uma ATPase, todas induzidas na presença da covelita. Apenas o gene infC, que codifica um fator de iniciação de tradução tipo 3, teve sua expressão reprimida na presença de covelita. Como sete dos genes diferencialmente expressos pertenciam à classe de transportadores, foram investigadas às modificações químicas presentes no meio de cultura após 24 horas. Análises de absorção atômica mostraram que a quantidade de' co1?rê em solução inicialmente zero passava para aproximadamente 1,13 g/L e medidas de pH mostraram que após este período de tempo houve mudanças de 1,8 para 4,0. Pode-se sugerir que essas alterações químicas sejam responsáveis, pelo menos em parte, pela indução dos genes que codificam proteínas de transporte. Uma análise in silico da interação entre proteínas (PPI) relacionadas com transporte, cujos genes foram diferencialmente expressos na presença de covelita e de proteínas pertencentes à mesma categoria funcional, codificadas por genes que estavam fisicamente localizados nas proximidades dos genes diferencialmente expressos, mostraram que os genes de transporte podem estar envolvidos em diferentes etapas da resposta bacteriana à presença de covelita. A segunda parte deste trabalho teve como objetivo estudar a expressão diferencial, por PCR em tempo real, de duas proteínas do tipo ABC (AFE 0123 e AFE 0125) e uma proteína do tipo RND (AFE 0993) na estirpe de A. thiooxidans FGOl na presença de calcopirita (CuFeS2), covelita e pirita (FeS2) por 24 horas. Para tal, a estirpe foi crescida na presença de enxofte e depois mantida na presença dos sulfetos metálicos por 24 horas. A expressão dos três genes foi induzida na presença de covelita e inalterada na presença de calcopirita. Na presença de pirita, a expressão de dois genes foi reprimida e do gene AFE 0993, permaneceu inalterada. Estes resultados podem ser explicados, pelo menos em parte, pelas quantidades de cobre encontradas em solução na presença de covelita (l g/L) e na presença de calcopirita (0,07 g/L). Na presença de covelita e calcopirita a medida de pH também softeu aumento de 1,8 para 4,0 e 2,5, respectivamente. Para investigar se a alteração de pH ou a presença de íons de cobre eram os responsáveis pela indução da expressão desses genes, a bactéria foi mantida na presença de sulfato de cobre (16 mM) e pH 4,0 por 24 horas. Os resultados mostraram que a presença de cobre em solução induz a expressão destes genes, enquanto que a alteração do pH não / Abstract: Acidithiobacillus ferrooxidans and Acidithiobacillus thiooxidans are acidophilic, chemolitotrophic and mesophilic bacteria found in bioleaching environments. A. ferrooxidans uses ferrous iron and sulphur compounds as an e1ectron donor and A. thiooxidans uses on1y sulphur and sulphur compounds. Both species are aerobic using oxygen as final e1ectron acceptor. However, these bacteria are also able to grow in anaerobic environments. A. thiooxidans is able to survive in pHs ranging from 0.5 to 5.0 while A. ferrooxidans grows in pHs from 1.0 to 2.5. Due to these characteristics and the ability of these bacteria to solubilize metal sulphides, A. ferrooxidans and A. thiooxidans are used in bioleaching. This process has several advantages over the traditional methods and has been used with success in industrial operations to recover main1y copper. However, little is known about the genetic response of these bacteria to the presence of metal sulphides and heavy metal in solution. Therefore, in the first part of this study the A. ferrooxidans LR 'response to covellite was investigated. This bacterium was maintained in contact with covellite for 24 hours and the differentially expressed cDNAs were identified by RAP-PCR (Random Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction) technique. Nineteen cDNAs showed a differential expression and twe1ve had their differential expression confirmed by real time PCR. Among these cDNAs, seven codified for transporter proteins (AFE 0123, AFE 0989, AFE 0990, AFE 0580, AFE 0671, AFE 2248 and AFE 1149), one codified for a putative diguanylate cyc1ase, one for a membrane. protein, one for a methyltransferase and one for an A TPase. With the exception of infC whose expression was down regulated, all the oDNAs had their expression up regulated in the presence of covellite. Since most of the differentially expressed genes are involved in transport, chemical modifications on the culture medium after 24 hours were investigated. The atomic absorption analysis showed that the copper amount in solution was 1.13 g/L and pH changed from 1.8 to 4.0 suggesting that these changes are responsible, at least in part, for the induction,"?f1he expression of transport gene. An in si/ico ana1ysis of protein-protein interaction (PPI) between the transport proteins codified by the genes differentially expressed in the presence of covellite and those codified by genes that were physically located around the differentially expressed ones showed that these transport proteins could be involved in different steps of the bacterial response to covellite. The goal of the second part of this study was to analyse the differential expression, by real time PCR, of two ABC proteins (AFE 0123 andAFE 0125) and one RND protein (AFE 0993) inA. thiooxidans FGOl in the presence of chalcopyrite, covellite and pyrite for 24 hours. This strain was maintained in contact with the metal sulphides for 24 hours. The expression ofthe three genes was up regulated in the presence of covellite and unchanged in the presence of chalcopyrite. In the presence of pyrite two genes hOO their expression down regulated and in one (AFE 0993) the expression was unchanged. These results can be explained, at least in part, by the quantities of copper found in solution in covellite (1 g/L) and in chalcopyrite (0.07 g/L). In the presence of covellite and chalcopyrite the pH changed from l'.8 to 4.0 and 2.5, respectively. To investigate if the changes in pH or the presence of copper ions in solution were responsible for the induction of the gene expressions, the bacteria were maintained in the presence of copper sulphate (16 mM) and pH 4.0 for 24 hours. The results showed that the presence of copper in solution was the responsible for the up regulation ofthese genes / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Laura Maria Mariscal Ottoboni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T19:02:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Verde_LeandroCostaLima_M.pdf: 22357047 bytes, checksum: a920490b43f710509a803be1562c34e3 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Acidithiobaci/lus ferrooxidans é uma bactéria Gram negativa, mesofilica, acidofilica, quimiolitotrófica, capaz de obter energia da oxidação do íon ferroso, enxofre ou compostos reduzidos de enxofre. É um dos principais microrganismos responsáveis pela lixiviação de metais, podendo ser utilizada em processos industriais para obtenção de cobre, urânio ou metais preciosos, a partir de minérios de baixo teor. Na primeira parte deste projeto foi analisada a expressão diferencial de genes, através de RAP-PCR., em células de A. ferrooxidans mantidas na presença dos sulfetos metálicos bomita e calcopirita por 24 horas. Dezoito cDNAs com expressão diferencial foram identificados. Esses cDNAs tiveram a expressão diferencial confirmada e caracterizada por PCR em tempo real. Na presença de bomita, nenhum dos genes foi reprimido, e dentre os induzidos estão os envolvidos na síntese de proteínas. Na presença de calcopirita, cinco genes envolvidos no pr~cessamento de proteínas foram reprimidos e cinco genes envolvidos no sistema de transporte foram induzidos. A expressão diferencial desses genes na presença dos dois sulfetos de cobre pode ser devido a alterações do pH, a presença de íons de cobre em solução e a limitação de nutrientes. Dentre os genes com expressão mais acentuada na presença de calcopirita, foi encontrado um que codifica uma proteína receptora dependente de TonB. Esta proteína está envolvida no sistema de captação de Fe3+. Na segunda parte deste trabalho foi feita uma análise do genoma de A. ferrooxid.ans. Esta análise mostrou que o gene que codifica a proteína receptora dependente de TonB se encontra agrupado com outros seis genes envolvidos com o sistema de captação de Fe3+. A expressão destes genes foi analisada porPCR em tempo real em células de A. ferrooxidans mantidas por 24 horas na presença de bomita e calcopirita. Os resultados mostraram que a expressão dos genes é induzida na presença de calcopirita e inalterada na presença de bomita. Uma possível explicação para isto é a quantidade de ferro que é menor na presença de calcopirita, por ser um minério de dificil oxidação. O sistema de captação de ferro é regulado por uma proteína chamada Fur. Uma análise de bioinformática da região do genoma onde se encontram os genes envolvidos na captação de Fe3+ mostrou a existência de três novas regiões de regulação, denominadas de box Fur. Uma análise no banco de dados de domínio conservado (CDD - NCBI) revelou que o receptor dependente de TonB analisado neste trabalho pertence à família de receptores CirA / Abstract: Acidithiobacillus ferrooxidans is a Gram-negative, mesophilic, acidophilic, chemolithoautotrophic bacterium that obtains energy from the oxidation of ferrous iron, elemental sulfur and reduced sulfur compounds. A. ferrooxidans is one of the most used microorganisms in bioleaching, an industrial process used for the recovery of copper, uranium or gold, fiom lowgrade ores. In the first part of this project the differentially expressed cDNAs were isolated by RAP-PCR from A. ferrooxidans cells maintained for 24 hours in the presence of the metal sulfides bomite and chalcopyrite. A total of 18 differentially expressed cDNAs were isolated. The differential expression of the cDNAs was confirmed by real time PCR. The results showed that these genes were not down-regulated in the presence of bomite and among the up-regulated genes were those involved in protein synthesis. In the presence of cha1copyrite, five genes related to p~otein processing ~ere down-regulated, and another five genes related to transport were upregulated. The up- and down-regulation of genes in the presence of bomite and chalcopyrite could be due to alterations in the ideal pH, the presence of copper ions in solution and nutrient limitation. Among the genes that were up-regulated in the presence of chalcopyrite, was one that encodes for a TonB-dependent receptor. This protein is part of a system involved in Fe3+ uptake. An analysis of the A. ferrooxidans genome was performed in the second part of this work and showed that the gene that encodes for !he TonB-dependent receptor is clustered with six other genes fiom the Fe3+ uptake system. The relative expression pattem of lliese genes was investigated by real time PCR in A. ferrooxidans cells maintained for 24 h iri, the presence of bomite and chalcopyrite. The results.showed that the expression of the genes is up-regulated in the presence of chalcopyrite and unchanged in the presence of bomite. A possible explanation for this is the amount of iron in solution that was smaller in the presence of chalcopyrite, since this copper sulfide is very refractory. The iron uptake genes are regulated by a protein named Fur. A bioinformatics analysis of the genomic region where these genes were found revealed the existence of three new Fur boxes. An analysis on the Conserved Domain Database (CDD NCBI) revealed that the TonB-dependent receptor belongs to the CirA family of receptors / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Genética e Biologia Molecular