L’entérobactérie Dickeya dadantii est responsable de la maladie de la pourriture molle sur de nombreux hôtes végétaux. Ce symptôme est essentiellement dû à la production d’un arsenal d’enzymes qui dégradent la pectine, ciment des parois des cellules végétales. Parmi ces enzymes, les pectate lyases (Pels) ont un rôle majeur dans le pouvoir pathogène en raison de leur capacité àreproduire, sous forme purifiée, le symptôme de la pourriture molle. La synthèse des Pels est soumise à un contrôle très fin qui fait intervenir différents régulateurs agissant de manière intégrée via un réseau de régulation. De nombreuses conditions environnementales modulent la synthèse des Pels via l’action de ces régulateurs. La température est un facteur qui agit sur leur synthèse et pour lequel les mécanismes moléculaires restaient non élucidés. Lors de cette étude, nous avons montré que le régulateur PecT, un répresseur du réseau de régulation, intervient dans la thermorégulation de la synthèse des Pels. PecT s’est avéré être également impliqué dans la thermorégulation de deux autres fonctions de virulence : la mobilité et la synthèse desexopolysaccharides de surface. La quantification des transcrits des gènes de ces 3 fonctions de virulence a permis de montrer que l’action de PecT dans ce contrôle a lieu au niveau transcriptionnel. Le mécanisme moléculaire de la thermorégulation exercée par PecT a été étudié plus en détail sur les gènes pel. Des résultats obtenus in vivo ont montré que la fixation de PecT sur les régionsrégulatrices des gènes pel est plus efficace quand la température augmente. La croissance de D. dadantii à hautes températures induit un relâchement de l’ADN. De manière remarquable, un relâchement artificiel de l’ADN par un traitement inhibant la gyrase entraine une augmentation de la fixation de PecT sur les gènes pel même pour des cellules cultivées à basses températures. De plus, la délétion de PecT se traduit par une augmentation de la capacité de D. dadantii à induire la pourriture molle à hautes températures. Ainsi la topologie de l’ADN et PecT agissent de manière concertée pour moduler la synthèse des Pels en fonction de la température.L’ensemble de ces données apporte une preuve supplémentaire de l’importance de la dynamique structurale de la chromatine dans l’ajustement de la physiologie bactérienne en réponse aux variations des conditions environnementales. / Bacteria are colonizers of various environments and host organisms, and they are often subjected to drastic temperature variations. Dickeya dadantii is a Gram-negative pathogen infecting a wide range of plant species. Soft rot, the visible symptom, is mainly due to the production of pectate lyases (Pels) that can destroy the plant cell walls. Production of Pels is controlled by a complex regulation system and responds tovarious stimuli, such as presence of pectin, plant extracts, growth phase, temperature or iron concentration. Although many studies have been carried out, the mechanisms of control of Pels production by temperature have not yet been elucidated. In bacteria, thermoregulation acting at the level of transcription initiation occurs usually both via transcription factors and DNA topology. We show that PecT, a previously identified repressor, is involved in the thermoregulation of the pel gene expression. Using in vivo Chromatin ImmunoPrecipitation (ChIP) coupled to quantitative RT-PCR(qRT-PCR), we reveal that PecT binding to the pel gene promoters is modulated by temperature. By manipulating the DNA topology in vivo, we further show that DNA supercoiling state is involved in the thermoregulation of pel gene expression by PecT. In addition, we show that the development of the pathogenicity of the pecT mutant according to changes in temperature is different from that of the parental strain. This report presents a new example of how plant pathogenic bacteria use transcription factor and DNA topology to adjust synthesis of virulence factors in response to temperature variation.

Les topoisomérases I (topA) et III (topB) sont les deux topoisomérases (topos) de type IA d’Escherichia coli. La fonction principale de la topo I est la relaxation de l’excès de surenroulement négatif, tandis que peu d’information est disponible sur le rôle de la topo III. Les cellules pour lesquelles les deux topoisomérases de type IA sont manquantes souffrent d’une croissance difficile ainsi que de défauts de ségrégation sévères. Nous démontrons que ces problèmes sont majoritairement attribuables à des mutations dans la gyrase qui empêchent l’accumulation d’excès de surenroulement négatif chez les mutants sans topA. L’augmentation de l’activité de la gyrase réalisée par le remplacement de l’allèle gyrB(Ts) par le gène de type sauvage ou par l’exposition des souches gyrB(Ts) à une température permissive, permet la correction significative de la croissance et de la ségrégation des cellules topos de type IA. Nous démontrons également que les mutants topB sont hypersensibles à l’inhibition de la gyrase par la novobiocine. La réplication non-régulée en l’absence de topA et de rnhA (RNase HI) augmente la nécessité de l’activité de la topoisomérase III. De plus, en l’absence de topA et de rnhA, la surproduction de la topoisomérase III permet de réduire la dégradation importante d’ADN qui est observée en l’absence de recA (RecA). Nous proposons un rôle pour la topoisomérase III dans la ségrégation des chromosomes lorsque l’activité de la gyrase n’est pas optimale, par la réduction des collisions fourches de réplication s’observant particulièrement en l’absence de la topo I et de la RNase HI. / E. coli possesses two type IA topoisomerases (topos), namely topo I (topA) and topo III (topB). The major function of topo I is the relaxation of excess negative supercoiling. Much less is known about the function of topo III. Cells lacking both type IA topos suffer from severe chromosome segregation and growth defects. We show that these defects are mostly related to the presence of gyrase mutations that prevent excess negative supercoiling in topA null mutants. Indeed, increasing gyrase activity by spontaneous mutations, by substituting a gyrB(Ts) allele for a wild-type one or by exposing cells carrying the gyrB(Ts) allele to permissive temperatures, significantly corrected the growth and segregation defects of cells lacking type IA topo activity. We also found that topB mutants are hypersensitive to novobiocin due to gyrase inhibition. Our data also suggest that unregulated replication occurring in the absence of topA and rnhA (RNase HI) exacerbates the need for topo III activity. Moreover, when topA and rnhA were absent, we found that topo III overproduction reduced the extensive DNA degradation that took place in the absence of recA (RecA). All together, our results lead us to propose a role for topo III in chromosome segregation when gyrase activity is suboptimal, thus reducing replication forks collapse, especially when replication is unregulated due to the absence of topo I and RNase HI.

Les topoisomérases I (topA) et III (topB) sont les deux topoisomérases (topos) de type IA d’Escherichia coli. La fonction principale de la topo I est la relaxation de l’excès de surenroulement négatif, tandis que peu d’information est disponible sur le rôle de la topo III. Les cellules pour lesquelles les deux topoisomérases de type IA sont manquantes souffrent d’une croissance difficile ainsi que de défauts de ségrégation sévères. Nous démontrons que ces problèmes sont majoritairement attribuables à des mutations dans la gyrase qui empêchent l’accumulation d’excès de surenroulement négatif chez les mutants sans topA. L’augmentation de l’activité de la gyrase réalisée par le remplacement de l’allèle gyrB(Ts) par le gène de type sauvage ou par l’exposition des souches gyrB(Ts) à une température permissive, permet la correction significative de la croissance et de la ségrégation des cellules topos de type IA. Nous démontrons également que les mutants topB sont hypersensibles à l’inhibition de la gyrase par la novobiocine. La réplication non-régulée en l’absence de topA et de rnhA (RNase HI) augmente la nécessité de l’activité de la topoisomérase III. De plus, en l’absence de topA et de rnhA, la surproduction de la topoisomérase III permet de réduire la dégradation importante d’ADN qui est observée en l’absence de recA (RecA). Nous proposons un rôle pour la topoisomérase III dans la ségrégation des chromosomes lorsque l’activité de la gyrase n’est pas optimale, par la réduction des collisions fourches de réplication s’observant particulièrement en l’absence de la topo I et de la RNase HI. / E. coli possesses two type IA topoisomerases (topos), namely topo I (topA) and topo III (topB). The major function of topo I is the relaxation of excess negative supercoiling. Much less is known about the function of topo III. Cells lacking both type IA topos suffer from severe chromosome segregation and growth defects. We show that these defects are mostly related to the presence of gyrase mutations that prevent excess negative supercoiling in topA null mutants. Indeed, increasing gyrase activity by spontaneous mutations, by substituting a gyrB(Ts) allele for a wild-type one or by exposing cells carrying the gyrB(Ts) allele to permissive temperatures, significantly corrected the growth and segregation defects of cells lacking type IA topo activity. We also found that topB mutants are hypersensitive to novobiocin due to gyrase inhibition. Our data also suggest that unregulated replication occurring in the absence of topA and rnhA (RNase HI) exacerbates the need for topo III activity. Moreover, when topA and rnhA were absent, we found that topo III overproduction reduced the extensive DNA degradation that took place in the absence of recA (RecA). All together, our results lead us to propose a role for topo III in chromosome segregation when gyrase activity is suboptimal, thus reducing replication forks collapse, especially when replication is unregulated due to the absence of topo I and RNase HI.