La polymérase NS5B du virus de l’hépatite C (VHC) porte une activité ARN polymérase ARN-dépendante essentielle pour la réplication de l'ARN génomique viral. Cette réplication implique la synthèse d'un intermédiaire de réplication de polarité négative. In vitro et probablement in vivo, la NS5B initie la synthèse d'ARN par un mécanisme de novo qui nécessite des interactions spécifiques entre la polymérase virale et des éléments des ARN viraux. Dans une première partie nous avons étudié le rôle du GTP et d’un domaine C-terminal nommé linker de la polymérase. Nos résultats démontrent que des concentrations élevées de GTP sont nécessaires pour la transition de l'initiation à l'élongation de la synthèse de l'ARN. Des mutations dans le linker à la position 556 ne modifient pas la concentration de GTP nécessaire pour la transition. Toutefois, l'initiation de la synthèse d'ARN est augmentée par la mutation S556K. Une analyse structurale menée en parallèle suggère une implication directe du linker dans l'initiation de novo de la synthèse de l'ARN. Dans les deuxièmes et troisièmes parties, nous avons étudié le rôle de motifs ARN dans la traduction et la synthèse de l’'ARN du VHC. Nous avons démontré que la tige boucle SL-E1 formée par la région entre les nt 177 et 222 de l'extrémité 3' de l’ARN (-) est importante pour la synthèse d'ARN in vitro par la NS5B recombinante et dans les cellules Huh7 exprimant le complexe de réplication (RC) du VHC. SL-E1 est impliquée dans l’initiation de la synthèse d’ARN, au moins in vitro. Nous avons également étudié le rôle des tiges boucles SLV et SLVI du gène core. Nos données n'ont pas montré de rôle évident de ces séquences ou de leur complément dans la synthèse de l'ARN in vitro par la NS5B recombinante et en culture cellulaire par le RC du VHC. Nous avons confirmé leur effet négatif sur la traduction IRES dépendante par interaction ARN-ARN longue distance entre SL-VI et le 5'UTR et démontré que le miR122 ne peut pas empêcher cet interaction. Par contre, la présence de SL-VI prévient l’inhibition de la traduction induite par l’interaction entre le domaine III de l’IRES et la tige boucle 5BSL3.2 en 3’ du génome. Ces résultats démontrent la complexité des interactions ARN/ARN et ARN/protéines dans la régulation de la réplication virale. / The hepatitis C virus (HCV) NS5B protein displays a RNA-dependent RNA polymerase activity essential for replication of the viral RNA genome. This replication involves the synthesis of a replication intermediate of negative polarity. In vitro and likely in vivo, the NS5B initiates RNA synthesis by a de novo mechanism which requires specific interactions between the polymerase and viral RNA elements. In the first part of results, we described a combined structural and functional analysis of HCV-NS5B to study the role of a C-terminal segment (termed linker) and of GTP in RNA synthesis. Our results demonstrated that high GTP concentrations are necessary for the transition from the initiation to the elongation of RNA synthesis, and that linker mutations at position S556 did not modify the GTP requirement of NS5B for this transition. However, the initiation of RNA synthesis was greatly enhanced by a S556K mutation. These results together with a structural analysis point to the direct involvement of the linker in the de novo initiation of RNA synthesis. In the second and third parts of results, we studied the role of RNA elements in RNA synthesis. We demonstrated that the SL-E1 stem–loop formed by nucleotides 177–222 from the 3’-end of the HCV (-) RNA is important for RNA synthesis both in vitro by the recombinant NS5B and in Huh7 cells by HCV replication complex (RC). We also showed that SL-E1 is involved in initiation of RNA synthesis, at least in vitro. Then we studied the role of other viral RNA elements in core coding sequences (SLV and SLVI stem loops) and the involvement of the microRNA miR122 in RNA translation and RNA synthesis. For SLV and SLVI, our data did not show any clear role of these core-coding sequences or of their complement in the (-) RNA in RNA synthesis both in vitro by the recombinant NS5B and in cell culture by HCV-RC. We confirmed their negative effect on HCV-IRES translation through long range RNA-RNA interaction between SL-VI sequences and the 5’UTR and demonstrated that miR122 cannot disrupted this interaction and switches the region to an open conformation. Conversely, our data indicated that the SL-VI domain can counteract the negative effect of the interaction between the domain III of IRES and the 5BSL3.2 stem loop localized at the 3’end of the genome. These results point to the complexity of RNA/RNA and RNA/proteins interactions in the HCV replication cycle.

Le virus de la dengue cause une maladie de type grippal qui peut dans certains cas évoluer vers des fièvreshémorragiques mortelles. Mon projet de thèse porte sur la réplication de ce virus. Je focalise sur la compréhension du mécanisme d'action de la protéine NS5 de ce virus. La protéine contient 2 domaines : 1) domaine méthyltransférase, essentiel pour la traduction des protéines virales, 2) domaine polymérase, synthétisant le génome ARN du virus. Premièrement, nous avons démontré que la polymérase joue un rôle principal dans la conservation de l'extrémité 3' et 5' du génome et de l'anti-génome. Puis, j'ai caractérisé l'influence du domaine méthyltransférase sur l'activité polymérase de la protéine NS5. J'ai développé un système d'études mécanistiques en utilisant des techniques biochimiques de cinétique pré-stationnaire pour la protéine NS5, et obtenu des paramètres cinétiques et thermodynamiques de cette protéine envers ses substrats. Avec ce même système, j'ai pu tester des activités de la polymérase NS5 avec des ARN coiffés et triphosphates de différente longueur, mimant les séquences à l'extrémité 5' du génome du virus de la dengue. L'activité polymérase de NS5 est influencée par la présence de la coiffe de l'ARN, ce qui m'a permis de proposer une distance physique correspondant à environ 13 nucléotides entre les sites actifs domaines méthyltransférase et polymérase. Mes travaux ouvrent la voie à la détermination de la structure 3D de NS5 avec ses ARN et des nucléotides 5'-triphosphate.Elucider son mécanisme d'action, c'est être capable d'inhiber son action et donc de pouvoir proposer des molécules capables d'arrêter la prolifération virale lors d'une infection. / Dengue virus causes dengue fever, which may evolve towards life-threatening hemorrhagic fever. My research projectfocuses on dengue replication, and more precisely on the mechanism of NS5 at the molecular/atomic level. NS5 is a bifunctionalenzyme containing two domains: 1) a methyltransferase domain essential for translation of viral proteins, 2) apolymerase domain synthesizing the viral RNA genome. First, we demonstrated the main role of the polymerase in theconservation of 5' and 3' ends of dengue genome and anti-genome RNAs. Next, I showed the influence of themethyltransferase domain on the activity of the polymerase domain. I also developed a system allowing mechanistic studiesusing pre-steady state kinetics to characterize NS5 in depth. I have made use of this system to determine the catalyticparameters of NS5 towards its substrates. Using the same pre-steady state system, I was able to test the polymerase activityof NS5 with capped and uncapped 5'-triphosphate RNAs of different lengths corresponding to the 5'-end of the dengue RNAgenome. The polymerase activity of NS5 is significantly affected by the presence of the 5'-cap, which allowed me to designan experimental set-up pointing to a minimal physical distance of around 13 nucleotides between the methyltransferase andpolymerase active sites. My work will be useful to characterize the biophysics of NS5 in complex with its RNA and NTPsubstrates, and then to determine the crystal structure of such complex at play during viral RNA synthesis. Knowing thedetailed NS5 mechanism paves the way to inhibit its action and thus design drugs aiming at stopping a viral infection.