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Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_karine_begnini.pdf: 1622668 bytes, checksum: 238f06c82a5dce8f22542c15f37944f4 (MD5) Previous issue date: 2012-02-15 / Bacillus Calmette-Guerin (BCG) is one of the great success stories of immunotherapy as a treatment for superficial urothelial carcinoma of the bladder. The high incidence of local side effects and presence of non-responder diseases has led to efforts to improve the therapeutic vaccine. Hence, we proposed that an auxotrophic recombinant BCG strain overexpressing Ag85B (BCG ΔleuD/Ag85B), could enhance cytotoxicity to the human bladder carcinoma cell line (5637). This rBCG was generated by incorporating an expression plasmid encoding the mycobacterial antigen Ag85B into the BCG ΔleuD strain. The inhibitory effect of BCG ΔleuD/Ag85B in 5637 cells was determined by the MTT method, morphology observation and the LIVE/DEAD assay. Gene expression profiles for apoptotic genes, cell cycle-related genes and oxidative stress-related genes were investigated by qRT-PCR. Bax, bcl-2 and p53 induction by BCG ΔleuD/Ag85B treatment were evaluated by Western blotting. BCG ΔleuD/Ag85B revealed a superior cytotoxicity effect than the strains used as controls in this study. The results demonstrated that the expression level of pro-apoptotic and cell cycle-related genes increased after BCG ΔleuD/Ag85B treatment, whereas mRNA levels of antiapoptotic genes decreased. Interestingly, BCG ΔleuD/Ag85B also increased the mRNA level of antioxidant enzymes in bladder cancer cell line. Bax and p53 protein levels were increased by BCG ΔleuD/Ag85B treatment. In conclusion, these results suggested that BCG ΔleuD/Ag85B enhanced cytotoxicity on superficial bladder cancer cells in vitro. The therapeutic model using rBCG may have potential for future clinical application in the treatment of bladder cancer. / O Bacilo Calmette-Guérin (BCG) constitui uma das grandes histórias de sucesso da imunoterapia como tratamento para carcinoma superficial da bexiga. Porém, a alta incidência de efeitos colaterais locais e a ocorrência de tumores resistentes ao tratamento têm impulsionado estudos visando melhorias da vacina terapêutica. Neste trabalho, propusemos que uma cepa auxotrófica de BCG superexpressando o antígeno Ag85B (BCG ΔleuD/Ag85B), é capaz de aumentar a citotoxicidade na linhagem celular humana de carcinoma superficial de bexiga (5637). A cepa de BCG recombinante foi gerada através da incorporação da sequencia do antígeno Ag85B em um plasmídeo de expressão micobacteriano na cepa de BCG ΔleuD. O efeito inibitório do BCGΔleuD/Ag85B em células 5637 foi determinada através das técnicas colorimétricas MTT e LIVE/DEAD, além de observação morfológica. Os perfis de expressão gênica para genes apoptóticos, genes relacionados ao ciclo celular e genes de estresse oxidativo foram avaliados por qRT-PCR. Os níveis protéicos de bax, bcl-2 e p53 foram avaliados por western blot. O BCG ΔleuD/Ag85B revelou citotoxicidade superior às cepas utilizadas como controle neste estudo. Os resultados obtidos demonstram níveis superiores de expressão de genes pró-apoptóticos e de genes relacionados com o ciclo celular após tratamento com BCG ΔleuD/Ag85B. Níveis inferiores de mRNA de genes antiapoptóticos foram detectados após o mesmo tratamento. Ainda, o tratamento com BCG ΔleuD/Ag85B também elevou os níveis de mRNA de enzimas antioxidantes em linhagem de células de câncer superficial de bexiga. As proteínas Bax e p53 mostraram-se elevadas após tratamento com BCG ΔleuD/Ag85B. Em conclusão, estes resultados sugerem que a cepa de BCG superexpressando Ag85B é capaz de aumentar a citotoxicidade sobre as células de câncer superficial de bexiga in vitro. Este modelo terapêutico usando BCG recombinante possui potencial para uma futura aplicação clínica em tratamento de câncer de bexiga.